至少包含氢分子的液体/气体在制备抗原发性肝癌药物中的应用的制作方法

本发明涉及用于抗肝癌的药，其包含氢分子作为活性成分。

背景技术：

肝细胞癌(简称肝癌)是全球发病率排名第二的癌症，每年有大约6000,000人死于肝癌，尤其在中国等亚洲国家，肝癌的流行情况更为严重。在我国每年死于肝癌的人数高达11万之多。肝癌的发生与多种危险因素有关，包括HBV，HCV病毒感染，酒精摄入，黄曲霉毒素污染等，具有很高的致死率。作为一种恶性程度极高的肿瘤，肝癌常伴有浸润和转移。

目前肝癌的治疗手段包括外科治疗、肝动脉/门静脉化疗栓塞术和放射治疗等。外科治疗包括部分肝切除和肝移植，是获得较长期生存的最重要的治疗手段，但是由于肝癌发生和发展的复杂性和手术后肝脏再生滋生的炎症微环境，单纯的手术切除复发率很高。由于肝癌发病的特点,临床上发现的病例大多不能进行肝脏外科治疗，肝动脉/门静脉化疗栓塞是应用最多的治疗技术，但是化疗药物敏感性差、毒性大，治疗后易导致肝癌耐药和复发。系统化疗具有有限的抗瘤活性，并缺乏总生存获益以及化疗的毒副反应。此外，肝癌的治疗手段还有放疗、靶向治疗、基因治疗、免疫治疗和中医、中药治疗等。虽然基因治疗的前景光明，但由于其靶向性差和安全性问题限制了临床应用。总之，肝癌的临床治疗仍是一个需要研究和探索的难题，目前当务之急是找到疗效更佳、特异性更好的药物。

氢分子是自然界中最小的分子，长期以来，生物学家误认为它是生理学上的惰性气体。2007年日本学者Ohsawa等(Ohsawa et al.,2007)在Nature Medicine的报道发现，呼吸2％的氢气即可有效治疗脑缺血再灌注损伤，并提出了氢可以通过选择性清除羟自由基和亚硝酸阴离子来发挥其抗氧化作用。该研究迅速引起广泛关注，并掀起了氢分子医学研究的热潮。研究表明，氢不仅具有抗氧化作用，还具有抗炎症和抗凋亡作用，对于缺血再灌注损伤、电离辐射损伤、炎症性疾病、代谢性疾病等方面均有很好的防治作用。同时，作为一种新型抗氧化剂，氢还具有无毒、无残留、制备简单、 给药方便等诸多优点，具有很好的临床应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的是将至少包含氢分子的液体/气体用在抗肝癌的药物的制备中，从而提高药物的抗肝癌效果。其特点在于所制备的抗肝癌的药中包含氢分子作为活性成分。

本发明的发明人首次发现，将含有氢分子的液态或气态的组合物用在抗肝癌药的制备中，可以抑制肝癌细胞的生长、浸润和迁移，并且可以增强其效果。在下文中详细描述了本发明。

(1)一种至少包含氢分子的液体在制备抗肝癌的药物中的应用。

(2)(1)所述的用途，其特征在于，其中至少包含氢分子的液体是水溶液，该水溶液的溶剂是纯水、去离子水、蒸馏水、生理盐水或有机酸的酸性水溶液等。

(3)(1)或(2)所述的用途，其特征在于，至少包含氢分子的液体包含0.1ppm以上即0.05mM以上的氢分子。

(4)(1)-(3)任意一项所述的用途，其特征在于，至少包含氢分子的液体还包含氧分子。

(5)(1)-(4)任意一项所述的用途，其特征在于，可以抗肝癌的药物为口服药、注射药或洗浴用药。

(6)一种至少包含氢分子的气体在制备抗肝癌的药物中的用途。

(7)(6)所述的用途，其特征在于，其至少含有氢分子的气体是氢气和氧气的混合物。

(8)(6)或(7)所述的用途，其特征在于，至少包含氢分子的气体是氢气、氧气和惰性气体的混合物。

(9)(6)-(8)任意一项所述的用途，其特征在于，至少包含氢分子的气体是氢气和空气的气体混合物。

(10)(6)-(9)中任何一项所述的用途，其特征在于，其包含体积浓度为25％-35％的氢气。

附图说明

图1显示给予氢处理对大鼠肝脏肿瘤体积的影响。

图2显示氢处理对大鼠肝癌细胞生长速率的影响。

图3显示氢处理对大鼠肝癌细胞浸润能力的影响。

图4显示氢处理对大鼠肝癌细胞迁移能力的影响。

具体实施方式

虽然下文将参考以下实施例更详细地描述本发明，但本发明的技术范围不仅限于此，可在不脱离本发明主题和范围的情况下以同等方式对本发明进行各种改变和修饰。

氢浓度的测定

用氢电极(Unisense A/S,Aarhus,Denmark)测定溶液中的氢浓度，通过气体层析测定氢气浓度(Teramecs Co.,Kyoto)。

富氢生理盐水(或富氢细胞培养液)的制备

制备饱和氢水时，将镁棒(24353，株式会社FDR·フレンディア)120℃高压蒸汽灭菌后，放入100ml培养基中，密闭48小时，获得浓度为0.8mM的含饱和氢的生理盐水(或细胞培养液)，溶液中的氢浓度可以用“氢浓度的测定”的方法测定。

将氢气给予裸鼠

为了让每只裸鼠都连续吸入氢气，通过泵的递送产生氢气体积浓度为30％的氢气和空气的混合气体，将所得气体送入导管连接紧密的塑料盒内。将含氢气的气体混合体以每分钟2-5升的速率供应其中。用上文中“氢浓度的测定”方法测定氢气浓度。将大鼠的笼子置于所述容器内，以便将氢气稳定地给予大鼠。为保证适宜的温度和湿度，塑料盒用毛巾包裹，并与含有干燥剂和CO₂吸附剂的盒子相连。给氢组裸鼠每天三次，每次呼吸半小时。

实施例1：给予氢气对裸鼠肝癌具有很好的抑制作用

将成瘤后的雌性BALB/c裸鼠(16-18g)分为2组，每组8只大鼠，其中第一组为对 照组，第二组为氢处理组，即通过呼吸的方法给予含氢空气。

首先，建立裸鼠肝癌模型，方法如下：

人肝癌细胞HuH7-T的准备：新复苏HuH7-T细胞，接种前再传代1次，24小时后更换1次培养基，在细胞对数生长期时，以0.25％胰酶消化，收集消化液离心后去除上清液，Hanks液洗涤2次后制成细胞悬液，调节细胞浓度为1.5×10⁷/ml，置于37℃水浴中待接种。苔盘蓝排斥实验检测细胞活力>95％。

HuH7-T皮下接种：每只裸鼠注射0.2ml细胞悬液于右肩胛部皮下，注射后以小镊夹针孔片刻。裸鼠皮下肿瘤体积大于1mm³视为建模成功，将成功接种的裸鼠随机分组。

裸鼠接种后的给药处理：氢处理组将大鼠放入气密塑料盒内，按上述方法呼吸氢气，对照组常规饲养。每周测量两次体重和肿瘤长、短经，计算肿瘤体积(应用公式(a²×b)/2计算，其中a为肿瘤短径，b为肿瘤长径)。给药六周后将裸鼠处死，从皮下将肿瘤小心取出并测量肿瘤体积。

结果如图1所示，与对照组相比，氢处理组的肿瘤体积明显缩小，说明这种治疗方法对肝癌有很好的抑制作用。

实施例2：富氢细胞培养液可以抑制大鼠肝癌细胞HepG2、HuH7-E、HuH7-T的生长、浸润和迁移

HepG2、HuH7-E、HuH7-T细胞分为两组，第一组为对照组，即用普通培养液进行细胞培养；第二组为氢处理组，即用富氢细胞培养液进行细胞培养。细胞培养24h后进行体外实验检测细胞功能的改变。

CCK8法检测细胞生长：将上述三组细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，以1×10⁴cells/100μl/well的细胞密度接种HepG2、HuH7-E、HuH7-T细胞于96孔板中，每种细胞接种60孔。接种后24h分组换液，以换液后第6、24、48、72小时为4个观察时间点，共铺4块板，于37℃，5％CO₂孵箱中培养。细胞分组换液后立即取出其中一块板，每孔加入CCK8 10μl，于37℃，5％CO₂孵箱中培养1小时。用酶标仪测定波长450nm处各孔的吸光值(OD值)。以后在6h、24h、48h、72h时各取出一块板按照上述步骤进行。最后以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。结果如图2所示，与对照组相比，氢处理组HuH7-E、HuH7-T、HepG2细胞的生长速率明显降低。

Transwell法检测细胞浸润：将Matrigel溶于无血清细胞培养液中，终浓度为0.5mg/ml，将50μl稀释后的Matrigel胶加到24孔板的insert中，37℃干燥1-2h后备用。将上述细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，按照5×10⁴cells/600μl/well的密度将细胞接种于24孔板的insert中，每组接种3孔，24孔板下层中加入350μl放入细胞培养基。经细胞培养48小时，并用结晶紫染色后计数穿过膜的细胞数。结果如图3所示，与对照组相比，氢处理组的穿膜细胞数明显减少，说明氢处理对HuH7-E、HuH7-T、HepG2细胞的浸润能力具有明显的抑制作用。

划痕实验检测细胞迁移：将HepG2细胞用0.25％的胰蛋白酶消化后，按照2×10⁵cells/500μl/well的密度将细胞接种于24孔板中，每组接种3孔。于37℃，5％CO₂孵箱中培养24小时。待细胞融合后，用无菌的10μl枪头在well底中央划垂直的“一”字线,宽度约200μm。用细胞培养液冲洗若干次,以洗去划痕处的细胞，再换上新鲜培养液于37℃，5％CO₂孵箱中培养。倒置显微镜下观察，分别记录0、8、24小时的划痕创面愈合情况。细胞迁移能力以迁移率表示，细胞迁移率(％)＝(原划痕宽度-现划痕宽度)/原划痕宽度×100％。结果如图4和表1所示，与对照组相比，氢处理组的细胞迁移率明显降低，说明氢处理对HepG2细胞的迁移能力具有明显的抑制作用。

表1氢处理对HepG2细胞迁移能力的影响