一种玛卡提取物、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物有效成分提取领域，具体涉及一种玛卡提取物、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]玛卡主要出产于南美洲安第斯山脉和中国云南丽江，是一种十字花科植物。叶子椭圆，根茎形似小圆萝卜，可食用，是一种纯天然食品，营养成份丰富。玛咖中含有丰富的蛋白质、矿物质、糖类、氨基酸等营养成分和生物碱、芥子油苷等功效成分。近年来，越来越多的研究者关注到玛卡对于提高人体免疫力、平衡人体荷尔蒙分泌及促进生育能力的效用，但对于其起效机理知之甚少。目前玛卡市场非常火爆，玛卡产品有几个加工的形式，如微粉(粉末，片剂)，冷冻干燥，水醇提取物等;但现有技术简单粗矿，提取效率低下、提取不完全，产品营养成分流失严重，杂质较多，副作用大，人体吸收率低，难以发挥玛卡的多种功效。
【发明内容】
[0003]有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种玛卡提取物的制备方法及由该制备方法得到的玛卡提取物，并提供了其在制备提高免疫力药物、促进生育能力药物中的应用。
[0004]本发明通过以下技术方案实现:
[0005]本发明一方面提供了一种玛卡提取物的制备方法，包括以下步骤:
[0006]步骤1、将玛卡洗净、沥干并制成粉末；
[0007]步骤2、加入甲醇溶液和浓盐酸，超声得到粗提液；
[0008]步骤3、将步骤2中的粗提液浓缩至无醇味(无甲醇)，得到浓缩粗提液；
[0009]步骤4、将步骤3中的浓缩粗提液用大孔树脂吸附；
[0010]步骤5、按水一柱体积、20 %乙醇三柱体积、50 %乙醇四柱体积、75 %乙醇三柱体积、95 %乙醇一柱体积的顺序洗脱大孔树脂，收集洗脱液；
[0011 ] 步骤6、将由20 %乙醇第三柱体积和50 %乙醇第一至第三柱体积得到的洗脱液进行超低温冷冻干燥处理，得到玛卡提取物。
[0012]进一步地，步骤2中甲醇溶液的浓度为40%-70%。
[0013]进一步地，步骤2中浓盐酸加入的比例为0.5%-2%。
[0014]进一步地，步骤2中甲醇溶液加入的量为I克玛卡对应4毫升甲醇溶液。
[0015]进一步地，步骤2中甲醇溶液、水和浓盐酸分成两次加入，并分别进行超声提取，时间均为40-60分钟。
[0016]进一步地，步骤3中使用旋转蒸发仪(减压蒸馏)进行浓缩，浓缩温度为40-60°C，浓缩粗提液浓缩至原体积的I /4。
[0017]进一步地，步骤4中的大孔树脂为DlOl树脂。
[0018]进一步地，步骤4中大孔树脂的用量为与浓缩粗液体等体积。
[0019]本发明另一方面提供了根据上述制备方法得到的玛卡提取物，及其在制备提高免疫力药物、促进生育能力药物中的应用。
[0020]本发明提供了一种玛卡有效成分精提取的方式，所得提取物有显著的增强能量代谢能力。且本发明首次采取的加酸显色法提纯过柱工艺，对于中草药无色或浅色提取液的分离提供了一种新的高效思路。本发明工艺简单，价格低廉，适合大规模工艺生产。
[0021]以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
【附图说明】
[0022]图1示出了本发明较优实施例中的工艺流程简图；
[0023]图2示出了本发明较优实施例中制备的玛卡提取物对细胞的CCK-8细胞存活率实验结果；
[0024]图3示出了本发明较优实施例中制备的玛卡提取物对细胞的ATP含量检测结果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。
[0026]实施例1
[0027]1、制备玛卡提取物
[0028]将200克玛卡样品洗净、沥干并研磨制成粉末;将70 %甲醇和浓盐酸以99:1比例配置提取液，其中盐酸能使玛卡中色素显红色，从而有利于下一步的层析;将上述提取液分两次加入，第一次加入500毫升，第二次加入300毫升，每次加入后用超声(300w，SB5200D)提取约I小时，得到粗提液;将粗提液通过旋转蒸发浓缩至无醇味(约200毫升)，得到浓缩粗提液;称取200克DlOl大孔树脂(柱体积约200毫升)，将步骤3中得到的浓缩粗提液过柱，吸附约2小时；按水一柱体积、20 %乙醇三柱体积、50 %乙醇四柱体积、75 %乙醇三柱体积、95 %乙醇一柱体积的顺序洗脱上述大孔树脂，得到不同组分的层析液；以100毫升/瓶收集，并使用旋转蒸发仪减压蒸馏至无醇味(每10ml浓缩至1ml);以10ml层析液为单位，于是得到水-1，水-2，20%乙醇-1，20%乙醇-2，20%乙醇-3，20%乙醇-4，20%乙醇-5，20%乙醇-6，
50%乙醇-1，50 %乙醇-2，50 %乙醇-3，50 %乙醇-4，50 %乙醇_5，50 %乙醇_6，50 %乙醇-7，50%乙醇-8，75%乙醇-1，75%乙醇-2，75%乙醇-3，75%乙醇-4，75%乙醇-5，75%乙醇-6，95%乙醇-1，95%乙醇-2共24个样本。
[0029]2、CCK_8测定细胞存活率
[0030]CCK-8(Cell Counting Kit_8)试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析，其基本原理为:该试剂中含有WST-8(化学名:2_(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4_ 二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鑰硫酸二甲酯的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。用DMEM配置成含马血清9 %，牛血清6 %，双抗0.5 %的培养液，在96孔板内以每孔1.5万个pc 12细胞接种，在细胞培养箱中孵育24小时后加入上述24个样本的玛卡提取物，玛卡提取物与培养液比例为1:9;72小时后检测细胞存活率。检测结果表明，玛卡提取物毒性小，尤其是由20%乙醇第三柱体积(对应于样本20 %乙醇-5，20 %乙醇-6)和50 %乙醇第一至第三柱体积得到的除醇浓缩后的提取物(对应于样本50%乙醇-1，50%乙醇-2，50%乙醇-3，50%乙醇-4，50%乙醇-5，50%乙醇-6)，其不仅无毒性，且具有一定的促进细胞生长的作用，实验结果如图2所示(c表示只加培养液的对照组)。
[0031 ] 3、ATP含量测定和Bradford蛋白质测定
[0032]用DMEM配置成含马血清9%，牛血清6 %，双抗0.5 %的培养液，在24孔板内以每孔10万个pcl2细胞接种;在细胞培养箱中孵育24小时后加入上述24个样本的玛卡提取物，玛卡提取物与培养液的体积比为1:9;在细胞培养箱中孵育24小时后检测ATP和蛋白质浓度。以罗氏(Roche)ATP检测试剂盒和BCA试剂，利用酶标仪检测样品的吸光度值，绘制标准曲线并计算出样品中ATP增加的量。检测结果表明，经玛卡提取物处理24小时后的细胞其ATP含量超空白组I倍以上，均高于其他增加ATP的药物，尤其是由20%乙醇第三柱体积(对应于样本20 %乙醇-5，20 %乙醇-6)和50 %乙醇第一至第三柱体积得到的除醇浓缩后的提取物(对应于样本50 %乙醇-1，50 %乙醇-2，50 %乙醇-3，50 %乙醇-4，50 %乙醇-5，50 %乙醇_6)，使细胞的ATP含量增加近3倍，远高于市场上增加能量代谢药物，实验结果如图3所示(c表示只加培养液的对照组)。该提取物有望应用在制备提高免疫力药物、促进生育能力药物中。
[0033]根据实施例1可知，最有药用价值的玛卡提取物可由20%乙醇第三柱体积和50%乙醇第一至第三柱体积的洗脱液制备得到。以下示出的是较优的玛卡提取物的制备方法。
[0034]实施例2
[0035]玛卡提取物的制备方法包括以下步骤:
[0036]步骤1、将200克玛卡洗净、沥干并制成粉末；
[0037]步骤2、将40%甲醇和浓盐酸以98: 2比例配置提取液，将该提取液分两次加入，第一次加入500毫升，第二次加入500毫升，每次加入后用超声提取约40分钟，得到粗提液；
[0038]步骤3、将步骤2中的粗提液通过旋转蒸发浓缩至无醇味(约200毫升)，得到浓缩粗提液；
[0039]步骤4、称取200克DlOl大孔树脂(柱体积约200毫升)，将步骤3中得到的浓缩粗提液过柱，吸附约2小时；
[0040]步骤5、按水一柱体积、20 %乙醇三柱体积、50 %乙醇四柱体积、75 %乙醇三柱体积、95 %乙醇一柱体积的顺序洗脱上述大孔树脂，收集洗脱液；
[0041 ] 步骤6、将由20%乙醇第三柱体积和50%乙醇第一至第三柱体积得到的洗脱液进行超低温冷冻干燥处理，得到玛卡提取物。
[0042]实施例3
[0043]玛卡提取物的制备方法包括以下步骤:
[0044]步骤1、将100克玛卡洗净、沥干并制成粉末；
[0045]步骤2、将50%甲醇和浓盐酸以99.5:0.5比例配置提取液，将该提取液分两次加入，第一次加入250毫升，第二次加入250毫升，每次加入后用超声提取约50分钟，得到粗提液；
[0046]步骤3、将步骤2中的粗提液通过旋转蒸发浓缩至无醇味(约100毫升)，得到浓缩粗提液；
[0047]步骤4、称取100克DlOl大孔树脂(柱体积约100毫升)，将步骤3中得到的浓缩粗提液过柱，吸附约2小时；
[0048]步骤5、按水一柱体积、20 %乙醇三柱体积、50 %乙醇四柱体积、75 %乙醇三柱体积、95 %乙醇一柱体积的顺序洗脱上述大孔树脂，收集洗脱液；
[0049]步骤6、将由20%乙醇第三柱体积和50%乙醇第一至第三柱体积得到的洗脱液进行超低温冷冻干燥处理，得到玛卡提取物。
[0050]以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，提供了一种玛卡有效成分精提取的方式，所得提取物有显著的增强能量代谢能力。且本发明首次采取的加酸显色法提纯过柱工艺，对于中草药无色或浅色提取液的分离提供了一种新的高效思路。本发明工艺简单，价格低廉，适合大规模工艺生产。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
【主权项】
1.一种玛卡提取物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤: 步骤1、将玛卡洗净、沥干并制成粉末； 步骤2、加入甲醇溶液和浓盐酸，超声得到粗提液； 步骤3、将步骤2中的所述粗提液浓缩至无醇味，得到浓缩粗提液； 步骤4、将步骤3中的所述浓缩粗提液用大孔树脂吸附； 步骤5、按水一柱体积、20 %乙醇三柱体积、50 %乙醇四柱体积、75 %乙醇三柱体积、95 %乙醇一柱体积的顺序洗脱所述大孔树脂，收集洗脱液； 步骤6、将由20 %乙醇第三柱体积和50 %乙醇第一至第三柱体积得到的洗脱液进行超低温冷冻干燥处理，得到所述玛卡提取物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述甲醇溶液的浓度为40%-70%。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述浓盐酸加入的比例为0.5%-2%。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述甲醇溶液加入的量为I克玛卡对应4毫升甲醇溶液。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述甲醇溶液、水和浓盐酸分成两次加入，并分别进行超声提取，时间均为40-60分钟。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中使用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩温度为40-60 °C，所述浓缩粗提液浓缩至原体积的I/4。7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中的所述大孔树脂为DlOl树脂。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述大孔树脂的用量为与所述浓缩粗液体等体积。9.根据权利要求1-8中任一项所述的制备方法得到的玛卡提取物。10.根据权利要求9所述的玛卡提取物在制备提高免疫力药物、促进生育能力药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种玛卡提取物的制备方法，包括以下步骤：将玛卡洗净、沥干并制成粉末；加入甲醇溶液、水和浓盐酸，超声得到粗提液；将步骤2中的粗提液浓缩至无醇味，得到浓缩粗提液；将步骤3中的浓缩粗提液用大孔树脂吸附；按水一柱体积、20％乙醇三柱体积、50％乙醇四柱体积、75％乙醇三柱体积、95％乙醇一柱体积的顺序洗脱大孔树脂，收集洗脱液；将由20％乙醇第三柱体积和50％乙醇第一至第三柱体积得到的洗脱液进行超低温冷冻干燥处理，得到玛卡提取物。由上述方法制备的玛卡提取物对细胞ATP浓度增加效果明显，有效成分纯度高，该方法操作简单、成本低廉，适合大规模生产。
【IPC分类】A61K36/31, A61P15/08, A61P37/04
【公开号】CN105708879
【申请号】CN201610266314
【发明人】吕君蔚, 李 浩, 丁显廷, 姜慧
【申请人】上海交通大学