本发明涉及药物领域，更具体地涉及含唑来膦酸和白细胞介素2的药物组合，以及所述药物组合在耐药结核病治疗中的应用。
背景技术：
结核病是由结核分枝杆菌引起的严重危害人类健康的呼吸道传染病。结核病被我国列为重大传染病之一，我国是全球22个结核病高负担国家之一。世界卫生组织估计，目前中国结核病年发病人数约为100万，占全球发病人数的11％，位居全球第二位。同时，我国也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一，全球每年新发耐多药结核病例约44万，我国每年新发耐多药结核病例约10万(来自中国疾病控制中心发布的最新数据)，占全球的23％。结核病是中国农村因病致贫、因病返贫的主要疾病之一，严重制约我国经济和社会的发展。结核病的高发，不仅给患者家庭带来沉重的经济和精神负担，还直接影响着我国的社会稳定和经济持续发展。
耐药结核病，指的是结核病人体内的结核分枝杆菌对一种一线抗结核药物(即异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺以及链霉素)产生耐药。耐多药结核病则是指至少对异烟肼和利福平耐药。由于异烟肼和利福平对结核菌的杀伤作用最强，因此，耐多药结核病是一种更为严重的结核病耐药类型。根据世界卫生组织最新调查显示，在新病人中，100个结核病人中至少有1个为耐多药结核病人；而在复治病人中，100个结核病人中至少7个为耐多药结核病人。据我国第四次全国结核病流行病学调查显示，我国近1/3结核病人为耐药病人，1/10以上病人为耐多药结核。据此估计，我国每年新产生的耐多药结核病人将超过10万。
目前耐多药结核病的治疗非常困难，原因包括：(1)诊断复杂，目前普通结核病人，一般2～3天即可作出诊断；耐多药结核病诊断完全依赖实验室，需要2～3月。(2)治疗周期长，普通结核病人治疗周期一般为6月。耐多药结核病人治疗周期18～24月，甚至36月，是普通结核病人的3～6倍。(3)治疗成本高，耐多药结核病人治疗总费用将超过普通结核病人的200倍。而且，耐多药结核病人目前基本无药可用，几乎不可能被完全治愈。
目前结核病治疗中，主要依靠直接监督下的短期化疗方案，即异烟肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺4种药物联合治疗2个月，再使用异烟肼和利福平连续治疗4个月。这一方法至少需要6个月的疗程，治疗周期较长。抗痨药物在治疗的前几天能够杀死大部分活跃复制的细菌，然而生长缓慢的或休眠的结核杆菌将会长期存在。长时间大量的服用药物，将导致病人失去耐心，从而中断或缩短治疗。中断治疗将导致高复发率，残存的细菌将会对初始治疗的药物产生抗性，产生耐药菌株。
因此，本领域迫切需要开发新的治疗结核病，尤其是耐多药结核病的药物组合物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种含唑来膦酸和白细胞介素2的药物组合。
本发明的另一个目的在于提供所述药物组合在耐药结核病治疗中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种药物组合，所述的药物组合含有：
活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物；
活性成分(b)白细胞介素。
在另一优选例中，所述的白细胞介素包括il-2、il-33、il-15、和/或il-12。
在另一优选例中，所述的药物组合用于提高结核病治疗药物的治疗效果。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的比例(mg:mg)为1:0.01至1:0.0005，较佳地为1:0.001至1:0.005。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)和活性成分(b)的总含量为药物组合的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
在本发明的第二方面，提供了一种用于治疗结核病的药物组合物，所述的药物组合物含有：
活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物；
活性成分(b)白细胞介素；
活性成分(c)结核病治疗药物；以及
(d)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物为临床上治疗结核病的化学治疗药物。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物为化学治疗药物。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物包括卷曲霉素、莫西沙星、和乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、利福平、吡嗪酰胺、左氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、或其组合。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物是2-4种单方药物的组合。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物为卷曲霉素、莫西沙星、乙胺丁醇的组合
在另一优选例中，所述的结核病包括耐药结核病，较佳地为耐多药结核病。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)、活性成分(b)和活性成分(c)的比例(mg:mg:mg)为1:0.01:1000至1:0.0005:10，较佳地为1:0.001:500至1:0.005:50。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)、活性成分(b)和活性成分(c)的总含量为组合物的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为口服剂型、或注射剂。
在另一优选例中，所述的药物组合物还可含有其他药物活性成分，其中包括治疗结核病的活性成分。
在本发明的第三方面，提供了一种如本发明第一方面所述的药物组合的用途，所述的药物组合用于制备一制剂或一药盒，所述制剂或药盒用于(i)治疗肺结核，和/或(ii)提高结核病治疗药物对结核病患者治疗效果。
在另一优选例中，所述的制剂包括药物组合物。
在另一优选例中，所述制剂与结核病治疗药物同时施用或先后施用。
在另一优选例中，所述制剂的剂型包括口服制剂或注射剂。
在另一优选例中，所述的药盒如本发明第五方面所述。
在本发明的第四方面，提供了一种如本发明第二方面所述的药物组合物的用途，所述的药物组合物用于选自下组的一种或多种用途：
(i)用于制备治疗肺结核的药物，
(ii)用于制备诱导产生vγ2vδ2t细胞的药物，和/或
(iii)用于制备诱导产生抗结核效应因子的药物。
在另一优选例中，所述的抗结核效应因子选自下组：
伽马干扰素(ifn-γ)，肿瘤坏死因子(tnf-α)，穿孔素(perforin)、颗粒溶素(granulysin)、颗粒酶(granzyme)、或其组合。
在另一优选例中，所述的抗结核效应因子包括由vγ2vδ2t细胞、cd4、t细胞、和cd8t细胞产生的抗结核效应因子。
在另一优选例中，所述的治疗肺结核包括减轻肺结核造成的病理损伤，和降低肺部的细菌数目。
在本发明的第五方面，提供了一种药盒，所述药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)白细胞介素，或含有活性成分(b)的药物；以及
(iii)第三容器，以及装于该第三容器中的活性成分(c)结核病治疗药物，或含有活性成分(c)的药物；以及
(iv)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)、活性成分(b)和活性成分(c)从而治疗癌症的说明。
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器中的药物是含活性成分(a)的单方制剂以及含活性成分(b)的单方制剂。
在另一优选例中，所述的第三容器中的药物是含有活性成分(c)的复方制剂。
在另一优选例中，所述药物的剂型为口服剂型或注射剂。
在另一优选例中，所述药盒用于治疗结核病。
在另一优选例中，所述的活性成分(a)、活性成分(b)和活性成分(c)同时或先后施用。
在本发明的第六方面，提供了一种治疗结核病的方法，所述的方法包括步骤：
(i)给需要的哺乳动物施用活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物；活性成分(b)白细胞介素；和活性成分(c)结核病治疗药物。
在另一优选例中，所述的施用包括同时施用或先后施用。
在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人。
在另一优选例中，所述的唑来膦酸或其衍生物的施用剂量为1-10mg/次，较佳地2-6mg/次。
在另一优选例中，所述的白细胞介素施用剂量为0.8-2百万单位(0.8-2millioniu)，较佳地为1-1.5百万单位。
在另一优选例中，所述活性成分的施用频率为1次/天。
在另一优选例中，所述活性成分的施用时间为2-14天，较佳地3-7天，最佳地5天。
在另一优选例中，按活性成分的常规施用剂量和施用频率进行治疗。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了各实验组外周血淋巴细胞(pbmc)和肺泡灌洗液(bal)中vγ2vδ2t细胞的比例变化。其中，图1a显示了外周淋巴细胞(pbmc)中vγ2vδ2t细胞在耐多药结核分枝杆菌攻毒后第7天和第13天(即第一次治疗前后)占cd3+t细胞的比例。图1b显示了肺泡灌洗液(bal)中vγ2vδ2t细胞在第一次治疗前后占cd3+t细胞的比例。
图2显示了不同治疗时间点，在外周血中能够产生功能性效应因子(伽马干扰素(ifn-γ)，穿孔素(perforin)，肿瘤坏死因子(tnf-α))的vγ2vδ2t细胞的数目。
图3显示了不同治疗时间点，在外周血中能够产生功能性效应因子(伽马干扰素(ifn-γ)，穿孔素(perforin)，肿瘤坏死因子(tnf-α))的cd4t细胞和cd8t细胞的数目。其中，图3a显示了cd4t细胞的数目，图3b显示了cd8t细胞的数目。
图4显示了各实验组食蟹猴肺部匀浆中的菌落数目。
图5显示了各组食蟹猴肺部病理得分。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现唑来膦酸与白介素2联合应用可明显扩增vγ2vδ2t细胞，扩增后的vγ2vδ2t细胞能有效杀灭胞内寄生的结核分枝杆菌。实验表明，抗结核化学药物和免疫治疗药物(唑来膦酸/白介素2，zol+il-2)能够联合用于治疗耐多药结核病，治疗效果显著。
术语
唑来膦酸
唑来膦酸(zoledronicacid，zol)是一种特异性地作用于骨的二磷酸化合物，它能抑制因破骨活性增加而导致的骨吸收。唑来膦酸的分子量为290.11，化学式为c5h10n2o7p2·h2o，结构式如下：
白介素2
白介素2(interleukin2,il-2)是机体在免疫应答过程中由t细胞释放的一种淋巴因子，该因子在白细胞(如巨噬细胞，单核细胞，淋巴细胞)等之间发挥作用，是机体免疫应答，特别是细胞免疫应答过程中的核心物质。具有抗肿瘤，抗病毒和增强机体免疫力等功能。
结核病治疗药物
如本文所用，所述的“结核病治疗药物”是指临床上常用的用于结核病治疗的药物，尤其是化学治疗药物。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物包括但不限于：
卷曲霉素、莫西沙星、乙胺丁醇、异烟肼、链霉素、利福平、吡嗪酰胺、左氧氟沙星、阿米卡星、卡那霉素、丙硫异烟胺、对氨基水杨酸、环丝氨酸、或其组合。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物是2-4种单方药物的组合。
在另一优选例中，所述的结核病治疗药物为卷曲霉素、莫西沙星、乙胺丁醇的组合
针对耐药结核病进行治疗时，应用于本发明的药物组合物和药盒的结核病治疗药物应当选择治疗对象对其没有耐药性的种类。
vγ2vδ2t细胞
γδt细胞是一种既能杀伤癌细胞，肿瘤干细胞，又能识别癌抗原的免疫细胞，杀伤性较强。vγ2vδ2t细胞占人体内循环γδt细胞的60-95％，是唯一能够识别结核磷酸抗原的γδt细胞，只存在于人和非人灵长类，其它动物不存在这种抗原特异的γδt细胞。
耐药结核菌
耐药结核病，指的是结核病人体内的结核分枝杆菌对一种一线抗结核药物(即异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺以及链霉素)产生耐药。耐多药结核病则是指至少对异烟肼和利福平耐药。
结核菌攻毒
将耐多药结核分枝杆菌1ml溶液包含500cfu，在动物麻醉后，采用支气管镜引导下的攻毒方式，导入动物右肺下叶感染动物。
复方药物组合物和药盒
本发明提供了含有活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物；(b)白细胞介素；(c)结核病治疗药物；以及(d)药学上可接受的载体的复方药物组合物。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。一种优选的剂型是注射制剂。此外，本发明药物组合物还可与其他治疗剂一起使用。
本发明还提供了一种可用于治疗癌症的药盒，该药盒含有：
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物，或含有活性成分(a)的药物；
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)白细胞介素，或含有活性成分(b)的药物；以及
(iii)第三容器，以及装于该第三容器中的活性成分(c)结核病治疗药物，或含有活性成分(c)的药物；以及
(iv)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)、活性成分(b)和活性成分(c)从而治疗癌症的说明。
在本发明的所述复方药物组合物或药盒中，在另一优选例中，所述的活性成分(a)、活性成分(b)和活性成分(c)的比例(mg:mg:mg)为1:0.01:1000至1:0.0005:10，较佳地为1:0.001:500至1:0.005:50。
本发明的药物组合物和药盒适用于治疗结核病，较佳地用于治疗耐药结核病，更佳地用于治疗耐多药结核病。
本发明制剂可以每天服用三次或四次，或者以缓释方式每日服用一次。优选的方式是每天服药一次，因为这样便于病人坚持，从而显著提高病人服药的顺应性。
服用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量应低于(或少数病例等于或略大于)各个单药的每天常用剂量，当然，所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而有所变化。
治疗方法
本发明还提供了用本发明的三种活性成分或相应的药物对结核病进行治疗的方法，它包括给哺乳动物施用有效量的活性成分(a)唑来膦酸或其衍生物；(b)白细胞介素；(c)结核病治疗药物，或者施用含有所述活性成分(a)、(b)和(c)的药物组合物。
当本发明的各活性成分被用于上述用途时，可(分别)与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。
本发明的各活性成分或药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、肌内给药或静脉内给药。
从易于给药的立场看，优选的药物组合物是液态组合物，尤其是注射剂。
本发明的主要优点包括：
(a)唑来膦酸、白介素2和抗结核化学药物联用可明显扩增vγ2vδ2t细胞。
(b)唑来膦酸、白介素2和抗结核化学药物联用抗结核效应因子可以刺激产生更多的抗结核效应因子。
(c)唑来膦酸、白介素2和抗结核化学药物联用可以治疗耐多药结核病。
(d)唑来膦酸和白介素2的药物组合可提高临床结核病治疗药物对结核病患者治疗效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
通用材料和方法
1.耐多药结核病(xdr-tb)猕猴模型
实验动物：采用猕猴(食蟹猴cynomolgusmacaque)，年龄4-6岁左右，体重3-5公斤之间。实验共设4组，每组6只健康猕猴，共24只。
第一组：耐多药结核病动物化学药物治疗组。
第二组：耐多药结核病动物免疫治疗组与化学药物联合治疗组。
第三组：耐多药结核病动物白介素2(il-2)与化学药物联合治疗组。
第四组：耐多药结核病动物生理盐水对照组。
动物麻醉后，采用支气管镜引导下的攻毒方式，导入动物右肺下叶1ml耐多药结核分枝杆菌感染动物。
2.耐多药结核分枝杆菌
耐多药结核分枝杆菌为武汉市结核病防治所分离的临床菌株m.tb-v79，该菌株对异烟肼、利福平、氧氟沙星及链霉素的耐受性。使用c57bl/c小鼠10只，雌性，6-8周龄，尾静脉注射v7912×107cfu/只，测定小鼠半数死亡时间(st50)。st50＝22天。
3.实验用药物
化学药物治疗组合为：卷曲霉素(cm.)、莫西沙星(mfx.)、乙胺丁醇(e)。
免疫治疗药物：唑来膦酸(zoledronic)，白细胞介素2(il-2)。
4.治疗方案
一个治疗周期为5天，治疗时间点为5月7日-11日，5月13日-17日，7月24日-28日，7月30日-8月3日，9月4日-8日，9月24日-29日。
化学药物治疗：卷曲霉素cm(肌肉注射)+莫西沙星mfx(片剂)+对乙胺丁醇e(口服)。口服药物(mfx、e)采用胃管注射，cm采用肌肉注射。口服药物分别在每个治疗周期单独使用一次，而cm注射则在每个治疗周期内连续注射5天，每天一次。
免疫治疗方案：静脉注射(intravenous)，唑来膦酸(1mg/只)(人体4mg/次)(每次注射时间不能少于15分钟)；该药不能与其他药物联合注射。
每个治疗周期唑来膦酸注射1次/5天。
注射唑来膦酸后，同时皮下注射(subcutaneous)一支1.2百万单位重组人源il-2(1-1.2millioniu)，白介素连续注射5天，每天1支。
白介素2治疗方案：每次皮下注射(subcutaneous)一支1.2百万单位重组人源il-2(1-1.2millioniuil-2)，白介素连续注射5天。
生理盐水对照组：注射生理盐水2ml。
5.实验周期
2014年5月1日进行实验动物的耐多药结核菌攻毒实验；2015年10月12日进行动物的解剖实验。期间进行多次免疫学实验。
实施例1
免疫治疗能够在体内有效激起vγ2vδ2t细胞的扩增
为了验证唑来膦酸和白介素-2(zol+il-2)能否在体内激起vγ2vδ2t细胞的扩增，分别在第一次免疫治疗前和治疗后，采集了实验动物的外周血和肺泡灌洗液。通过流式细胞染色的方式，分析了在外周血淋巴细胞(pbmc)和肺泡灌洗液(bal)中vγ2vδ2t细胞的比例变化。
pbmc分析结果如图1a所示，治疗前(攻毒后第七天)各组中vγ2vδ2t细胞在pbmc中的比较基本一样。经过第一次治疗后(攻毒后第十三天)，第二组(zol+il-2和化学药物联合治疗组)中vγ2vδ2t细胞占cd3+t细胞的比例最高，显著高于其他组。
bal分析结果如图1b所示，肺泡灌洗液(bal)中vγ2vδ2t细胞占cd3+t细胞的比例变化与pbmc中趋势一致。
上述结果说明，免疫治疗药物zol+il-2能够引起vγ2vδ2t细胞在体内的显著扩增。
实施例2
免疫治疗能够促进vγ2vδ2t细胞产生更多的抗结核效应因子
为了检测扩增后的vγ2vδ2t细胞的抗结核免疫活性，分析了各实验组治疗过程中能够产生抗结核效应因子(伽马干扰素(ifn-γ)，肿瘤坏死因子(tnf-α)，穿孔素(perforin))的vγ2vδ2t细胞的数目变化。
结果如图2所示，在第二组(免疫治疗组，zol+il-2)(该组为化学治疗药物和免疫药物的合用组)动物的外周血中，具有更多的能够产生伽马干扰素(ifn-γ)，穿孔素(perforin)，肿瘤坏死因子(tnf-α)的vγ2vδ2t细胞，尤其是在结核菌攻毒后第60天以后，第二组动物中产生功能性细胞因子的vγ2vδ2t细胞显著高于其他组。
实施例3
免疫治疗也能够促进cd4、cd8t细胞产生更多的抗结核效应因子
为了进一步研究各实验组的抗结核效果，检测了各实验组外周血中cd4t细胞和cd8t细胞的数量。
结果如图3所示，在第二组(免疫治疗组，zol+il-2)动物的外周血中，具有更多的能够产生伽马干扰素(ifn-γ)，穿孔素(perforin)，肿瘤坏死因子(tnf-α)的cd4t细胞(图3a)和cd8t细胞(图3b)。该结果说明，免疫治疗zol+il-2不仅能够特异性活化vγ2vδ2t细胞，而且能够广泛刺激其它t细胞产生功能性细胞因子。
实施例4
免疫治疗能够有效降低实验动物肺部的菌落数目
实验结束时，我们进行了动物尸解。对实验动物肺部组织匀浆进行了培养和菌落计数。
结果如图4所示，在第二组(免疫治疗组，zol+il-2)实验动物的肺部菌落数目最低，显著低于其他各组。该结果说明，免疫治疗能够比单纯化学药物治疗能够更加有效的降低宿主体内的细菌数目，即免疫治疗的作用效果优于单纯化学药物治疗效果。
实施例5
免疫治疗能够减轻实验动物肺部由结核病造成的病理损伤
结核菌感染会造成宿主的感染部位的病理损伤，而且病理损伤程度与结核病的发展进程相关。为了评价各实验治疗组的作用效果，我们比较了动物解剖后的肺部病理损伤程度，并按照标注对损伤程度进行了量化。病理得分数值越高说明其病理损伤越重。
结果如图5所示，在免疫治疗组(第二组)动物的病理得分最低，即其病理损伤程度最低，显著低于单纯化学药物治疗组(第一组)。该实验结果说明免疫治疗能够有效减轻宿主的肺部病理损伤，其治疗效果优于单纯化学药物治疗组。
上述实施例的结果表明，在耐多药结核病模型中，免疫治疗药物(唑来膦酸+il-2)和化学药物联合治疗是有效的治疗方案。该治疗方案在开始治疗初期就能够显著增加食蟹猴体内vγ2vδ2t细胞的扩增，并产生功能性细胞因子；免疫治疗和化学药物联合治疗组中其他类型t细胞如cd4，cd8阳性t细胞也能够产生更多的抗结核功能性细胞因子。动物解剖结果表明，唑来膦酸组合治疗组动物的病理变化程度最轻，优于其他治疗和对照组；菌落计数结果表明第二组和第三组的肺部菌落数最少，显著低于其他组，说明这两组治疗方案杀菌效果最显著。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。