本发明涉及一种医药药保健食品领域，具体涉及用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液及其制备方法。
背景技术：
：免疫力是指机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定性的能力。随着社会的发展，人们的竞争压力越来越大、心里焦虑、身体过度劳累、锻炼不够等造成免疫力低下的诱因越来越普遍，而且随着人口老龄化的进程，人群中免疫力低下者越来越多。睡眠是人类最重要和最基本的生理活动，占人生的三分之一的时间。足够和高质量的睡眠是人类必须的。随着现代生活、学习、工作节奏的加快，大多数人面临着巨大的压力，精神压力长时间积累，大脑超负荷运转，易导致脑疲劳，体力透支，进一步表现为失眠、抑郁、焦虑、精神衰弱等疾病。失眠已成为继头疼之后神经科门诊的第二大疾病。免疫力低下者，睡眠状况不佳者常与“亚健康”状态联系在一起。“亚健康”状态是指无器质性病变的一些功能性改变，介于健康与疾病之间的过度状态。世界卫生组织一项研究表明：睡眠病症在世界上是一个没有得到充分重视和良好解决的公共卫生问题，全球约27％的人遭受睡眠困扰。中华医学会提供的材料表明，中国约有3亿成年人患有睡眠障碍，主要分布在中国经济相对发达的地区，然而这方面的问题一直没有引起足够的重视。英国睡眠障碍协会调查显示：美国每年45％的车祸以及55％的工伤事故都是由于睡眠疾病造成的。全球每天大约有3000人死于睡眠疾病。45-54岁人群失眠率开始上升，75-92岁最高，女性高达60％，男性为30％。中国睡眠研究会2003年对我国500万个家庭进行了睡眠健康调查，结果显示我国城市居民中有38.2％的人存在着不同程度的失眠症状，有相当多的人甚至常年失眠。针对改善睡眠研发的保健食品逐步受到人们的青睐。技术实现要素：本发明提供一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它不仅吸收效果好、利用度高，而且能增强免疫力、改善睡眠。本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它主要由以下组分按照以下重量份配制而成：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉45-55份、酸枣仁45-55份、茯苓45-55份、精氨酸9-12份、低聚异麦芽糖45-55份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它主要由以下组分按照以下重量份配制而成：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉50份、酸枣仁50份、茯苓50份、精氨酸11.2份、低聚异麦芽糖50份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它主要由以下组分按照以下重量份配制而成：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉45份、酸枣仁45份、茯苓45份、精氨酸10份、低聚异麦芽糖45份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)先将粉碎后的酸枣仁和茯苓片及蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉搅拌均匀，然后投入煎锅中，加入投入量8倍以上的的纯化水，浸泡30分钟以上，之后用常压100℃煎煮1.5-2.5小时，煎煮1次以上，将煎煮液移入配料罐中；(2)称取精氨酸及低聚异麦芽糖，并将它们投入配料罐中，然后补充纯化水至生产灌装需要量，之后200-400转/分钟搅拌30分钟以上，使精氨酸及低聚异麦芽糖溶解充分；(3)然后用20％食用级的碳酸钠调整上述混匀后的溶液的PH值为6.8-7.0。还包括以下步骤：将上述调整PH值后的溶液用硅藻土过滤，得原料液，之后将原料液进行灌装、灭菌、检验和包装入库。上述步骤(1)中，煎煮过程中需要不断搅拌，并且煎煮液移入配料罐前需要将煎煮液进行板框机300目过滤。本发明采用上述配方的依据为:根据中医理论依据，结合现代研究成果，提出上述的用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液。因为睡眠障碍多由情志变化(石磊在顽固性失眠症特色专科诊疗方案中提到)，情志不遂，肝失疏泄，初则气机郁结，若日久则可见气郁化火，神不安则不能寐。气滞则血瘀，血行不畅，肝不藏血，血不养心，身无所依，乃不寐也。故纵观病机，无非气血失衡，从肝入手，舒畅气杋，使气行血活，肝气调达，心气与脑气相接，则神魂自安，乱梦亦平，酣然入睡。而且，本发明以蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉和精氨酸为主，以调畅气机，疏肝解郁，升清降浊；辅以枣仁、茯苓平冲安神，佐使低聚异麦芽糖泄热去实；诸味相配，共奏疏肝气，泄郁火，定肝魂，镇心神之功。虫草是一味名贵的滋补中药，《本草从新》中记载其具有补肺益肾的功效，本发明的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉是虫草发酵菌丝体，人工培养的虫草发酵菌丝体的成分、用途与天然的冬虫夏草相似。现代实验研究表明(穆效群在评价保健食品对巨噬细胞吞噬功能影响的实验方法提到)，虫草菌丝体有提高肺巨噬细胞的吞噬能力、小鼠吞噬细胞的廓清能力、促进淋巴细胞转化、提高小鼠的血清溶血素及脾细胞免疫溶血活性，具有很强的增强机体免疫力的效果。经大量研究表明，虫草菌丝体与天然的冬虫夏草成分极其相似，并且药理作用和临床效果也相似，甚至在某些方面优于天然冬虫夏草(穆效群和魏涛分别在评价保健食品对巨噬细胞吞噬功能影响的实验方法及冬虫夏草菌丝体改善免疫功能的研究上提到)。魏涛等研究结果提示冬虫夏草菌丝体具有提高小鼠全身非特异性免疫的功能。酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子。它是较常见的镇静安眠重要，《神农本草经》中将它列为上品，《本草纲目》中列为本部类，《中药学》教材中列为养心安神要类。它具有补肝、宁心、敛汗、生津的功能，多用于虚烦不眠、惊悸多梦、津伤口渴等症。酸枣仁中含有皂苷类、三萜类、黄酮类、生物碱类、脂肪油类、蛋白质、磷酯类化合物等。酸枣仁的药理证明不饱和脂肪酸部分有明显的镇静剂催眠作用，能明显缩短戊巴比妥钠引起的睡眠潜伏期，延长戊巴比妥钠引起的睡眠时间，并且随着用药时间延长其作用越明显，并未出现耐受现象。茯苓为多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核。中医认为茯苓具有利水渗湿、健脾宁心功能；临床用于治疗水肿尿少、痰饮眩悸、脾虚食少、心神不宁、惊悸失眠等症。现代药理学研究表明，茯苓及羧甲基茯苓多糖具有提高机体免疫力、抗菌、降糖等作用。实验结果均表明，茯苓对谷氨酸又到神经细胞内钙离子浓度升高有抑制作用；对叠氨钠引起的神经细胞线粒体的功能及微管结构损伤有保护作用；对豚鼠皮肤络氨酸酶mRNA基因表达水平的抑制，升高老年大鼠羟脯氨酸的含量，显示具有预防和治疗中枢神经系统疾病，延缓皮肤衰老作用。茯苓多糖体内外给药，能诱导人血淋巴细胞昌盛IFN-γ,IFN-α,IL-2，IL-6，TNF与GM-CSF，能明显增强小鼠及荷瘤小鼠脾细胞增殖效应，增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，对抗CY免疫抑制作用等。结果表明茯苓多糖是一种免疫增强剂。精氨酸是一种半必需氨基酸，对于正常人而言，属于非必需氨基酸，但在某些病理状态下，则为必需氨基酸。它的代谢产物为多胺、核酸、一氧化氮和氧化氮等，前两者为细胞分裂所必需的物质，而后两者为血管扩张、肝细胞合成蛋白质和肝细胞线粒体电子传递的重要介质，具有促进生长与维持机体平衡的作用。另外，精氨酸在代谢应激状态下属于必需氨基酸，能对免疫系统产生影响，主要通过细胞免疫产生作用，对机体体液免疫则无显著影响。精氨酸在机体内的基本作用如下：强化精氨酸的胃肠营养支持中，无论经肠道供给还是经静脉应用均可刺激生长激素、催乳素、胰岛素、胰高血糖素的释放，精氨酸可增强机体内的氮潴留，有效地发挥调节作用，控制蛋白质的更新，促进肌肉内蛋白的合成，有助于改善机体氮平衡，提高机体的免疫状态。精氨酸的免疫防御及免疫调节：精氨酸能增加T淋巴细胞对Con-A和PHA的反应性，增加CD4细胞的数量，并能提高外周血中的NK细胞数目和IL-2细胞的活性，促进IL-2的产生，增加细胞毒性T淋巴细胞的功能及诱导IL-2R的表达。应用含氨基酸的肠内营养甚至还可以提高HIV/AIDS患者的免疫功能，肠粘膜的主要功能是吸收肠腔内的各种营养物质，同时也是阻止肠腔细菌发生异位的屏障，而机体的免疫功能是决定细菌是否易位的重要因素。低聚异麦芽糖是我国开发最早的功能性低聚糖之一，是以精制玉米淀粉为原料经酶法水解精制而成的一种新型功能性淀粉糖。低聚异麦芽糖的甜度是蔗糖的40％，是低甜度、低热量的。它具有促进双歧杆菌超强增殖、抗龋齿、消除疲劳、促进钙的吸收、增强机体免疫力、润肠通便等生理功能。又因其具有低甜度、低热值、低粘度、保湿性、非发酵性、耐酸性等特性，所以被广泛应用于各类保健食品、音频、奶制品、糖果和面食等。蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉含蛋白质、多糖、腺苷、甘露醇，16中氨基酸和24中游离氨基酸；茯苓含有二萜羧酸、多糖、组氨酸、腺嘌呤、胆碱、β-茯苓聚糖酶、蛋白酶、脂肪酸、脂肪软磷脂、麦角甾醇、茯苓素等；酸枣仁中含有皂苷类、三萜类、黄酮类、生物碱类、脂肪油类、蛋白质、脂肪类化合物等。本发明具有以下有益效果：它不仅吸收效果好、利用度高，而且能增强免疫力改善睡眠。产品经实验证明，质量稳定，食用安全，增强免疫力效果明显。具体实施方式下面结合具体实施方式和具体实施例对本发明进一步阐述。本发明的蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉优选浙江万丰企业集团制药有限公司，它符合可用于保健食品真菌菌种规定。酸枣仁、茯苓已列入保健食品申报所用原料名单51号文件附件1之内。精氨酸是常见的氨基酸，低聚异麦芽糖是低热值的甜味剂，上述各原料均符合中华人民共和国药典及相应质量标准。(一)具体实施方式一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它主要由以下组分按照以下重量份配制而成：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉45-55份、酸枣仁45-55份、茯苓45-55份、精氨酸9-12份、低聚异麦芽糖45-55份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它主要由以下组分按照以下重量份配制而成：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉50份、酸枣仁50份、茯苓50份、精氨酸11.2份、低聚异麦芽糖50份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液，它主要由以下组分按照以下重量份配制而成：蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉45份、酸枣仁45份、茯苓45份、精氨酸10份、低聚异麦芽糖45份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)先将粉碎后的酸枣仁和茯苓片及蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉搅拌均匀，然后投入煎锅中，加入投入量8倍以上的的纯化水，浸泡30分钟以上，之后用常压100℃煎煮1.5-2.5小时，煎煮1次以上，将煎煮液移入配料罐中；(2)称取精氨酸及低聚异麦芽糖，并将它们投入配料罐中，然后补充纯化水至生产灌装需要量，之后200-400转/分钟搅拌30分钟以上，使精氨酸及低聚异麦芽糖溶解充分；(3)然后用20％食用级的碳酸钠调整上述混匀后的溶液的PH值为6.8-7.0。还包括以下步骤：将上述调整PH值后的溶液用硅藻土过滤，得原料液，之后将原料液进行灌装、灭菌、检验和包装入库。上述步骤(1)中，煎煮过程中需要不断搅拌，并且煎煮液移入配料罐前需要将煎煮液进行板框机300目过滤。具体实施例1蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉50份、酸枣仁50份、茯苓50份、精氨酸11.2份、低聚异麦芽糖50份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)先将粉碎后的酸枣仁和茯苓片及蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉搅拌均匀，然后投入不锈钢夹层锅中，加入投入量8倍的的纯化水，浸泡30分钟，之后用常压100℃煎煮1.5小时，煎煮1次，然后将煎煮液进入板框机300目过滤，将煎煮液移入配料罐中；煎煮过程中需要不断搅拌，(2)称取精氨酸及低聚异麦芽糖，并将它们投入配料罐中，然后补充纯化水至生产灌装需要量，之后200转/分钟搅拌30分钟以上，使精氨酸及低聚异麦芽糖溶解充分；(3)然后用20％食用级的碳酸钠调整上述混匀后的溶液的PH值为6.8，将上述调整PH值后的溶液用硅藻土过滤，得原料液，(4)之后将原料液进行灌装、灭菌、检验和包装入库。具体实施例2蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉45份、酸枣仁45份、茯苓45份、精氨酸10份、低聚异麦芽糖45份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)先将粉碎后的酸枣仁和茯苓片及蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉搅拌均匀，然后投入不锈钢夹层锅中，加入投入量8倍的的纯化水，浸泡40分钟，之后用常压100℃煎煮2小时，煎煮1次，然后将煎煮液进入板框机300目过滤，将煎煮液移入配料罐中；煎煮过程中需要不断搅拌，(2)称取精氨酸及低聚异麦芽糖，并将它们投入配料罐中，然后补充纯化水至生产灌装需要量，之后300转/分钟搅拌30分钟以上，使精氨酸及低聚异麦芽糖溶解充分；(3)然后用20％食用级的碳酸钠调整上述混匀后的溶液的PH值为7.0，将上述调整PH值后的溶液用硅藻土过滤，得原料液，(4)之后将原料液进行灌装、灭菌、检验和包装入库。具体实施例3蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉55份、酸枣仁55份、茯苓55份、精氨酸12份、低聚异麦芽糖55份和纯化水适量。一种用于增强免疫力改善睡眠的保健口服液的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)先将粉碎后的酸枣仁和茯苓片及蝙蝠蛾拟青霉菌丝体粉搅拌均匀，然后投入不锈钢夹层锅中，加入投入量8倍的的纯化水，浸泡40分钟，之后用常压100℃煎煮2小时，煎煮1次，然后将煎煮液进入板框机300目过滤，将煎煮液移入配料罐中；煎煮过程中需要不断搅拌，(2)称取精氨酸及低聚异麦芽糖，并将它们投入配料罐中，然后补充纯化水至生产灌装需要量，之后300转/分钟搅拌30分钟以上，使精氨酸及低聚异麦芽糖溶解充分；(3)然后用20％食用级的碳酸钠调整上述混匀后的溶液的PH值为7.0，将上述调整PH值后的溶液用硅藻土过滤，得原料液，(4)之后将原料液进行灌装、灭菌、检验和包装入库。将以上实施例的产品进行检测，结果显示，该产品的功效成分为粗多糖，每100毫升成品中含粗多糖0.8克。采用以下原理测定产品中的粗多糖含量：食品中分子量＞10000的高分子物质在800ml/L乙醇溶液中沉淀，与水溶性单糖和低聚糖分离，用碱性二价铜试剂选择性的从其它高分子物质中沉淀具有葡萄糖结构的多糖，用苯酚-硫酸反应以碳水化合物形式比色测定其含量，其颜色强度与粗多糖葡聚糖的含量成正比，以此计算食品中粗多糖含量。以下是对本产品增强免疫力的实验：将本上述实施例的产品进行动物实验，选用军事医学科学院动物中心繁殖的18-22克昆明种健康清洁级雌性小鼠192只，共分为4批，每批随机分为4组，每组12只，其中实验一批进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应实验、半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞的测定，实验二批进行碳廓清实验；实验三批进行小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，实验四批进行ConA诱导小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性实验实验动物饲养于北京联合大学应用文理学院保健食品功能检测中心SPF级动物室，实验动物使用许可证号：SYXK(京)2002-0021。剂量：本产品口服液的推荐剂量为成人(按60千克体重计)，每日90毫升，相当于1.5毫克/日/千克BW，实验分别设人体推荐量的5、10、30倍，即每日7.5毫克/日/千克BW、15.0毫克/日/千克BW、45.0毫克/日/千克BW为低、中、高剂量组将受试样品3750毫升，经60-70℃减压浓缩至1520毫升，加无菌水1667毫升，制成受试样品的2.25倍浓缩液作为高剂量受试物后测各项指标。小鼠灌胃体积为0.2毫升/10g鼠重，同时设一空白对照组(0毫克/千克BW)，用水(已消毒)代替受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。主要仪器与试剂：T500电子天平(20000006)、AE100电子天平(96009)、755分光光度计(2002001)、酶标仪(98001)、二氧化碳培养箱(96090)、低速离心机(98090)、恒温水浴(2004009)、显微镜(2003002)、倒置显微镜(98006)、螺旋测微仪(96099).洁净工作台、无菌手术器械、微量注射器(25微升)、细胞计数器、24孔和96孔平底细胞培养板、96孔U型细胞培养板、玻璃培养板、玻璃平皿、纱布、试管、玻片架、200目筛网、计时器、血色器吸管、载玻片。绵阳红细胞(SRB)、生理盐水、Hank’s液(PH7.2-7.4)RPM11640培养液、小牛血清、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A(ConA-)、1％冰醋酸、1mol/L的盐酸溶液、酸性异丙醇(96mL异丙醇加1mol/L的盐酸溶液4mL)、MTT\PBS缓冲液(PH7.2-7.4)，补体(豚鼠血清)、SA缓冲液、琼脂糖、都氏试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾PH7.2-7.4)、氰化钾0.05g，加蒸馏水至1000毫升)、YAC-1细胞、乳酸锂、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸盐、氧化型辅酶I、0.2mol/L的Tris-HCl溶液(PH8.2)、1％NP40、印度墨汁、0.1％碳酸氢钠、鸡红细胞、甲醇、Giemsa染液等。实验方法脏器体重比值的测定小鼠称重后颈椎脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污称重，计算脾脏体重比值和胸腺体重比值。迟发型变态反应(DTH)实验(足跖增厚法)取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC(2000r/min，10min)0.2mL，致敏后4d，测量左侧足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。然后在测量部位皮下注册20％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC20微升，于注射后24小时测量左侧足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，制成细胞悬液。用Hank’s洗3次，每次离心10分钟。然后将细胞悬浮于1毫升的完全培养液中，镜检计数，调查细胞浓度为3x106个/毫升，再将脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1毫升，在其中一孔加75微升ConA液(相当于7.5微克/毫升)，另一孔作为对照，置5％二氧化碳，37℃二氧化碳孵箱中培养72小时。培养液，同时加入MTT(5毫克/毫升)50微升/孔，继续培养4小时。培养结束后，每孔加入1毫升光度计上比色测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值剪去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力。受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。抗体生成细胞的测定取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC(2000r/min，10min)0.2mL，将SRBC免疫5天后的小鼠颈椎脱臼处死，取出脾脏，清清磨碎脾脏，制成细胞悬液。离心(1000r/min)10min，用Hank’s液洗2遍，最后将细胞悬浮在8mLHank’s液中。将琼脂加热溶解后，与等量双倍Hank’s叶混合，分装小试管，没管0.5毫升，再向管内加10％(v/v，用SA液配制)压积SRBC50微升，脾细胞悬液8微升，迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的载玻片，做平行片，待琼脂凝固后，将玻片水平扣放在片架上，加入二氧化碳培养箱中37℃温育1小时，然后用SA缓冲液稀释补体(1:8)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数，用空斑数/全脾细胞来表示，受试样品组的空斑数显著高于对照组的空斑数，可判定该项实验结果阳性。半数溶血值(HC50)的测定取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)压积SRBC进行免疫，5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为300倍，取1毫升置试管内，依次加入10％(v/v，用SA液配制)压积SRBC0.5毫升，补体1毫升(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)置于37℃恒温水浴中恒温15分钟后，冰浴终止反应。2000r/分钟离心10分钟，取上清1毫升，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10分钟后，取540纳米处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50表示)，按下式计算：样品半数溶血值＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值x稀释倍数；受试样品组的HC50显著高于对照组的HC50，可判定该项实验结果阳性。小鼠廓清实验按体重从小鼠围静脉注射稀释4倍的印度墨汁(0.05mL/10g)。待墨汁注入，立即计时，注入墨汁后2、10分钟，分别从内毗静脉丛取血20微升，并将其加入2毫升0.1％碳酸钠溶液中，用755分光光度计在600nm波长处测量光密度值(OD)，以碳酸钠溶液作空白对照，将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。以碳廓清指数(a)表示碳廓清的能力按下式计算a：k＝(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)a＝体重＝(肝重+脾重)*k1/3受试样品组的碳廓清指数显著高于对照组的碳廓清指数，可判定该项实验结果阳性。小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)小鼠腹腔注射20％(v/v，用生理盐水配制)鸡红细胞(2000r/min，10min)。悬浮1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，将其仰位固定于鼠板上，经腹腔注入生理盐水2Ml，转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1Ml。取腹腔巨噬细胞洗液1mL，分别滴于2片载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移至于37℃孵温箱育30min，孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以1:1丙酮甲醇溶液固定，4％(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干，油镜下计数，每片计数100个巨噬细胞，按下式计算吞噬率和吞噬指数：吞噬百分比(％)＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100吞噬指数＝吞噬的鸡红细胞总数/计数的吞噬细胞得出的吞噬百分率再按下式进行数据转换，式中p为吞噬百分率，用对照组的吞噬百分率和吞噬指数，可判定该项实验结果阳性。NK细胞活性的测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)实验前24小时将靶细胞YAC-1进行传代培养，应用Hank’s液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用应用Hank’s液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。放弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s，1000r/min，10分钟离心，用1mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，镜检计数，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为2×107个/mL，使效靶比为50:1，取靶细胞和效应细胞各100微升，加入U形96孔培养板中，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100微升，靶细胞最大释放孔加1％NP40各100微升，上述各项均设三个平行孔，37℃、5％二氧化碳培养箱中培养4小时，将96孔板以1500r/min离心5分钟，每孔吸取上清100微升置平底96孔培养板中，加入LDH基质液100微升，反应3-10分钟，然后每孔加入1mol/LDHCl溶液30微升终止反应，在酶标仪490nm处测光密度值(OD)，计算NK细胞活性：NK细胞活性(％)＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100得出的NK细胞活性按下式进行数据转换，式中P为NK细胞活性，用小数表示。得到数据为计量资料，受试样品组的NK细胞活性显著高于对照组的NK细胞活性，可判定该项实验结果阳性。数据处理用SPSS软件进行数据处理。采用方差分析，但需要方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计，对非正态或者方差补齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或者方差齐要求后，用转换后的数据进行统计，若变量转换后仍未达到正态或者方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。结果判定依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)规定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方面任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有增强免疫力功能作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核-巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核-巨噬细胞更能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。结果本发明产品对小鼠体重的影响各小组小鼠的初始体重由表1可见，小鼠的初始体重在四批实验动物各剂量组与0ML/kgBW组间比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即小鼠的初始体重在各组件较为均衡。表2本发明产品对小鼠体重的影响由表二可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，小鼠的体重在四批实验动物各剂量组与0ML/kgBW组件相比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即本发明产品对小鼠体重无不良影响。本发明产品对小鼠脏器/体重比值的影响表3本发明产品对小鼠脾脏/体重比值的影响由表3可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，小鼠的脾脏/体重在四批实验动物各剂量组与0ML/kgBW组件相比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即本发明产品对小鼠脾脏/体重无特别影响。表3本发明产品对小鼠胸腺/体重比值的影响由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，小鼠的胸腺/体重在四批实验动物各剂量组与0ML/kgBW组件相比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即本发明产品对小鼠胸腺/体重无特别影响。本发明产品对小鼠细胞免疫功能的影响表5本发明产品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响由表5可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，小鼠的足跖肿胀度在四批实验动物各剂量组与0ML/kgBW组件相比较，差异均无显著性(P＞0.05)，即本发明产品对小鼠迟发型变态反应能力无影响。表6本发明产品对小鼠脾淋巴细胞转化实验的影响※：与0ML/kgBW组别相比较具有显著性差异由表6可见，，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，15.0ML/kgBW、45.0ML/kgBW与0ML/kgBW组间相比较，淋巴细胞的增值能力均有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品在15.0ML/kgBW、45.0ML/kgBW能增强ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化能力。本发明产品对体液免疫的影响表7本发明产品对小鼠抗体生成细胞数的影响※：与0ML/kgBW组别相比较具有显著性差异由表7可见，，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，45.0ML/kgBW与0ML/kgBW组间相比较，抗体生成细胞数有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品在45.0ML/kgBW能提高小鼠抗体生成细胞数。表8本发明产品对小鼠半数溶血值(HC50)的影响※：与0ML/kgBW组别相比较具有显著性差异由表7可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，15.0ML/kgBW、45.0ML/kgBW与0ML/kgBW组间相比较，半数溶血值均有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品在15.0ML/kgBW、45.0ML/kgBW均能提高小鼠半数溶血值。本发明产品对小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能的影响表9本发明产品对小鼠碳廓清能力的影响由表9可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，各剂量组小鼠碳廓清能力与0ML/kgBW组比较，差异无显著性(P＞0.05)，即本发明产品在的碳廓清能力无影响。表10本发明产品对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率的影响※：与0ML/kgBW组别相比较具有显著性差异由表10可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，45.0ML/kgBW与0ML/kgBW组间相比较，吞噬率有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品45.0ML/kgBW能提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率。表11本发明产品对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数的影响※：与0ML/kgBW组别相比较具有显著性差异由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，45.0ML/kgBW与0ML/kgBW组间相比较，吞噬指数有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品45.0ML/kgBW能提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数。本发明产品对小鼠NK细胞活性的影响表12本发明产品对小鼠NK细胞活性的影响由表12可见，经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，各剂量组与0ML/kgBW组间相比较，无显著性差异(P＞0.05)，即本发明产品对小鼠的NK细胞活性无影响。小结经口给予小鼠不同剂量的本发明产品口服液32天后，与0ML/kgBW组比较，该受试物在15.0mL/kgBW组能增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力(P小于0.05)、提高小鼠半数溶血值，在45.0mL/kgBW组能增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力、提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率，提高小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数。该受试物对小鼠体重增长无不良影响。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003)对增强免疫力保健食品的判定标准可知，本发明产品具有增强免疫力的功能。以下是对本发明产品改善睡眠的实验1.1材料和方法样品：本发明产品1.2实验动物：选用北京维通利华实验动物技术有限公司繁殖的18-22g健康清洁雄性小鼠180只，共分3批进行实验，每批随机分为4组，每组15只。实验一批进行直接睡眠实验和延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间实验；实验二批进行戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验，实验三批进行戊巴比妥钠睡眠潜伏期实验。1.3剂量本发明的推荐剂量为成人(按60kg体重计)每日90mL，相当于1.5mL/日/kgBW。实验分别设人体推荐量的5、10、30倍，即每日：7.5mL/kgBW、15.0mL/kgBW、45.0mL/kgBW为为低、中、高剂量组将受试样品3750毫升，经60-70℃减压浓缩至1520毫升，加无菌水1667毫升，制成受试样品的2.25倍浓缩液作为高剂量受试物后测各项指标。小鼠灌胃体积为0.2毫升/10g鼠重，同时设一空白对照组(0毫克/千克BW)，用水(已消毒)代替受试物，每日灌胃体积与各受试物组相同。1.4仪器与试剂仪器：AE100电子天平(96009)、T500电子天平(2000006)、秒表(2001003)试剂戊巴比妥钠、巴比妥钠、生理盐水检测方法直接睡眠实验观察受试组动物给予3个剂量的受试样品，对照组给予同体积溶剂后，是否出现睡眠现象。睡眠以翻正反射消失为指标。当小鼠置于背卧位时，能立即翻正身位。如超过30-60秒不能翻正身，即认为翻正反射消失，进入睡眠，翻正反射恢复即为动物觉醒。翻正反射消失至恢复这段时间为动物睡眠时间，记录空白对照组与受试物组入睡动物数与睡眠时间。睡眠时间为计量资料，采用方差分析，入眠动物为计数资料，采用x2检验，比较对照组与实验组入睡动物与睡眠时间之间的差异，若入睡动物数或睡眠时间增加有显著性，则实验结果阳性。1.5延长睡眠时间实验末次给予溶剂及不同浓度受试物后，出现峰作用前15min，给各组动物腹腔注射32mg/kgBWmL/kgBW，注射量为0.1mL/kgBW。以小鼠翻正反射消失为睡眠指标，观察受试物能否延长戊巴比妥钠诱导的睡眠时间。实验在夜间进行。睡眠时间为计量资料。比较实验组与对照组睡眠时间延长之间的差异。睡眠时间延长有显著性，则实验结果为阳性。戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验正式实验前进行预实验，确定戊巴比妥钠阀下催眠剂量，即80-90％小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥钠最大阀值剂量末次给予溶剂及不同浓度受试物后，出现峰作用前15min，给各组动物腹腔注射26mg/kgBWmL/kgBW，注射量为0.1mL/kgBW。以小鼠翻正反射消失达1分钟以上者为入睡标准，记录30分钟内入睡动物，观察受试物能否延长戊巴比妥钠阀下剂量入睡动物发生率。实验在夜间进行。入睡动物为计量资料，采用x2检验。比较实验组与对照组入睡动物之间的差异。入睡动物发生率增加有显著性，则实验结果为阳性。巴比妥钠睡眠潜伏期实验末次给予溶剂及不同东渡受试物20min后，各组动物腹腔注射240mL/kgBW巴比妥钠，注射量为0.1mL/10kgBW.以动物翻正反射消失为睡眠指标，观察受试物对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响。睡眠潜伏期为计量资料。比较实验组与对照组睡眠潜伏期之间的差异，睡眠潜伏期缩短有显著性，则实验结果阳性。1.6数据处理用SPSS软件进行数据处理。采用方差分析，但需要方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值＜F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计，对非正态或者方差补齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或者方差齐要求后，用转换后的数据进行统计，若变量转换后仍未达到正态或者方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。1.7结果判定依据延长戊巴比妥钠睡眠时间实验、戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验、巴比妥钠睡眠潜伏期实验三项实验中二巷阳性，且无明显直接睡眠作用，可判定该受试样品具有改善睡眠的功能。结果表13本发明产品对世界睡眠实验的影响由表13可见对照组及三个剂量组动物在给予受试物60分钟内，均未出现有直接睡眠现象。本发明产品对戊巴比妥钠诱导睡眠时间的影响表14本发明产品对戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间的影响组别动物数(只)睡眠时间(min)P值0mL/kgBW1522.0±5.2——7.5mL/kgBW1525.6±7.70.39215.0mL/kgBW1525.6±8.50.39145.0mL/kgBW1532.4±7.1※0.001※：与0mL/kgBW组比较具有显著性差异由表14可见，经口给予小鼠不同剂量的本产品30天，45.0mL/kgBW组与0mL/kgBW组比较，睡眠的时间有显著性差异(P＜0.01)，即本发明产品在45.0mL/kgBW组能延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间。本发明产品对戊巴比妥钠阀下剂量催眠实验的影响表15本发明产品对戊巴比妥钠阀下剂量小鼠入睡发生率的影响由表15可见，经口给予小鼠不同剂量的本产品30天，45.0mL/kgBW组与0mL/kgBW组比较，入睡动物发生率有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品在45.0mL/kgBW组能提高戊巴比妥钠阀下剂量小鼠入睡动物发生率。本发明产品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响表16本发明产品对巴比妥钠睡眠潜伏期的影响由表16可见，经口给予小鼠不同剂量的本产品30天，45.0mL/kgBW组与0mL/kgBW组比较，睡眠潜伏期有显著性差异(P＜0.05)，即本发明产品在45.0mL/kgBW组能缩短小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期。小结经口给予小鼠不同剂量的本产品30天，对照组及三个剂量组在给予受试物60分钟内，均为由直接睡眠现象。本发明产品在45.0mL/kgBW组能延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间。即本发明产品在45.0mL/kgBW组能提高戊巴比妥钠阀下剂量小鼠入睡动物发生率。即本发明产品在45.0mL/kgBW组能缩短小鼠巴比妥钠睡眠潜伏期。根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)对改善睡眠保健食品的判定标准可知，本发明产品具有改善睡眠的功能。总结：本发明产品不仅吸收效果好、利用度高，而且能增强免疫力、改善睡眠。以上仅是针对本发明的可行实施例的具体说明，但该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明思路所为的等效实施或变更，均应包含于本发明的专利范围中。当前第1页1 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