本发明涉及臭氧化油的新功能及其给药途径。具体涉及以胶囊的形式通过口服途径在治疗高血压和提高性功能方面的医药用途以及增强免疫力、辅助降血糖、抗氧化、辅助改善记忆、辅助改善睡眠、缓解体力疲劳、提高缺氧耐受力等的保健作用和保健品。
背景技术：
：veliobocci在《臭氧治疗学》一书中概述了使用低剂量的臭氧气体能够发挥许多有益功能，且无副作用，即臭氧疗法(见veliobocci撰写的《oxygen-ozonetherapy》，北京大学医学出版社，2004)。臭氧疗法可以通过多种给药途径来实现，并针对不同疾病产生不同的功效。臭氧化油外用作为抗菌剂、除臭剂用于褥疮和溃疡等皮肤病的治疗药物。因此，现已知臭氧具有氧化和抗菌作用。将臭氧化油直接灌胃用于幽门螺旋杆菌引起的胃炎的治疗。肌肉或皮下注射臭氧气体来治疗慢性病毒肝炎和血管性疾病。阴道直接通入臭氧气体能够治愈炎症和细菌感染。将臭氧气体直接与一定体积的血液在体外混合，再回输给患者被称为自体血疗法，能够调理人体内环境，降低机体的敏感性和增强机体免疫力。直肠直接吹臭氧气体能够改善帕金森病的症状(见lambertore，mohamedn.mawsouf，silviamenendez，olgas.leon，gregoriom.sanchez，andfrankhernandez撰写的《ozonetherapy：clinicalandbasicevidenceofitstherapeuticpotential》，archivesofmedicalresearch，2008，39：17-26)。腹腔给臭氧气体能够保护心脏免受急性心肌梗塞的损伤(claradifilippo，margheritaluongo，raffaelemarfella，francaferraraccio，biagiolettieri，annalisacapuano，francescorossi，micheled′amico撰写的《oxygen/ozoneprotectstheheartfromacutemyocardialinfarctionthroughlocalincreaseofenosactivityandendothelialprogenitorcellsrecruitment》，naunyn-schmiedarchpharmacol，2010，382：287-291)。从结构上看，尽管臭氧化油和臭氧气体(：o-o-o)并不是同一物质，但臭氧化油是通过对油的加成臭氧得到，故在其分子中具有臭氧化物结构，与臭氧气体的功能相似。以上各种给药途径均表明臭氧能够以气体的方式直接被机体吸收并发挥功能。臭氧气体的功能可能通过以下三个途径来实现：(1)、臭氧在体内通过生物化学反应，生成类似活性氧的物质(羟基自由基oh-、超氧阴离子o2-等)，广泛影响着机体氧化还原系统；(2)、臭氧能够引起内皮祖细胞聚集和促进一氧化氮(no)的生成，起到舒张血管的作用；(3)、臭氧能够诱导骨髓干细胞到血管损伤部位，促进损伤血管修复重建，但具体机制尚不明确。上述给药途径存在诸多缺陷：沿途与太多物质接触，难以保证气体进入机体的有效浓度。若给予过量极易诱发机体产生不适反应，且操作过程繁琐，再加上疗程较长，患者难以接受。尤其是自体血疗法，每周2～3次，连续10周为一疗程。本发明以油与臭氧加成的方式，得到臭氧化油，再将此油以肠溶胶囊包裹，能够克服直接使用臭氧气体的诸多缺点。既保证臭氧化油不与外界任何物质接触，在常态下亦可长期稳定保存；还能定量控制臭氧化油进入机体，从而避免通过其它给药方式给药，人为造成药量不当。臭氧化油肠溶胶囊的给药途径为直接口服，对机体伤害最小，操作简单易行，方便携带，为其推广奠定了良好的基础。在臭氧化油产品中，臭氧化橄榄油、葵花油、大豆油作为抗菌剂、除臭剂用于褥疮和溃疡等皮肤病的治疗的外用药品已经上市。但将臭氧化油制成肠溶胶囊的形式通过直接口服的方式进入机体而产生功效，目前尚无报道。在本发明中，通过直接口服臭氧化油肠溶胶囊，能够产生降压和提高性功能的药效以及增强免疫力、辅助降血糖、抗氧化、辅助改善记忆、辅助改善睡眠、缓解体力疲劳、提高缺氧耐受力等保健作用，无毒副作用，操作简单易行，方便携带，能够开发出治疗高血压和提高性功能的药品和相关保健品。技术实现要素：本发明的目的在于提供臭氧化油的新功效和给药途径，通过口服该臭氧化油肠溶胶囊的途径，既避免了臭氧化油酸败脂肪的难闻味道对患者的刺激和进入机体的剂量把控不准导致机体产生不适反应，同时采用了口服肠溶胶囊这种患者最易接受并且能够长期服用的形式，能够产生在降压和提高性功能方面的药效以及增强免疫力、辅助降血糖、抗氧化、辅助改善记忆、辅助改善睡眠、缓解体力疲劳、提高缺氧耐受力等保健作用。一个臭氧分子与不饱和烯烃双键发生加成反应，生成臭氧化合物。在本发明中，之所以选择权利要求1、2所述的各种油中的一种、两种和两种以上，是因为这些油不饱和脂肪酸含量较高，其中核桃油的不饱和脂肪酸高达92％以上。在不饱和脂肪酸结构中至少有一个烯烃类双键。权利要求3所述的棕榈油、棕榈仁油、椰子油不饱和脂肪酸含量低，其中棕榈油的不饱和脂肪酸含量不足50％，是饱和脂肪酸的典型代表。将权利要求1、2中的一种、两种和两种以上不饱和油与权利要求3中的一种、两种和两种以上的含饱和脂肪酸高的油混合，也能与臭氧发生加成反应。若将权利要求1、2中的一种、两种和两种以上含不饱和脂肪酸高的油与权利要求5～11中的一种、两种和两种以上的表面活性剂和助表面活性剂混合，亦能与臭氧发生加成反应。可见只要加成物的结构中存在烯烃不饱和键即可与臭氧发生加成反应，不饱和键数目越多，反应越容易发生，且与臭氧加成的量越多，加成物能够携带臭氧分子的数目也越多。为达到上述目的，本发明采用的技术方案将结合下面具体的制作流程和实施方式进行详细说明。1、制备臭氧气体。本发明采用医用氧气通过臭氧发生器来制备臭氧气体。选自西安德润生物技术有限责任公司设计生产的dro3-a型臭氧机(功率≤55w)。2、制备臭氧化油和臭氧化油肠溶胶囊整个过程须要在20～25℃进行，确保臭氧化油不会发生热解反应。3、制备臭氧化油。将臭氧气体与权利要求1～4中的油在反应釜中混合进行臭氧化反应。以臭氧化橄榄油的制备为例，将市售橄榄油2～4kg加入反应釜(专门用于臭氧气体和橄榄油混合进行臭氧化反应的容器，容积为6l)中，再将臭氧导管通入其中，气流速度为120～180m3/h，总反应时间为20～24小时。反应结束后，将余气灭活，产物即为臭氧化橄榄油。至此得到臭氧化油的浓度为25～54mg/l。4、制备臭氧化油肠溶胶囊。(1)、囊材的制备：按重量比2～4∶2～4∶1∶1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成70～80℃，在温度到达55～60℃的时候开始加水，加水10～15分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2～3分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为1.5～2小时，搅拌后温度设定为55～65℃，静置脱气泡7～8小时。(2)、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.1～0.75ml。室温20～24℃制胶囊，胶皮厚度为0.6～0.8mm，容量为0.1～0.75ml，制得的软胶囊在转笼里冷却7～9小时，出笼，干燥即得臭氧化油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。5、制备含表面活性剂的臭氧化油。将权利要求1～4中的油和权利要求5～12中的表面活性剂在特殊容器中混合进行臭氧化反应。以含失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(吐温80)的臭氧化橄榄油的制备为例，将市售橄榄油2～4kg和吐温8010～100ml加入反应釜(专门用于臭氧气体和橄榄油混合进行臭氧化反应的容器，容积为6l)中，再将臭氧导管通入其中，气流速度为120～180m3/h，总反应时间为20～24小时。反应结束后，将余气灭活，产物即为含表面活性剂的臭氧化橄榄油。得到臭氧化橄榄油的浓度为25～54mg/l。制备含表面活性剂的臭氧化油肠溶胶囊。(1)、囊材的制备：按重量比2～4∶2～4∶1∶1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成70～80℃，在温度到达55～60℃的时候开始加水，加水10～15分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2～3分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为1.5～2小时，搅拌后温度设定为55～65℃，静置脱气泡7～8小时。(2)、采用压制法制备含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.1～0.75ml。室温20～24℃制胶囊，胶皮厚度为0.6～0.8mm，容量为0.1～0.75ml，制得的软胶囊在转笼里冷却7～9小时，出笼，干燥即得臭氧化油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。7、制备含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化油。将臭氧气体与权利要求1～4中的油和权利要求5～12中的表面活性剂和助表面活性剂在特殊容器中混合进行臭氧化反应。以含失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(吐温80)和纯乙醇的臭氧化橄榄油的制备为例，将市售橄榄油2～4kg、吐温8010～100ml和纯乙醇10～25ml加入反应釜(专门用于臭氧气体和橄榄油混合进行臭氧化反应的容器，容积为6l)中，再将臭氧导管通入其中，气流速度为120～180m3/h，总反应时间为20～24小时。反应结束后，将余气灭活，产物即为含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油，臭氧化橄榄油的浓度为25～54mg/l。具体实施方式以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。实施例1臭氧化橄榄油肠溶胶囊制备1、制备臭氧气体。本发明采用医用氧气通过臭氧发生器来制备臭氧气体。选自西安德润生物技术有限责任公司设计生产的dro3-a型臭氧机(功率≤55w)。2、制备臭氧化油和臭氧化油肠溶胶囊整个过程须要在20～25℃进行，确保臭氧化油不会发生热解反应。3、橄榄油3kg置入反应釜中；臭氧以150m3/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。4、得到臭氧化橄榄油浓度为40mg/l，25℃可稳定保存十个月。5、制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊。(1)、囊材的制备：按重量比3∶3∶1∶1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成75℃，在温度到达60℃的时候开始加水，加水10分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为2小时，搅拌后温度设定为60℃，静置脱气泡8小时。(2)、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.25ml。室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25ml，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得臭氧化橄榄油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。实施例2臭氧化橄榄油、大豆油和花生油混合油的肠溶胶囊制备1、制备臭氧气体。本发明采用医用氧气通过臭氧发生器来制备臭氧气体。选自西安德润生物技术有限责任公司设计生产的dro3-a型臭氧机(功率≤55w)。2、制备臭氧化油和臭氧化油肠溶胶囊整个过程须要在20～25℃进行，确保臭氧化油不会发生热解反应。3、橄榄油1kg，大豆油1kg和花生油1kg置入反应釜中；臭氧以150m3/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。4、得到臭氧化混合油浓度为40mg/l，25℃可稳定保存十个月。5、制备臭氧化混合油肠溶胶囊。(1)、囊材的制备：按重量比3∶3∶1∶1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成75℃，在温度到达60℃的时候开始加水，加水10分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为2小时，搅拌后温度设定为60℃，静置脱气泡8小时。(2)、采用压制法制备臭氧化混合油肠溶胶囊，容量0.25ml。室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25ml，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得臭氧化混合油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。实施例3含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊制备1、制备臭氧气体。本发明采用医用氧气通过臭氧发生器来制备臭氧气体。选自西安德润生物技术有限责任公司设计生产的dro3-a型臭氧机(功率≤55w)。2、制备臭氧化油和臭氧化油肠溶胶囊整个过程须要在20～25℃进行，确保臭氧化油不会发生热解反应。3、橄榄油3kg置入反应釜中，缓慢加入失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(吐温80)20ml，混匀，臭氧以150m3/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。4、得到臭氧化橄榄油浓度为40mg/l，25℃可稳定保存十个月。5、制备含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊。(1)、囊材的制备：按重量比3∶3∶1∶1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成75℃，在温度到达60℃的时候开始加水，加水10分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为2小时，搅拌后温度设定为60℃，静置脱气泡8小时。(2)、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.25ml。室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25ml，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。实施例4含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊制备1、制备臭氧气体。本发明采用医用氧气通过臭氧发生器来制备臭氧气体。选自西安德润生物技术有限责任公司设计生产的dro3-a型臭氧机(功率≤55w)。2、制备臭氧化油和臭氧化油肠溶胶囊整个过程须要在20～25℃进行，确保臭氧化油不会发生热解反应。3、橄榄油3kg置入反应釜中，缓慢加入失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚(吐温80)20ml和纯乙醇20ml，混匀，臭氧以150m3/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。4、得到臭氧化橄榄油浓度为40mg/l，25℃可稳定保存十个月。5、制备含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊。(1)、囊材的制备：按重量比3∶3∶1∶1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成75℃，在温度到达60℃的时候开始加水，加水10分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为2小时，搅拌后温度设定为60℃，静置脱气泡8小时。(2)、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.25ml。室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25ml，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。下面通过药理学试验和临床试验进一步阐述本发明中臭氧化油的治疗效果及保健功效。实施例5降压治疗效果的实验研究1、臭氧化橄榄油对原发性高血压(shr)大鼠的降血压作用原发性高血压(shr)大鼠与人类高血压病十分相似，是研究高血压病发病机制和筛选降压药物较为理想的动物模型(参见徐叔云，卞如濂，陈修(主编)，药理实验方法学，第三版，北京，人民卫生出版社，2001：953-954)。以下实验采用该动物模型证明本发明臭氧化橄榄油的降压作用。实验动物原发性高血压(shr)大鼠，雄性，spf级，体重240-280g；正常血压对照组为wistar大鼠(wky大鼠)，雄性，无特定病原体级(spf级)，体重250-270g，均由陕西省第四军医大学实验动物中心提供。动物购买后饲养于动物观察饲养室，自然采光，通风良好，湿度50-65％，温度20-25℃。主要仪器bp-6动物无创血压测试仪，成都泰盟科技有限公司；数控超级恒温槽，宁波天恒仪器厂。统计学处理方法量反应资料以均值±标准差表示(采用spss16.0软件统计分析，组间比较用单因素方差分析(one-wayanova)lsd法统计，p＜0.05为具有统计学意义)。实验方法shr大鼠，先测量血压进行筛选，剔除不合格大鼠，而后将大鼠随机分为：shr模型对照组、wky空白对照组、本发明实验给予臭氧化橄榄油3个剂量，分别按0.25ml/只、0.125ml/只、和0.0625ml/只剂量给药，每组10只。模型对照组和空白对照组灌胃等容积非臭氧化橄榄油，各组大鼠给药前尾动脉测压法3次测其收缩压和舒张压，取各自平均值作为给药前血压值。连续给药7天后，于末次给药1小时，同法测定收缩压和舒张压，剔除规定时间内不稳定大鼠。同期比较收缩压和舒张压，判断药物降压作用。实验结果(1)本发明中臭氧化橄榄油对shr大鼠收缩压的影响臭氧化橄榄油对shr大鼠收缩压的影响如下表1所示：表1wky对照与shr对照相比：##p＜0.01；药物组与shr对照相比：＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。表1结果显示：与wky对照组相比，shr对照组模型大鼠收缩压明显升高(p＜0.01)；与同期shr对照组相比，本发明实验给予臭氧化橄榄油3个剂量能明显降低shr大鼠收缩压(p＜0.01)。(2)、本发明中药组合物对shr大鼠舒张压的影响本发明臭氧化橄榄油对shr大鼠舒张压的影响如下表2所示：表2wky对照与shr对照相比：##p＜0.01；药物组与shr对照相比：＊＊p＜0.01表2结果显示：与wky对照组相比，shr对照组模型大鼠舒张压均明显升高(p＜0.01)；与同期shr对照组相比，本发明3个剂量的臭氧化橄榄油能明显降低shr大鼠舒张压(p＜0.01)。表1、表2结果表明：本发明的臭氧化橄榄油具有降压作用，能够显著降低收缩压和舒张压。2、临床观察资料(1)临床病例：临床经诊断为高血压患者100例，随机分配为两组：治疗组50例，其中男25例，女25例；对照组50例，其中男25例，女25例。2组患者年龄、性别、血压参数等经统计学分析，差异无统计学意义(p＞0.05)，具有可比性。(2)诊断标准：符合who及国际高血压学会1999年高血压诊断标准。(3)治疗方法：治疗组服用本发明的臭氧化橄榄油，早空腹服用1次，口服1粒(0.25ml)。对照组服用卡托普利降压片每次1片，每日3次，口服。两组均在试验过程中不使用任何其他种类的降压药物、中药及免疫抑制剂等，3周后评价疗效。(4)观察指标血压服药前以及服药后第3周末分别测血压。降压疗效评定标准《新药(西药)临床研究指导原则》(中华人民共和国卫生部制定发布.第1辑.1993)。(5)统计学方法采用spss16.0软件分析。计量资料以均数±标准差表示。计量资料比较采用配对t检验及成组设计的t检验。(6)结果两组血压的比较见下表3。表3两组血压比较(mmhg)与治疗前比较，＊＊p＜0.01。表3结果表明，本发明臭氧化橄榄油的疗效优于临床公认的降压药“卡托普利片”疗效，说明本发明的臭氧化橄榄油具有明显的降血压作用。(7)两组患者降压疗效比较治疗3周后，治疗组50例，显效45例，有效3例，无效2例，总有效率96.0％；对照组50例，显效20例，有效22例，无效8例，总有效率84.0％，差异有统计学意义(p＜0.01)。说明本发明的臭氧化橄榄油对高血压病有较好的疗效，且本发明臭氧化橄榄油的总有效率显著优于对照组(卡托普利降压片)。典型病例王某，女，63岁，2007年7月被诊断为高血压，测定血压为160/105mmhg。主要症状为：头额胀痛、眩晕。服用本发明的臭氧化橄榄油，每日早空腹1次，口服1粒(0.25ml)。服用3周后，患者症状消失，复查血压：120/81mmhg。陈某，男，55岁，2012年4月被诊断为高血压，测定血压为170/110mmhg。主要症状：头晕、头痛、乏力。服用本发明的臭氧化橄榄油，每日早空腹1次，口服1粒(0.25ml)。服用3周后，患者症状明显减轻，复查血压：122/82mmhg。张某，男，40岁，2011年11月被诊断为高血压，测定血压为185/115mmhg。主要症状：头胀痛、失眠健忘。服用本发明的臭氧化橄榄油，每日早空腹1次，口服1粒(0.25ml)。服用3周后，患者症状明显减轻，复查血压：120/82mmhg。实施例6提高性功能治疗效果的实验研究臭氧化橄榄油对清醒大鼠阴茎勃起功能的影响1、材料与方法(1)动物与实验装置选取雄性wistar大鼠，实验时将大鼠放置于玻璃实验装置，保持环境安静和光线暗淡，安置摄像设备。(2)实验分组①基质对照组：基质(橄榄油)；②阳性对照组：阿卟吗啡(apo)，100μg/kg；③臭氧化橄榄油1组：0.25ml臭氧化橄榄油④臭氧化橄榄油2组：0.125ml臭氧化橄榄油。每组10只大鼠，每次实验随机选择4只大鼠，分配到以上4组。(3)给药方法：在大鼠阴茎、阴囊部位涂抹药物。2、结果给药后观察60min，记录阴茎勃起的次数。计数标准为：(1)阴茎头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起1次，阴茎体突出大于1cm者记为显著勃起次数；(2)或出现大鼠阴茎勃起的典型表现(雄鼠的臀部或足跟向上抬起，头部埋下添阴茎的同时，臀部有节律地运动)时记录1次。同时记录舔阴茎次数。结果显示，与基质对照组相比，0.25ml臭氧化橄榄油组、0.125ml臭氧化橄榄油组均能显著增加清醒大鼠阴茎勃起次数，并能增加清醒大鼠舔阴茎次数(如表1所示)。表1臭氧化橄榄油对清醒大鼠阴茎勃起的影响(n＝10)臭氧化橄榄油对ed大鼠阴茎勃起功能的影响1、材料与方法(1)动物与实验装置选取雄性wistar大鼠，进行双铡骼内动脉结扎，复制血管性勃起功能障碍大鼠模型。实验时将大鼠放置于玻璃实验装置，保持环境安静和光线暗淡，安置摄像设备。(2)实验分组：①手术组：灌胃橄榄油；②模型对照组：灌胃橄榄油；③阳性对照组：灌胃3mg/kgsidenafi1；④臭氧化橄榄油低剂量组：灌胃0.0625ml/只臭氧化橄榄油；⑤臭氧化橄榄油中剂量组：灌胃0.125ml/只臭氧化橄榄油；⑥臭氧化橄榄油高剂量组：灌胃0.25ml/只臭氧化橄榄油。每组10只动物。结扎手术后连续给药21天。2、结果末次给药后观察60min，记录阴茎勃起的次数，计数标准为：(1)阴茎头充血及末端阴茎体出现为阴茎勃起1次，阴茎体突出大于1cm者记为显著勃起次数；(2)或出现大鼠阴茎勃起的典型表现(雄鼠的臀部或足跟向上抬起，头部埋下舔阴茎的同时，臀部有节律地运动)时记录1次。结果显示，与模型对照组相比，臭氧化橄榄油能显著缩短勃起潜伏期，增加ed大鼠阴茎勃起次数(如表2所示)。表2臭氧化橄榄油对ed模型大鼠阴茎勃起的影响(n＝10)注：与模型对照组相比，具有显著性差异，＊p＜0.05。临床观察资料典型病例1、王某，男，34岁，睡眠较差，有轻度性功能发障碍；服用本发明的臭氧化橄榄油一个月后，精神状态改善，性功能恢复正常。2、杨某，男，45岁，食欲较差，有中度性功能发障碍；服用本发明的臭氧化橄榄油三周后，精神状态改善，性功能恢复正常。3、张某，男，52岁，有高血压病，50岁后出现轻度性功能发障碍；服用本发明的臭氧化橄榄油三周后，精神状态改善，性功能恢复正常。实施例7增强免疫力保健功效的实验研究1、cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(mtt法)(1)样品及剂量：制备得到的臭氧化橄榄油，每次需服用0.06％wt的量，每天摄入1次。实验动物与分组：spf级雌性小鼠，体重18g～22g，由陕西省第四军医大学实验动物中心提供，饲料由同一单位提供。(2)实验分组：每个测试均取40只小鼠，分为4组。第一组为对照组，摄入黄芪枸杞茯苓氨基酸片，摄入剂量通过该产品的说明书上的成人剂量进行换算：一次摄入每片的0.03％wt的量，每天摄入两次。第二组为臭氧化橄榄油低剂量组，每次摄入0.03％wt的量，每天摄入一次。第三组为正常剂量组，每次摄入臭氧化橄榄油0.06％wt的量，每天摄入一次。第四组为高剂量组，每次摄入臭氧化橄榄油胶囊的0.12％的wt量，每天摄入一次。(3)cona诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(mtt法)无菌取脾，置于盛有适量无菌hank′s液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用hank′s液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1ml完全培养液中，计数活细胞数，用rpmi1640培养液调整细胞浓度为3x10□个/ml。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，在其中一孔加75ulcona液(相当于7.5ug/ml)，另一孔作为对照，置5％二氧化碳，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt(5mg/ml)50ul/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值表示。四组药物对小鼠淋巴细胞转化能力的影响如表1所示。表1由表1可见，经口给予小鼠不同剂量的产品30天，中、高剂量能增加小鼠淋巴细胞转化能力，与对照组比较差异有显著性(p＜0.05)。2、抗体生成细胞检测(jerne改良玻片法)取羊血用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，将压积srbc用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。5天后将小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用hank’s液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8mlhank’s液中。计数细胞，并将细胞浓度调整为5×10□个/ml。将表层培养基加热溶解后与等量的ph7.4、2倍浓度的hank’s液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用sa液配制的10％srbc50ul(v/v)，20ul脾细胞悬液(5x10□个/ml)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，将用sa液稀释的补体(1：8)加入到玻片凹槽内继续温育1.5h后计数溶血空斑数。四组药物对小鼠抗体生成细胞数的影响如表2所示。表2由表2可知，经口给予小鼠不同剂量的臭氧化橄榄油三周，中、高剂量能增加小鼠抗体生成细胞数，与对照组比较差异有显著性(p＜0.05)。3、nk细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用hank′s液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清将细胞弹起，加入0.5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5ml2倍hank′s液及8mlhank′s液，1000rpm离心10min，用1ml含10％小牛血清的rpmi1640完全培养液重悬，用台盼兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为2x10□个/ml此为效应细胞，取传代后24h生长良好的yac-1细胞用rpmi1640完全培养液调整细胞浓度为4x10□个/ml此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50：1)，加入u型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5％triton各100ul上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100ul置平底96孔培养板中，同时加入ldh基质液100ul，根据室温反应3-10min，每孔加入1mol/l的hcl30ul，在酶标仪490nm处测定光密度(od)。nk细胞活性＝[(反应孔od-自然释放孔od)/(最大释放孔od-自然释放孔od)]×100％。四组药物对小鼠nk细胞活性的影响如表3所示。表3由表3可见，经口给予小鼠不同剂量的产品3周，中、高剂量能增加nk细胞活性，与对照组比较差异有显著性(p＜0.05)。临床观察资料典型病例1.陈某，女，32岁，精神萎靡，疲乏无力，食欲降低，睡眠障碍。服本发明的臭氧化橄榄油，每日1次，三周为一疗程，服药1个疗程后症状减轻，继续服用1个疗程后病症痊愈，注意调节身体后没有复发。2.段某，女，34岁，情绪烦躁。服本发明的臭氧化橄榄油，每日1次，连续3周为一疗程，服药1个疗程后症状痊愈。3.宋某，男，66岁，感冒反复发作，多梦，盗汗。服本发明的臭氧化橄榄油，每日1次，连续3周为一疗程，1个疗程后症状减轻，继续服用2个疗程后病症痊愈。实施例8辅助降血糖保健功效的实验研究按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)辅助降血糖功能检验方法进行实验。1.动物实验1.1实验动物：spf级健康雄性小鼠(22±2g)陕西省第四军医大学实验动物中心繁殖。1.2试剂：四氧嘧啶(alloxanmonohydrate)；盐酸二甲双胍；臭氧化橄榄油1.3仪器强生稳择易血糖仪(血糖测定试纸)美国强生公司1.4方法与结果1.4.1降低造模空腹血糖实验选高血糖模型动物按禁食3-5h的血糖水平分组，随机选1个模型对照组，1个阳性对照组和3个剂量组，每组小鼠12只。剂量组给予不同浓度受试样品，分别为0.25ml/只、0.125ml/只、0.0625ml/只，模型对照组给予同体积溶剂，阳性对照组给予0.2g/kg盐酸二甲双胍，每天灌胃1次，连续30天，测空腹血糖值(禁食同实验前)，比较各组动物血糖值及血糖下降百分率。血糖下降百分率＝(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值＊100％。结果见表1。表1.臭氧化橄榄油对造模小鼠空腹血糖的影响与模型对照组比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01表1结果表明，本发明所述辅助降血糖的臭氧化橄榄油具有明显降低造模小鼠空腹血糖的作用。1.4.2降低空腹血糖实验选健康成年动物按禁食3-5h的血糖水平分组，随机选1个对照组，1个阳性对照组和1个受试品组，对照组给予同体积溶剂，阳性对照组给予0.2g/kg盐酸二甲双胍，受试品组给予高剂量受试样品(0.25/只)，操作同上节1.4.1。结果见表2。表2.臭氧化橄榄油对健康小鼠空腹血糖的影响与对照组比较＊＊p＜0.01表2结果表明，本发明所述辅助降血糖的臭氧化橄榄油具有明显降低健康小鼠空腹血糖的作用。1.4.3糖耐量实验高血糖模型动物禁食3-5h，剂量组给予不同浓度受试样品，分别为0.0625ml/只、0.125ml/只、0.25ml/只，模型对照组给予同体积溶剂，阳性对照组给予0.2g/kg盐酸二甲双胍，15-20min后经口给予葡萄糖2.0g/kg，测定给葡萄糖后0、0.5、2h的血糖值.结果见表3。表3.臭氧化橄榄油对造模小鼠糖耐量的影响与模型对照组比较＊p＜0.05，＊＊p＜0.01，＊＊＊p＜0.00１。由表3结果表明，本发明所述辅助降血糖的臭氧化橄榄油可明显降低造模小鼠餐后血糖。临床观察资料2人体试食实验2.1受试者选择及分组选择经饮食控制或口服降糖药治疗后病情较稳定，不需要更换药品物种及剂量，仅服用维持量的成年ｉｉ型糖尿病病人120例，其中男72例，女48例，年龄35-65，按随机盲发分为试食组和对照组(采用自身和组间两种对照设计)，每组60例。2.2治疗方法实验前对每位受试者按性别、年龄、不同劳动强度等，并参照原来生活习惯规定饮食，试食期间坚持饮食控制，治疗糖尿病的药物种类和剂量不变。试食组在服药的基础上，每日1次，每次1粒服用受试样品，对照组在服药的基础上服用同等剂量的安慰剂，受试样品给予3周。2.3观察指标2.3.1症状观察实验前后患者症状观察包括口渴多饮、多食易饥、倦怠乏力、多尿等主要临床症状，观察临床症状改善率(轻症以上均为有效)。表4为临床症状统计表。表4.临床症状统计表结果：试食组93％患者临床症状有所改善，对照组2％患者临床症状有改善。2.3.2空腹血糖试食前后空腹血糖值及血糖下降百分率，结果见表5。表5.臭氧化橄榄油对糖尿病患者空腹血糖的影响与对照组比较＊＊p＜0.01表5结果表明，本发明所述辅助降血糖的臭氧化橄榄油具有明显降低糖尿病患者空腹血糖的作用。2.3.3餐后2h血糖试食后，食用精粉馒头后2h血糖值及血糖下降百分率，结果见表5。表6.臭氧化橄榄油对糖尿病患者餐后血糖的影响与对照组比较＊＊p＜0.01表6结果表明，本发明所述辅助降血糖的臭氧化橄榄油保健品具有明显降糖尿病患者餐后血糖的作用。2.3.4尿糖用空腹晨尿定性，按-、±、+、++、+++、++++分别代表尿糖含量多少。结果：试食组96％患者空腹晨尿尿糖含量降低，对照组1％患者空腹晨尿尿糖含量降低。实施例9抗氧化保健功效的实验研究1、动物体内实验研究臭氧化橄榄油的抗衰老作用及机制。选icr小鼠，随机分成六组：正常对照组、衰老模型组、维生素e组、臭氧化橄榄油给予高、中、低剂量(0.25、0.125、0.625ml/只/天)组。除正常组外，其他各组按150ml×kg□1×d□1的剂量皮下注射d-半乳糖致衰老模型，同时给后四组灌胃维生素e，高、中、低剂量的臭氧化橄榄油。三周后，眼球取血，断颈法处死小鼠，分别测定小鼠的胸腺指数和脾脏指数，血浆sod活性和no含量，肝脏中sod，gsh-px活性和mda的水平以及脑组织中sod活性和mda的水平。结果：与正常组比较，模型组的胸腺指数和脾脏指数分别由0.1227±0.04降低至0.0683±0.01及0.2312±0.02至0.1942±0.02(p＜0.01)；血浆、肝脏、脑组织中sod活性分别由69.57±6.6u/ml降低至60.43±4.7u/ml(p＜0.05)；29.88±2.2u/mgprot降低至25.81±2.5u/mgprot(p＜0.05)及45.62±5.0u/mgprot降低至35.45±4.8u/mgprot(p＜0.01)；肝脏、脑中的mda含量则分别由3.62±0.8nmol/mgprot升至6.76±1.6nmol/mgprot及6.15±0.4nmol/mgprot升至7.54±0.4nmol/mgprot(p＜0.01)；血浆中no的含量由62.10±3.4μmol/l升高至74.38±6.5μmol/l(p＜0.01)；肝中gsh-px活性也由324.2±41.1u/mgprot降至218.7±27.6u/mgprot(p＜0.01)。而与模型组比较，臭氧化橄榄油各给药组的胸腺指数和脾脏指数明显升高，分别为0.0983±0.03、0.1165±0.03、0.1213±0.03(p＜0.01)；0.2476±0.03(p＜0.05)、0.2781±0.03(p＜0.01)，0.2619±0.02(p＜0.01)；血浆、肝脏、脑组织中sod活性分别增加为83.42±7.0u/ml(p＜0.01)、81.55±8.0u/ml(p＜0.01)、87.01±9.0u/ml(p＜0.01)；33.35±3.0u/mgprot(p＜0.01)、34.66±2.7u/mgprot(p＜0.01)、36.12±3.5u/mgprot(p＜0.01)；54.83±4.6u/mgprot(p＜0.01)、53.32±3.8u/mgprot(p＜0.01)、58.48±5.9u/mgprot(p＜0.01)；肝脏、脑中的mda含量则显著下降，分别为4.02±0.2nmol/mgprot、3.70±0.10nmol/mgprot、3.52±0.3nmol/mgprot(p＜0.01)；5.64±0.7nmol/mgprot、5.76±0.5nmol/mgprot，4.87±0.7nmol/mgprot(p＜0.01)；血浆中no的含量明显降低为61.79±5.1μmol/l(p＜0.01)、62.15±11.2μmol/l、60.08±5.0μmol/l(p＜0.01)；肝中gsh-px活性也显著提高到317.9±67.2u/mgprot、325.0±60.2u/mgprot、329.1±70.9u/mgprot(p＜0.01)。2、臭氧化橄榄油对ccl4所致sd大鼠急性肝损伤的保护作用48只健康sd雄性大鼠随机分为正常组(normal)、模型组(model)、阳性对照组(bifendate)和臭氧化橄榄油高、中、低剂量治疗组，每组8只。采用ccl4建立sd大鼠急性肝损伤模型。臭氧化橄榄油治疗组大鼠分别给予0.25、0.125、0.0625ml/只的臭氧化橄榄油灌胃，正常组和模型组大鼠给予相同剂量的橄榄油灌胃，阳性对照组给予联苯双酯滴丸(150mg/kg)灌胃，1次/天，连续灌胃给药7d，末次给药1h后，除正常组外其它各组大鼠均给予腹腔注射10％ccl4(10ml/kg)。16h后乙醚麻醉开腹腔腹主动脉取血，检测血清中丙氨酸转氨酶(alt)和天门冬氨酸转氨酶(ast)的水平；取肝脏测定肝脏指数；he染色，光镜下观察肝脏病理形态学改变；测定肝组织匀浆中超氧化物歧化酶(sod)活力、丙二醛(mda)的含量；通过比较各组大鼠血清和肝脏生化指标以及肝脏组织病理学特征的差异，评价治疗组的治疗效果。结果：与正常组比较，模型组大鼠肝脏明显肿胀、起泡，外观呈颗粒状；肝组织he染色病理切片显示模型组大鼠肝脏有明显肝脂肪样和气泡样变性，有炎性细胞浸润等。模型组肝脏指数明显增大(p＜0.01)，血清alt、ast水平含量明显升高(p＜0.01)，肝组织中sod活性明显降低(p＜0.01)、mda含量显著增高(p＜0.01)。结果证明四氯化碳诱导的大鼠肝损伤模型建立成功。与模型组比较，臭氧化橄榄油低剂量组病理学表现、肝脏指数、血清ast，alt、肝组织sod，mda含量与模型组无统计学差异(p＞0.05)；高、中剂量组肝脏病理损害均有减轻，肝脏指数明显下降(p＜0.01)，血清中ast、alt水平明显降低(p＜0.01)，肝脏组织中sod含量明显增加(p＜0.01)，mda的含量明显下降(p＜0.01)。肝组织sod含量更高，差异均有统计学意义(p＜0.05)。结论：臭氧化橄榄油的体内抗衰老抗氧化研究表明，臭氧化橄榄油能延缓d-半乳糖致icr小鼠的衰老，提高衰老小鼠的学习记忆能力和免疫功能，其机制可能是通过臭氧化橄榄油清除机体内的自由基和提高机体自身的抗氧化系统活性，减缓d-半乳糖对机体的氧化应激损伤，从而起到延缓衰老的作用。臭氧化橄榄油还可对ccl4诱导的大鼠急性肝损伤有一定的保护作用，其机理可能与升高sod，降低mda、ast、alt有关。临床观察资料典型病例赵某，女，46岁，2013年7月因身体疲倦，睡眠不好，记忆力衰退，身体枯瘦，面色枯黄，每日晨空腹口服本臭氧化橄榄油1粒(0.25ml)，三周后精神转好，睡眠好转，面色红润，随后又服用了两个月，精力充足，记忆力增强，整个人很显年轻。王某，男，58岁。面色萎黄，精力不足，晚上睡眠不好，精神状态不好，每日晨空腹口服本臭氧化橄榄油1粒(0.25ml)，40天后，面、唇乌紫退尽，面色光白，精神振奋，两眼炯炯有神。张某，女，63岁。心慌气短，面容憔悴，满脸老年斑，记忆力衰退，尿频尿急，睡眠不好，头晕耳鸣。每日晨空腹口服本臭氧化橄榄油1粒(0.25ml)，3周，尿急尿频也得到有效的改善，耳鸣好转，面试红润柔亮，看起来年轻了不少。张某，男，70岁。有关节炎，天冷时加重，胸部憋闷，吃药打针，热敷等治疗效果都不太理想。每日晨空腹口服本臭氧化橄榄油1粒(0.25ml)，10天后，感觉全身轻松了许多，继续坚持使用，关节疼痛也消失了，现蹲起自如，明显精神不少。王某，女，58岁。20016年每日晨空腹口服本臭氧化橄榄油1粒(0.25ml)，服用15天，皮肤一直红润，很少生病，反应敏捷。张某，男。肥胖，高血压，腰椎间盘突出，每日晨空腹口服本臭氧化橄榄油1粒(0.25ml)，至今身体非常好，腰疼痛也大大减轻了，现与同龄相比，显得比较年轻。实施例10辅助改善记忆保健功效的实验研究1.小鼠morris水迷宫(morriswatermaze，mwm)实验实验设计，水迷宫测试系统主要由暗灰色的圆柱形水池、金属站台、数字摄像机及计算机组成。水池高50cm，直径80cm，站台直径6.9cm。水池上方通过数字摄像机与计算机监视屏相连接。小鼠在水池中的全部活动情况可在监视屏中看到，利用计算机软件对其活动进行全程跟踪，并显示整个活动轨迹。当设定的训练时间已到或动物已爬上站台，计算机停止跟踪并记录游泳轨迹和自动计算找到站台所需要的时间即潜伏期。以此表示小鼠的学习记忆能力。清洁级小鼠，雌雄各半，体重18-22g，动物分笼饲养，保持12h昼夜节律，室温24±1℃，自由饮水摄食，将小鼠随机分成4组，每组10只，雌雄各半，分别为：空白组(橄榄油，0.1ml/kg，i.g.)，实验组分3个剂量，每组动物连续给药三周。每日需要1次，每日中剂量小鼠的用量为0.125ml/只，另，设置高低剂量组剂量分别为0.25ml/只和0.0625，ml/只，每只小鼠给药范围在0.2ml～0.8ml之间。每天都灌胃给药，连续灌胃7天后，将小鼠置于水迷宫测试仪中，训练数次后，测定各组小鼠找寻平台的时间。设定3min为游出的最后时限，观察各组小鼠在3min内的游出率。测试前5天每天对小鼠进行训练，保证训练环境安静，每次训练的时间、地点相同，操作者站于相同位置。训练第一天将受试小鼠放在出口处，使之爬上安全平台3次，让其了解逃离方式，以后每次实验前让小鼠从出口处自行爬上1次，然后放入离出口最近的4区，引导小鼠至出口；之后两天一次由3区、2区将小鼠引导至出口；第四、五天将小鼠放入1区，引导至出口。第六天当各组的小鼠从1区至出口3min通过时，对各组小鼠进行测试，观察各组小鼠3min内自行游出率。结果见表1。表1对小鼠在水迷宫实验的影响＊与空白组比p＜0.05，＊＊与空白组比＜0.01。由表1可见，臭氧化橄榄油低中高剂量组小鼠在morris水迷宫测试仪中的游出率与空白组相比有显著性的差异，这说明实验片剂能够改善小鼠寻找平台的时间，提高了小鼠学习记忆寻找平台位置的时间，具有一定提高记忆力的能力。2.小鼠自主活动实验小鼠自主活动实验，是评价实验动物在新异环境中自主行为、探究行为与紧张度的一种方法。以实验动物在新奇环境之中某些行为的发生频率和持续时间等，反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，查看动物在陌生环境中记忆学习新环境适应的能力。清洁级小鼠，雌雄各半，体重18-22g，动物分笼饲养，保持12h昼夜节律，室温24±1℃，自由饮水摄食，将小鼠随机分成五组，每组10只，雌雄各半，分别为：空白组(橄榄油，0.1ml/kg，i.g.)，实验组分3个剂量，每组动物连续给药7天。每日1次灌胃给药，每日每只中剂量小鼠的用量为：0.125ml/只，另，设置高、低剂量组剂量分别为0.25ml/只和0.125ml/只，每只小鼠给药范围在0.2ml～0.8ml之间。将小鼠置于自主活动箱中，仪器自动记录5min内小鼠的自主活动站立和活动的次数。结果见表2。表2臭氧化橄榄油对小鼠在自主活动仪实验的影响组别空白组低剂量组中剂量组高剂量组活动次数15.72±2.3518.83±3.2722.14±2.3925.82±2.14＊＊站立次数25.69±3.1434.59±3.1442.19±4.3248.27±3.83＊＊＊与空白组比p＜0.05，＊＊与空白组比＜0.01。由表2可见，实验组低、中、高剂量组小鼠在自主活动仪中的活动次数和站立次数与空白组相比有显著性的差异，这说明臭氧化橄榄油能够改善小鼠活动与站立的次数，使小鼠更加的熟悉并记住了自主活动仪黑暗的环境并无危险，说明臭氧化橄榄油在一定程度上具有提高记忆力的作用。临床观察资料临床治疗情况：从2010-2016年，一共治疗220例患者，男136例，女84例。年龄段40-68岁之间，病程4月-3年不等，主要以中老年人为主。本证的诊断标准：主症，睡眠差，失眠多梦，记忆力下降，走神，头疼，以上只要符合主症三项即可诊断。治疗方法，随机分为两组，各110人。1、治疗组每次服用0.25ml，早上空腹服用1次1粒，以7天为一疗程，服用1-2疗程。2、对照组，服用安神补脑液，每日2次，每次1瓶，7天为1个疗程，服用1-2疗程。疗效评定标准：痊愈：临床症状、体征消失或基本消失，显效：临床症状、体征明显改善，有效：临床症状、体征改善，无效：临床症状、体征无改善。治疗结果，经过两个疗程治疗，治疗组痊愈86人，显效14人，有效7人，无效3人，总有效率达到97％。对照组，痊愈43人，显效24人，有效21人，无效22人，总有效率达到80％。由此可见，两组都有良好的治疗效果，其中治疗组药物优于对照组治疗效果。实施例11辅助改善睡眠保健功效的实验研究取本发明所述的臭氧化橄榄油，依据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)的评价方法，进行动物功能试验：成年小鼠，随机分为5组，每组10只；设置样品低、中、高剂量组(0.0625ml/只、0.125ml/只，0.25ml/只)；另设正常对照组(等体积的橄榄油代替)；阳性对照组(0.5g/kg)；每日经口灌胃，连续三周后，测试改善睡眠功能的各项指标。(1)对直接睡眠实验的影响各试验组给予受试样品，阴性对照组给予同体积溶剂，经观察30min后，翻正反射存在，各实验组小鼠均未出现睡眠现象。(2)对延长戊巴比妥钠睡眠时间的影响样品中剂量组可延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，与正常对照组比较，差异有统计学意义(p＜0.05)；阳性对照组、样品高剂量组可延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间，与正常对照组比较，差异显著(p＜0.01)，见表1。(3)对戊巴比妥钠阈下剂量催眠实验的影响各剂量组对戊巴比妥钠阈下诱导的小鼠入睡数，与正常对照组比较，差异无统计学意义(p＞0.05)，见表1。(4)对巴比妥钠睡眠潜伏期实验的影响样品中、高剂量组剂量组可缩短巴比妥钠催眠的小鼠入睡潜伏期，与正常对照组比较，差异极显著(p＜0.01)，见表1。表1对改善睡眠功能实验的影响注：与正常对照组相比，＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。动物试验结果，本发明所述的臭氧化橄榄油，对实验小鼠无直接睡眠作用；中、高剂量组可延长戊巴比妥钠诱导的小鼠睡眠时间，且能缩短巴比妥钠催眠的小鼠入睡潜伏期，与正常对照组比较差异有统计学意义(p＜0.01)。说明本发明所述的臭氧化橄榄油具有改善睡眠保健作用。临床观察资料典型病例50名志愿者，年龄范围18～65岁，男性25名，女性25名。服用方法：每天早上空腹服用1粒。服用3周后，其中有43名志愿者反应睡眠质量有所改善，这说明本品具有改善睡眠的功能。实施例12缓解体力疲劳保健功效的实验研究根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，进行负重游泳实验、血清尿素氮测定、肝糖原含量测定和血清乳酸脱氢酶测定实验，其中负重游泳实验结果具有统计学意义；血清尿素氮测定、血清ldh测定和肝糖原测定任意二项实验结果具有统计学意义，判定受试样品具有缓解体力疲劳功效。本发明臭氧化橄榄油三个剂量组四个实验中负重游泳时间、肝糖原实验、乳酸脱氢酶试验各组指标有显著性差异，呈现较明显的剂量一效应关系，且以高剂量组效果显著。本动物实验研究结论为受试样品具有缓解体力疲劳功效。(1)动物分组每个实验均分为四组：空白对照组(橄榄油)，高、中、低剂量实验组。每组随机分配10只小鼠。各组小鼠连续灌胃给药三周，实验期间自由饮食。每6天秤体重一次。(2)受试物制备待检产品0.0625ml/只/天为低剂量，0.125ml/只/天为中剂量，0.25ml/只/天为高剂量。连续等体积灌胃受试物三周后，测定各项指标。(3)检测指标除给药期间体重变化外，实验检测4个指标，分别为负重游泳时间、血清尿素氮测定、血清ldh测定和肝糖原测定。(4)实验方法负重游泳实验各组小鼠均连续灌胃给药三周，空白对照组给与等量溶剂。末次给药30min后，将尾根部负荷5％体重铁丝的小鼠置于游泳箱中游泳，水深30cm±2cm，水温25℃±1.0℃，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，即小鼠负重游泳时间，精确到秒。血清尿素氮测定实验小鼠连续灌胃给药30d，空白对照组给予等量溶剂。末次给药30min后，在温度为30℃±1℃的水中不负重游泳90min，休息60min后，摘眼球采血。血凝后离心取血清。全自动血液生化分析仪检测血清尿素氮含量。血清乳酸脱氢酶测定实验小鼠连续灌胃给药30d，对照组给与等量溶剂。末次给药30min后，不负重在水温度30℃±1℃水中游泳10min后，摘眼球采血。血凝固后离心取血清。全自动血液生化分析仪检测血清乳酸脱氢酶含量。肝糖原测定各组小鼠均连续灌胃给药30d。末次给药30min后处死小鼠，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏100mg制备肝糖原，检测肝糖原含量。(5)统计学分析用spss16.0软件进行数据转化和统计分析。分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用lsd法或者dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐，则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后，用转换后的数据进行统计，若变量转换后仍未达到方差齐的目的，改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不需方差齐性的tamhane′st2检验进行两两比较。结果以均数和标准差(x±s)来进行各组对比。(6)结果判定根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，根据以下标准判定受试样品具有缓解体力疲劳功效。负重游泳实验结果具有统计学意义；血清尿素氮测定、血清ldh测定和肝糖原测定任意二项实验结果具有统计学意义。负重游泳实验，结果如下表4中所示：本发明臭氧化橄榄油三个剂量组与空白组比较，实验组动物给药剂量与游泳时间均值呈现剂量一效应关系。高剂量组小鼠负重游泳存活时间增加显著，具有统计学意义。从负重该试验结果看出，灌胃受试物可引起动物游泳时间明显延长。表明待测样品具有延长小鼠负重游泳时间的作用。表1各组小鼠负重游泳时间比较注：与空白对照组相比，＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。血清尿素氮含量实验，结果如下表2中所示：本发明臭氧化橄榄油三个剂量组与空白组比较，3个实验组的小鼠尿素氮含量水平均数均低于空白组，3个受试物组之间尿素氮水平没有呈现出浓度-效应关系。推测受试物对小鼠尿素氮的影响存在一个较适合的摄取量范围。表2各组小鼠血清尿素氮含量比较注：与空白对照组相比，＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。乳酸脱氢酶活性实验：本发明臭氧化橄榄油三个剂量组与空白组比较，低剂量与空白组相比差异显著，说明低剂量对小鼠提高乳酸脱氢酶活性作用明显。中剂量组、高剂量组与空白组相比，差异极显著，表明中剂量、高剂量对小鼠提高乳酸脱氢酶活性作用很明显。表3小鼠乳酸脱氢酶含量注：与空白对照组相比，＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。肝糖原试验：本发明臭氧化橄榄油三个剂量组与空白组比较，各实验组小鼠肝糖原含量均数均高于空白组的小鼠肝糖原含量均数，高剂量组小鼠肝糖原含量的差别极显著。表明该受试物可减少肝糖原损耗，提高肝糖原含量的作用。从低剂量到高剂量随着给药浓度的升高，肝糖原的含量也呈增加趋势，呈现浓度-效应的对应关系。表4小鼠肝糖原含量比较注：与空白对照组相比，＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。综上所述，在本实验室条件下，分别经口灌胃连续给予橄榄油、待检样品各三周，本次抗疲劳实验的四个分实验中负重游泳时间、血清尿素氮含量、肝糖原实验、乳酸脱氢酶试验各组指标有显著性差异，根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)，本动物实验研究结论为受试样品臭氧化橄榄油具有缓解体力疲劳功效。因此，本发明中的臭氧化橄榄油同时具备耐缺氧和抗疲劳功能。临床观察资料典型病例1、牛某，男，成年，疲乏5日，肢体倦怠乏力，食减，嗜睡，心悸，失眠，服用本发明的臭氧化橄榄油每天1粒，随访症状减轻好转。2、韩某，女，成年，疲乏2周，四肢倦怠乏力，心悸，头晕，站久头晕，易出汗，服用本发明的臭氧化橄榄油，随访症状好转、大减。3、杨某，男，成年，疲乏2日，肢体乏力，神疲，心悸，食减，头晕，睡眠不佳，易感冒，服用本发明的臭氧化橄榄油每天1粒，连续服用3周，随访症状减轻、好转、治愈。4、高某，女，成年，疲乏数日，四肢倦怠乏力，嗜睡，神疲，眼花，视力下降，服用本发明的臭氧化橄榄油每天1粒连续三周后，随访症状好转、治愈。实施例13提高缺氧耐受力保健功效的实验研究小鼠耐缺氧实验1、药效学动物实验选取小白鼠60只，随机分为三组，每组20只。本发明所述的臭氧化橄榄油0.125ml为实验组，以橄榄油为空白对照组，以滋补强壮药金匮肾气丸为阳性对照组，经动物(小白鼠)实验，耐缺氧实验结果如下(见表1)。表1缺氧状态下小鼠存活时间注：与空白对照组相比，＊p＜0.05；＊＊p＜0.01。由上表可以看出，口服臭氧化橄榄油实验组与空白对照组之间有非常显著的差异。实验组与金匮肾气丸对照组无显著差异，但实验组小鼠存活时间长于金匮肾气丸对照组。说明本臭氧化橄榄油具有较强的耐缺氧作用，并且优于金匮肾气丸。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。当前第1页12