本发明涉及一种药物的制备方法，尤其涉及一种治疗酒精性肝损伤的药物的制备方法。
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：：随着人们生活水平的提高和生活方式的改变，人群中嗜酒者出现增多和年轻化趋势。在我国饮酒已成为导致肝损害的第二大病因，仅次于肝炎病毒感染。长期大量饮酒可以引起酒精性肝病（alcoholicliverdisease，ALD），表现为早期酒精性脂肪肝，继而可发展为酒精性肝炎、酒精性肝纤维化，最终发展为酒精性肝硬化，甚至肝癌。目前，临床上针对ALD的常用药虽然有一定的疗效，但都不同程度地存在毒副作用大、治疗靶点单一和费用昂贵等缺点，而中药以其疗效显著、副作用相对较少的特点，越来越受到人们重视，为ALD的治疗提供了一条崭新的思路。柽柳（TamarixchinensisLour）是一种柽柳属植物，其化学成分主要为黄酮类、三萜类、有机酸及挥发油等，具有保肝、抗炎、抗氧化、抑菌、抗肿瘤等生物活性。柽柳对多种类型的肝脏损伤具有保护作用，如四氯化碳，乙酰氨基酚等药物诱导的肝损伤，而关于其解酒的功效，早在我国古代的医学著作《本草纲目》、《本经逢原》、《药性纂要》中就有相关记载，但是目前关于柽柳在ALD中的应用及作用机制的研究较少。技术实现要素：本发明就是针对上述问题，提出一种治疗酒精性肝损伤的药物的制备方法，该药物以柽柳为主要原料，该药物治疗酒精性肝损伤疗效显著、副作用较少。为达到上述技术目的，本发明采用了一种治疗酒精性肝损伤的药物的制备方法，主要采用春季柽柳的细嫩枝叶作为药物原料，其具体制作步骤如下：（1）采用春季柽柳细嫩枝叶，干燥后粉碎，过80目筛，提取条件为料物比=1:10（g/ml）；（2）在80%乙醇中浸泡2-3天，用滤纸过滤除去不溶物，无菌滤器除菌，用旋转蒸发仪除去乙醇；（3）收集提取物，密封、避光、冷藏备用。在本发明中，所述的柽柳乙醇提取物主要成分包括黄酮类化合物及三萜类化合物。本发明的药物采用全天然原料制作而成，对治疗酒精性肝损伤疗效显著、副作用较少。附图说明图1所示的是本发明的实验中小鼠肝脏损伤指标的变化示意图；图2所示的是本发明的实验中小鼠肝脏中氧化应激指标的变化。具体实施方式下面结合附图具体实施方式对本发明作进一步详细地说明。一种治疗酒精性肝损伤的药物的制备方法，主要采用春季柽柳的细嫩枝叶作为药物原料，其具体制作步骤如下：（1）采用春季柽柳细嫩枝叶，干燥后粉碎，过80目筛，提取条件为料物比=1:10（g/ml）；（2）在80%乙醇中浸泡2-3天，用滤纸过滤除去不溶物，无菌滤器除菌，用旋转蒸发仪除去乙醇；（3）收集提取物，密封、避光、冷藏备用。在本发明中，所述的柽柳乙醇提取物主要成分包括黄酮类化合物及三萜类化合物。为了证明本发明药物的使用安全性，本发明的药物采用小鼠作为实验品进行了验证。具体描述如下：1、准备材料及器具（1）动物和饲料：SPF级雄性C57BL/6J小鼠共80只，6-8周龄，22-25g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号SCXK2014-0004，饲养于山东省医学科学院基础研究所实验动物房IVC（智能型独立送回风净化笼具）中，室温22-25℃，相对湿度55%-60%，光暗周期12h/12h，每隔1天换一次垫料。Lieber-DeCarli酒精液体饲料和对照饲料购自南通特洛菲饲料科技有限公司。（2）试剂与仪器，兔抗鼠NLRP3（Lot.No.84111P141）、Caspase-1（Lot.No.10N318）抗体购自博士德生物公司，兔抗鼠ASC抗（Cat.No.1050-1-AP）购自Proteintech公司，兔抗鼠IL-1β抗体（Lot.No.GR264200-1）购自Abcam公司，Percoll分离液购自Solarbio公司，辣根酶标记山羊抗兔IgG购自中杉金桥公司，SABC免疫组化试剂盒购自博士德生物公司，谷丙转氨酶（glutamicpyruvictransaminase，ALT）、谷草转氨酶（glutamicoxaloacetictransaminase，AST）、甘油三酯（triglyceride，TG）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）试剂盒均购自南京建成公司。LeicaDM4000B光学显微、LeicaQWinV3图像分析软件购自德国徕卡仪器有限公司，荧光酶标仪购自美国Biotek公司。2、使用方法（1）小鼠ASH模型的建立及分组给药，采用慢性酒精喂养加急性酒精灌胃法（NIAAA法）建立小鼠酒精性肝损伤模型，主要过程为：液体饲料适应喂养5d、酒精液体饲料造模10d、酒精灌胃1次。小鼠随机分为5组：①正常对照组（Ctrl）：每天给予对照液体饲料（不含酒精），保持小鼠每天热量摄入与模型组一致；②模型组（EtOH）：给予Lieber-DeCarli酒精液体饲料；③阳性对照组（EtOH+GSH）：给予Lieber-DeCarli酒精液体饲料，还原型谷胱甘肽200mg-1·kg-1·d-1；④柽柳低剂量组（EtOH+T.-L）：给予Lieber-DeCarli酒精液体饲料，柽柳100mg-1·kg-1·d-1；⑤柽柳高剂量组（EtOH+T.-H）：给予Lieber-DeCarli酒精液体饲料，柽柳200mg-1·kg-1·d-1。柽柳灌胃给药，GSH腹腔注射给药，在造模期连续给药10d。实验期间每天观察各组小鼠的精神活动、反应能力、毛色等一般状态。（2）取材，造模结束后，模型组小鼠用31.5%（V/V）的酒精灌胃一次，对照组用等热量的麦芽糖糊精灌胃，9h后称重，摘眼球取血，颈椎脱臼处死小鼠，取肝脏称重，一部分用于流式细胞检测，一部分用4%中性甲醛固定，剩余肝脏组织分装保存于-80℃冰箱待检。根据公式：肝脏系数=肝重/小鼠体重×100%，计算肝脏指数。（3）血清和肝组织相关指标检测，按照试剂盒说明书测定血清ALT和TG活性，用生理盐水制备10%的肝脏匀浆，按照试剂盒说明书测定肝脏匀浆上清液中AST、MDA含量及SOD活力。（4）肝脏组织形态学及组织中脂质沉积检测将已固定组织脱水，石蜡包埋，切片，进行HE染色，显微镜下观察肝脏组织病理改变，取肝脏组织制作冰冻切片，油红O避光染色30min，60％异丙醇冲洗后进行苏木素染色，明胶封片，光学显微镜下观察细胞内脂质蓄积情况。（5）免疫组化法检测NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β的表达及结果判定，将小鼠肝组织石蜡切片经30%H2O2溶液灭活内源性过氧化物酶、柠檬酸缓冲液微波抗原修复、10%山羊血清封闭后，滴加一抗4℃孵育过夜，1×PBS洗3遍，再经生物素标记的山羊抗兔IgG37℃孵育1小时，1×PBS洗4遍，之后滴加SABC试剂，然后DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，镜下观察。同时设阴性对照，用PBS代替一抗或二抗。判定标准：在C57BL/6J小鼠肝脏中，NLRP3、ASC、Caspase-1主要表达于胞浆，IL-1β表达在胞浆、胞膜和细胞间隙，我们将胞浆内存在不同程度黄色颗粒的细胞判定为阳性细胞。参考双评分半定量法对染色结果进行评分，在400倍高倍镜下随机选取10个视野，根据染色强度和阳性细胞所占百分比例进行判定：阳性细胞区域分4级，阳性率<10%为1级计1分，10%-50%为2级计2分，50-80%为3级计3分，>80%为4级计4分。染色强度按以下标准评分:细胞无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两种评分相加记为免疫组化染色评分，0分为阴性(—)，1-2分为弱阳性(+)，3-4分为中等阳性(++)，4分以上为强阳性(+++)。3、统计学处理数据用表示，两组间数据比较用t检验，多组资料间比较采用方差分析，免疫组化染色评分分析采用秩和检验。用SPSS17.0软件进行数据分析，P<0.05为差异具有统计学意义。所有试验结果均重复3次。4、结果（1）柽柳对酒精性肝损伤小鼠体重和肝脏指数的影响，建模前后各组小鼠体重差异均无统计学意义。与正常对照组相比，模型组小鼠肝脏重量有升高趋势。肝脏指数在一定程度上可以反映肝脏受损伤情况，与正常对照组比较，模型组肝脏指数显著升高（P<0.05），差异有统计学意义；与模型组相比，柽柳高、低剂量组小鼠肝脏指数呈降低趋势，其中高剂量组差异有统计学意义（P<0.05），见表1。表1柽柳对小鼠体重、肝重及肝脏指数的影响Tab.1EffectsofT.chinensisLouronbodyweight,liverweightandliverindexofmice*p<0.05vs.正常对照组；#p<0.05vs.模型组。*p<0.05vs.Normalcontrolgroup;#p<0.05vs.EtOHgroup.（2）柽柳对酒精性肝损伤小鼠肝脏组织病理改变的影响，正常小鼠肝脏无明显的脂滴形成，肝小叶结构正常；模型组小鼠肝脏内弥漫性脂肪变性，大部分肝细胞内充满大小不等、分布不均的脂滴空泡并伴有炎细胞浸润。柽柳高、低剂量组肝脏脂肪变性和炎细胞浸润情况均有所减轻，脂肪空泡明显减少，与阳性对照组效果一致，甚至优于阳性对照组。（3）柽柳对酒精性肝损伤小鼠ALT、AST、和TG的影响，与正常对照组相比，模型组小鼠血清ALT（311.2±81.5vs.31.4±3.0，P<0.05）、肝脏AST（484.8±131.4vs.155.1±11.0，P<0.05）和血清TG（2.1±0.3vs.1.2±0.1，P<0.05）水平均显著升高，差异有统计学意义；与模型组相比，柽柳高、低剂量组小鼠血清ALT（高剂量67.3±17.1vs.311.2±81.5，P<0.01、低剂量82.0±25.6vs.311.2±81.5，P<0.01）、肝脏AST（高剂量205.2±29.1vs.484.8±131.4，P<0.01、低剂量220.6±50.0vs.484.8±131.4，P<0.01）水平均显著降低，差异有统计学意义。但是，与肝组织油红O染色结果有所不同的是，柽柳高、低剂量组小鼠血清（高剂量1.9±0.7vs.2.1±0.3、低剂量2.0±0.4vs.2.1±0.3）含量没有明显的改变，见图1。（4）柽柳对酒精性肝损伤小鼠肝组织MDA和SOD的影响，与正常对照组比较，模型组小鼠肝脏MDA（11.1±1.8vs.7.5±0.7，P<0.05）的含量显著升高，SOD（191.3±28.4vs.263.2±14.7，P<0.05）的活性显著降低，差异有统计学意义；与模型组相比，柽柳高、低剂量组小鼠肝脏MDA（高剂量7.3±0.8vs.11.1±1.8，P<0.05、低剂量8.5±1.0vs.11.1±1.8，P>0.05）的含量均呈降低趋势，SOD（高剂量290.0±113.3vs.191.3±28.4，P<0.05、低剂量229.4±9.6vs.191.3±28.4，P>0.05）活性均呈升高趋势，其中柽柳高剂量组中两项指标结果差异有统计学意义，见图2。（5）柽柳对酒精性肝损伤小鼠肝组织NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β的影响，在小鼠肝脏中，NLRP3、ASC、Caspase-1主要表达在胞浆，而IL-1β是分泌性蛋白，可以表达在胞浆也可表达在胞膜或者胞外，阳性表达者镜下可观察到棕黄色颗粒。NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β在各组表达趋势相同，二氨基联苯胺（DAB）显色后，正常对照组小鼠肝脏细胞无特异性染色；模型组出现棕黄色特异性染色，特异性染色范围广且深，主要集中在肝小叶中央静脉周围；与模型组相比较，柽柳高、低剂量组特异性染色范围显著缩小，染色强度显著减弱，差异有统计学意义（P<0.05），且柽柳高剂量组比柽柳低剂量组变化程度更为明显，NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β在柽柳高、低剂量组的表达水平接近阳性对照组，甚至比阳性对照组表达更低，见表2、3、4、5。表2各组小鼠肝脏中NLRP3的表达情况Tab2.ExpressionofNLRP3inliverofmiceineachgroup*p<0.05vs.正常对照组；#p<0.05vs模型组。同样适用于以下表格。*p＜0.05vs.Normalcontrolgroup;#p＜0.05vsethanolgroup.Thesameappliestothefollowingtables。表3各组小鼠肝脏中ASC的表达情况Tab.3ExpressionofASCinliverofmiceineachgroup表4各组肝脏中Caspase-1的表达情况Tab.4ExpressionofCaspase-1inliverofmiceineachgroup表5各组肝脏IL-1β的表达情况Tab.5ExpressionofIL-1βinliverofmiceineachgroup。当前第1页1 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