本发明涉及药学领域，具体涉及一种药物组合物、其制备方法及应用。
背景技术：
近年来，有关天然药物治疗自身免疫性疾病的相关研究是药学界的研究热点。从目前对天然药物治疗自身免疫病的相关药理学研究来看，天然药物比目前临床使用的西药有着明显的优势，其主要是通过免疫抑制、免疫调节、抗氧化、诱导细胞凋亡及影响神经递质而发挥治疗自身免疫疾病的作用。天然药物的免疫药理作用不是独立于其他功能的单一作用，而是紧密与神经、内分泌、免疫调节网络相联系的统一的功能体系。因此，国内外把从自然界中寻找治疗自身免疫性疾病的药物作为此类药物研究的首选方法。
南方红豆杉(Taxus chinensis var.mairei)又称美丽红豆杉，系裸子植物亚门松杉纲红豆杉目红豆杉科红豆杉属植物，特产于我国，主要分布于长江流域、南岭山脉山区以及河南、陕西(秦岭)、甘肃等省的山地或溪谷，是红豆杉属中生长最快、分布最广的植物。
南方红豆杉根提取物以南方红豆杉的干燥根为提取部位，其化学成分众多，主要含有二萜类化合物、甾体类化合物、木脂素以及黄酮类化合物等几类成分。目前已发现南方红豆杉根提取物具有显著的抗肿瘤和抗炎活性，但尚未有免疫抑制活性的报道。
目前用于免疫抑制治疗的药物有四大类：化学制剂、激素、真菌代谢产物和中药，而化学制药和真菌代谢产物具有较强的细胞亚选择性，激素的副作用大，长期使用会引起代谢紊乱，诱发或加重感染，而中药相对安全且有效。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种药物组合物、其制备方法及应用，所述药物组合物有免疫抑制活性的作用，对细胞的毒副作用小，具有广泛的应用前景。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括南方红豆杉根提取物和药学上可接受的载体，其中，所述南方红豆杉根提取物的重量百分比为0.1-99.9％，例如可以是0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.8％、1％、2％、5％、8％、10％、13％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、98％、99％或99.9％。
本发明中，南方红豆杉根提取物化学成分众多，有着传统中药复方配伍使用的效果，由于南方红豆杉根提取物中含有木脂素、黄酮类等非细胞毒性化合物，对细胞能起到一定的保护作用，相比于单一的免疫抑制活性药或单一的紫杉醇，毒副作用小，对细胞生长的抑制率远远低于免疫抑制活性药物对细胞生长的抑制率，且没有副作用。
优选地，所述南方红豆杉根提取物的重量百分比为1-90％，优选为20-85％，进一步优选为40-80％。
优选地，所述南方红豆杉根提取物为水提取物、醇提取物或中药浸膏中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述药学上可接受的载体为甘露醇、山梨醇、山梨酸或钾盐、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素A、维生素C、维生素E、维生素D、氮酮、EDTA二钠、EDTA钙钠、一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐及其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、丙二醇、乙醇、土温60-80、司班-80、蜡、羊毛脂、液体石蜡、十六醇、没食子酸酯类、琼脂、三乙醇胺、碱性氨基酸、尿素、尿囊素、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、β-环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、植物油、磷脂、聚乙二醇磷脂及其衍生物、油酸及油酸盐、抗氧化剂、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、维生素C或离子络合剂中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述植物油为大豆油、中链油、橄榄油、茶油、棕榈油、当归油、沙棘油、莪术油、川芎油、薏米仁油、红花油、花椒油、大蒜油中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂、氢化蛋黄卵磷脂、氢化大豆磷脂、人工合成磷脂中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述聚乙二醇磷脂为聚乙二醇-脑磷脂、聚乙二醇-胆固醇、聚乙二醇-二-脂肪酸甘油酯、聚乙二醇-脂肪酸酯、聚乙二醇-脂肪胺或聚乙二醇-脂肪醇中的任意一种或至少两种的混合物。
优选地，所述抗氧化剂为维生素E。
优选地，所述药物组合物为片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂或贴剂中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的药物组合物的制备方法，所述南方红豆杉根提取物的提取方法为水提、醇提、酯提、酮提、层析、真空提取、超临界流体萃取法、超声提取法、酶法提取、微波提取法、荷电提取法或半仿生提取法中的任意一种或至少两种的组合，优选为水提。
优选地，所述南方红豆杉根提取物的提取方法包括以下步骤：
取南方红豆杉根，加水煎煮，过滤，滤液减压浓缩，用95％乙醇沉淀，冷藏静置24小时，过滤，取滤液回收乙醇，冷藏静置24小时，过滤，取滤液通过树脂柱，水洗至近无色，用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，浓缩即得。
优选地，所述南方红豆杉根与水的重量比为1：(5-15)，例如可以是1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14或1：15，优选为1：(9-12)。
优选地，所述煎煮的次数为2-5次，例如可以是2次、3次、4次或5次，优选为3次。
优选地，所述煎煮的时间为2-5h，例如可以是2h、3h、4h或5h，优选为2h。
优选地，所述浓缩的浓缩液每1ml相当于原生药1-2g。
优选地，所述沉淀后乙醇的体积比为40-70％，例如可以是40％、41％、42％、43％、45％、48％、50％、52％、55％、58％、60％、62％、65％、68％、69％或70％，优选为60％。
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的药物组合物在制备免疫药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提取的南方红豆杉根提取物相比于南方红豆杉其他部位的提取物具有特定的免疫抑制作用，且制备的药物对细胞的毒性低，对脾细胞生长抑制率只有11.3％；
(2)本发明的药物制备工艺简单，药效显著，体外实验中对B细胞转化抑制率可达39.5％，对T细胞转化抑制率可达44.6％，且体内实验中对小鼠耳重抑制率可达32.4％，对胸腺指数抑制率可达22.4％，对脾脏指数抑制率可达15.2％，可见本发明药物具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂使用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1本发明药物组合物的制备
所述南方红豆杉提取物的提取方法包括以下步骤：
取南方红豆杉根，加10倍水量煎煮三次，每次2小时，合并煎煮液，过滤，滤液减压浓缩至每1ml相当于原生药1-2g，用95％乙醇沉淀至含醇量达60％，冷藏静置24小时，过滤，取滤液回收乙醇，冷藏静置24小时，过滤，取滤液通过大孔树脂柱，水洗至近无色，用75％乙醇洗脱，收集洗脱液，过滤，浓缩即得。
将提取得到的南方红豆杉根提取物与聚乙二醇混合后制作成胶囊剂药物。
实验例2体外验证
实验分为空白对照组(只加入细胞液)，Con A组，LPS组，给药A组(仅加受试药物)，给药B组(加Con A和受试药物)，给药C组(加LPS和受试药物)。
(1)将小鼠脾取出后碾碎，过筛，用RPMI 1640培养液冲洗3遍。
(2)用红细胞裂解液裂解红细胞，1000转/min离心5min。离心后PBS重悬，计数细胞。
(3)接种细胞到96孔细胞培养板中，1×106细胞/孔。
(4)空白对照组、Con A组、LPS组，只加入培养液100μL。给药A、B、C组则加入受试药物的RPMI1640培养液100μL。1h后Con A组和给药B组加入ConA(终浓度为5μg/mL)，LPS组和给药C组加入LPS(终浓度为10μg/mL)，置5％CO2，37℃培养72h。
(5)在终止培养前4h，向各组均加入MTT(终浓度为5mg/mL)，4h后加入100μL DMSO，在酶标仪570nm处读取OD值。给药组根据相关的对照实验，分别计算脾细胞生长抑制率、B细胞转化抑制率、T细胞转化抑制率。
活性结果如下表1所示。
表1
注：Dex为阳性对照药地塞米松
由表中结果可见，给药浓度50μg/mL时，本发明药物相对于对照药毒性较低，且能明显抑制B细胞，T细胞转化，抑制效果与10μM对照药地塞米松相当，具有明显的免疫抑制活性，而同样对红豆杉叶提取物也做了上述验证实验，虽然其对细胞毒性也比较低，但是对B细胞和T细胞的转化基本没有抑制作用，可见由红豆杉根提取物制备的本发明药物对小鼠脾脏淋巴细胞增殖和转化具有免疫抑制活性。
实验例3体内验证
二硝基氟苯是一种半抗原，将其涂抹于腹部皮肤后与皮肤蛋白结合成完全抗原使皮肤致敏，24h后加强一次，致敏第5天再将其涂抹于耳部，引起迟发型变态反应。实验目的在于观察化合物对小鼠变应性皮炎的抑制作用，初步评价其免疫抑制活性。
实验方法：选用ICR小鼠，随机分为正常对照组、模型对照组、给药组，每组10只。受试提取物每天给药。腹部脱毛，将1％DNFB均匀涂在腹部致敏，24h后相同方法加强一次，致敏第5天，将1％DNFB均匀涂抹于小鼠右耳进行攻击，24h后处死小鼠，剪下左右耳，用直径8mm铳子制成耳片，称重，以左右耳片重量差表示肿胀度，计算肿胀抑制率(％)。
活性结果如下表2所示。
表2
注：与模型组相比，*p﹤0.05
表中结果显示，本发明药物在口服100mg/kg剂量下表现出明显的免疫抑制活性。
综上所述，本发明的红豆杉根提取物作为一种天然药物，不仅对细胞的毒性低，不抑制细胞的生长，且具有较强的免疫抑制作用，可作为免疫抑制剂使用，有望取代激素类药物，具有广阔的应用前景。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。