本发明涉及一种具有镇静催眠作用的中药提取物，特别是一种夏枯草提取物，还涉及该夏枯草提取物的制备方法和用途。
背景技术：
失眠是指患者对睡眠时间和/或质量不满足、并影响日间社会功能的一种主观体验。临床上对于失眠的干预方式，分为非药物治疗和药物治疗。非药物治疗是针对失眠的有效心理行为，治疗方法主要是认知行为治疗(cbt-i)。目前，国内能够从事心理行为治疗的专业资源相对匮乏，具有这方面专业资质认证的人员不多。单纯采用cbt-i也会面临依从性问题。因此，药物干预仍然占据失眠治疗的主导地位。关于药物治疗，目前临床治疗失眠的药物主要包括苯二氮卓类受体激动剂、褪黑素受体激动剂和具有催眠效果的抗抑郁药物。这些药物具有较强的依赖性，长期使用需要不断加大剂量。抗组胺药物(如苯海拉明)、褪黑素以及缬草提取物虽然具有催眠作用，但是现有的临床研究证据有限，不宜作为失眠常规用药。
失眠在中医学中称不寐、不得眠、目不暝、不得卧、卧寐不安等。不寐之故，或因邪气所扰，或为痰气阻滞，或阴不涵阳，或心肝火扰。“虽非一种，总是阳不交阴所致”，故，欲得安卧，须交其阴阳，或祛其邪、或消其痰、或养其阴，或清其热。夏枯草禀阴之体，赋阳之用。明代王肯堂《灵兰要览》(1602年)，书中记载：“椿田每用制半夏、夏枯草各五钱，取阴阳相配之义，浓煎长流水，竟覆杯而卧。”正鉴于此机理，医学界关于半夏与夏枯草配伍组成的处方治疗失眠的研究较多，而单独采用夏枯草治疗失眠的报道较少。
中国专利文献cn101507751a公开了夏枯草提取物在制备治疗失眠药物中的用途，发现夏枯草经乙醇提取，再用石油醚脱脂后得到的夏枯草提取物具有明显的镇静、催眠活性。该文献认为，夏枯草中具有镇静催眠作用的组分为醇提取物中极性较大的组分，因而采用石油醚除去了低极性组分。
技术实现要素：
本申请的发明人经研究发现，夏枯草中采用特定方法制得的有效部位具有十分显著的镇静催眠作用。
本发明的目的在于提供一种夏枯草提取物的制备方法，采用该方法制备得到的夏枯草提取物具有更佳的预防和治疗失眠的效果。
本发明的另一目的在于提供采用上述制备方法制备得到的夏枯草提取物。
本发明的再一目的在于提供含有所述夏枯草提取物的中药制剂。
本发明的又一目的在于提供所述夏枯草提取物的制药用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的。
一种夏枯草提取物的制备方法，包括如下步骤：
(1)用水或乙醇水溶液作为提取溶剂提取夏枯草，得到夏枯草粗提物，所述乙醇水溶液中的乙醇浓度为20～95vol％；
(2)将所述夏枯草粗提物置于大孔树脂柱，依次采用第一洗脱剂、第二洗脱剂和第三洗脱剂进行梯度洗脱，收集第三洗脱剂洗脱后的洗脱液；所述第一洗脱剂为水，所述第二洗脱剂是乙醇浓度为10～30vol％的乙醇水溶液，所述第三洗脱剂是乙醇浓度为50～95vol％的乙醇水溶液；
(3)将第三洗脱剂洗脱后的洗脱液浓缩、干燥，得到夏枯草提取物。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，所述乙醇水溶液的乙醇浓度为50～80vol％。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中，所述提取溶剂为水；步骤(2)中，所述第三洗脱剂是乙醇浓度为50～60vol％的乙醇水溶液。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(1)中所述提取溶剂为乙醇水溶液，步骤(2)中所述第三洗脱剂是乙醇浓度为65～75vol％的乙醇水溶液。
根据本发明的制备方法，优选地，步骤(2)中，以水作为分散剂，将所述夏枯草粗提物制成上样液，并将所述上样液置于大孔树脂柱；其中，所述上样液中的夏枯草粗提物含量为10～50g/100ml。
根据本发明一种优选的实施方式，所述制备方法包括如下步骤：
(1)用水作为提取溶剂提取夏枯草，得到夏枯草粗提物；提取方法为加热回流法或超声提取法，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～2小时，每次提取溶剂的用量是夏枯草的重量的5～25倍；
(2)将所述夏枯草粗提物置于大孔树脂柱，依次采用第一洗脱剂、第二洗脱剂和第三洗脱剂进行梯度洗脱，收集第三洗脱剂洗脱后的洗脱液；所述第一洗脱剂为水，其用量为所述上样液的体积的1.5～2.5倍；所述第二洗脱剂为乙醇浓度为15～25vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液的体积的2～4倍；所述第三洗脱剂为乙醇浓度为50～60vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液的体积的4～7倍；
(3)将第三洗脱剂洗脱后的洗脱液浓缩、干燥，得到夏枯草提取物。
根据本发明一种优选的实施方式，所述制备方法包括如下步骤：
(1)用乙醇浓度为50～80vol％的乙醇水溶液作为提取溶剂提取夏枯草，得到夏枯草粗提物；提取方法为超声提取或加热回流提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～2小时，每次提取溶剂的用量是夏枯草的重量的5～25倍；
(2)将所述夏枯草粗提物置于大孔树脂柱，依次采用第一洗脱剂、第二洗脱剂和第三洗脱剂进行梯度洗脱，收集第三洗脱剂洗脱后的洗脱液；所述第一洗脱剂为水，其用量为所述上样液的体积的1.5～2.5倍；所述第二洗脱剂是乙醇浓度为15～25vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液的体积的2～4倍；所述第三洗脱剂是乙醇浓度为65～75vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液的体积的4～7倍；
(3)将第三洗脱剂洗脱后的洗脱液浓缩、干燥，得到夏枯草提取物。
本发明还提供根据上述制备方法制得的夏枯草提取物。
本发明还提供一种用于治疗失眠的中药制剂，所述中药制剂包括所述夏枯草提取物和药学上可接受的辅料。
本发明还提供上述夏枯草提取物用于制备预防或治疗失眠的药物的用途。
采用本发明方法制备得到的夏枯草提取物具有预防和治疗失眠的作用；特别是根据本发明优选的制备方法得到夏枯草提取物，作用更加显著。
具体实施方式
下面对本发明进行更详细的说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明中，所述夏枯草为唇形科植物夏枯草prunellavulgarisl.的干燥果穗。
本发明中，乙醇水溶液的百分含量“vol％”是指体积百分含量。
本发明的夏枯草提取物的制备方法包括夏枯草提取步骤和洗脱步骤。
<提取步骤>
本发明的夏枯草乙醇提取步骤中，用水或乙醇水溶液作为提取溶剂提取夏枯草，得到夏枯草粗提物。
在本发明中，提取溶剂的用量可以是所述夏枯草的重量的2～30倍，优选为5～25倍，更优选为10～25倍。根据本发明一种特别优选的实施方式，提取溶剂的用量是所述夏枯草重量的15～22倍。
当采用水作为溶剂时，提取方法可以选自煎煮法、加热回流法、超声提取法等。当采用乙醇水溶液作为溶剂时，提取方法可以选自浸渍法、加热回流法、超声提取法、渗漉法等，优选为超声提取法或渗漉法。所述渗漉法可以为单渗漉法、重渗漉法、加压渗漉法、逆流渗漉法中的任一种或几种。当采用加热回流法或超声提取法时，优选地，提取次数为1～4次，优选为1～3次，更优选为1～2次。优选地，每次提取时间为0.5～4小时，优选为1～3小时，更优选为1～2小时。
当采用乙醇水溶液作为提取溶剂进行提取时，所述乙醇水溶液的浓度可以为20～95vol％，优选为50～80vol％的乙醇水溶液，再优选为55～75vol％的乙醇水溶液。根据本发明一种特别优选的实施方式，所述乙醇水溶液的浓度为60～70vol％。
需要说明的是，本发明中，当采用乙醇水溶液作为提取溶剂，且提取次数大于1时，每次采用的提取溶剂不限定为相同浓度的乙醇水溶液，可以是本发明范围内的任意浓度的乙醇水溶液。
根据本发明一种优选的实施方式，所述溶剂为水，提取方法为加热回流法或超声提取法，优选地，提取次数为1～3次，更优选为2次。优选地，每次提取时间为1～3小时，更优选为1～2小时，再优选为1小时。
根据本发明另一种优选的实施方式，所述溶剂为乙醇水溶液，提取方法为超声提取法，优选地，提取温度为15～60℃，更优选为20～55℃，再优选为35～45℃。优选地，提取次数为1～3次，更优选为2次。优选地，每次超声提取时间为1～3小时，更优选为1～2小时，再优选为1小时。
用水或乙醇水溶液作为溶剂提取夏枯草，将提取液浓缩，经进一步干燥或不经干燥后，得到所述夏枯草粗提物。根据本发明的一种实施方式，提取溶剂为水，将提取液浓缩至一定体积，不经干燥，得到夏枯草粗提物，该液态的夏枯草粗提物直接进入洗脱步骤。根据本发明的一种优选的实施方式，提取溶剂为水，将提取液浓缩、干燥，得到夏枯草粗提物。根据本发明的另一种优选的实施方式，提取溶剂为乙醇水溶液，将提取液浓缩、干燥，得到夏枯草粗提物。
<洗脱步骤>
以水作为分散剂，将提取步骤中得到的夏枯草粗提物制成上样液，置于大孔树脂柱。当提取步骤中得到的夏枯草粗提物为水提液时，可以不再加水，或加适量水，直接作为上样液置于大孔树脂柱进行洗脱。当提取步骤中得到的夏枯草粗提物为干燥后的固体时，将该夏枯草粗提物分散于水中，优选为蒸馏水，得到上样液，置于大孔树脂柱进行洗脱。本发明的上样液的固含量可以为10～50g/100ml，优选为20～40g/100ml，更优选为25～35g/100ml。本发明使用的水优选为蒸馏水、去离子水等。
本发明中，大孔树脂柱优选采用适宜弱极性物质分离、纯化的树脂，例如ab-8大孔树脂、d-101型大孔吸附树脂、d-101-i型大孔吸附树脂等，优选为ab-8大孔树脂。
将上样液上样后，依次采用第一洗脱剂、第二洗脱剂和第三洗脱剂进行梯度洗脱，分别得到第一洗脱液、第二洗脱液和第三洗脱液。将第三洗脱剂洗脱后得到的洗脱液浓缩、干燥，得到本发明的夏枯草提取物。
本发明的第一洗脱剂为水，优选为蒸馏水或去离子水。所述第一洗脱剂的用量为所述上样液的体积的1～4倍，优选为1～3倍，更优选为1.5～2.5倍，最优选为2倍。
本发明的第二洗脱剂为乙醇浓度为10～30vol％的乙醇水溶液，更优选为15～25vol％的乙醇水溶液，最优选为20vol％的乙醇水溶液。所述第二洗脱剂的用量为所述上样液的体积的1～4倍，优选为2～4倍，更优选为2.5～3.5倍，最优选为3倍。
本发明的第三洗脱剂是乙醇浓度为50～95vol％的乙醇水溶液，优选为50～75vol％的乙醇水溶液；例如为50vol％、60vol％、70vol％、75vol％、80vol％或95vol％的乙醇水溶液。所述第三洗脱剂的用量为所述上样液的体积的1～10倍，优选为2～8倍，更优选为4～7倍，更优选为4～6倍，最优选为5倍。
需要说明的是，本发明中，所述第三洗脱剂可以是一次洗脱，也可以分两次或更多次洗脱，例如第三洗脱剂依次采用为50vol％的乙醇水溶液和95vol％的乙醇水溶液进行洗脱，得到第三洗脱液。
根据本发明第一种特别优选的实施方式，提取步骤中提取溶剂为水，洗脱步骤中所述第三洗脱剂为50～75vol％的乙醇水溶液，更优选为50～60vol％的乙醇水溶液，最优选为50～55vol％的乙醇水溶液。在该实施方式中，更优选地，提取步骤中提取溶剂为水，提取方法为加热回流法或超声提取法，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～2小时，每次水的用量是夏枯草的重量的5～25倍。在该实施方式中，更优选地，洗脱步骤中，所述第一洗脱剂为水，其用量为所述上样液体积的1.5～2.5倍；所述第二洗脱剂是乙醇浓度为15～25vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液体积的2～4倍；所述第三洗脱剂是乙醇浓度为50～60vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液体积的4～7倍。
根据本发明第二种特别优选的实施方式，提取步骤中提取溶剂是乙醇浓度为50～80vol％的乙醇水溶液，洗脱步骤中所述第三洗脱剂是乙醇浓度为65～80vol％的乙醇水溶液，更优选为65～75vol％的乙醇水溶液，最优选为70～75vol％的乙醇水溶液。在该实施方式中，更优选地，提取步骤中提取溶剂为50～80vol％的乙醇水溶液，提取方式为超声提取或加热回流提取，提取次数为1～3次，每次提取时间为1～2小时，每次提取溶剂的用量是夏枯草的重量的5～25倍。在该实施方式中，更优选地，洗脱步骤中所述第一洗脱剂为水，其用量为所述上样液体积的1.5～2.5倍；所述第二洗脱剂为浓度是乙醇浓度为15～25vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液体积的2～4倍；所述第三洗脱剂是乙醇浓度为65～75vol％的乙醇水溶液，其用量为所述上样液体积的4～7倍。
本申请的发明人发现，采用上述两种特别优选的实施方式，制备得到的夏枯草提取物治疗失眠的效果尤其显著。而在上述两种特别优选的实施方式中，所述第一种方法，即提取步骤采用水提取的制备方法得到的夏枯草提取物治疗失眠效果更优。
<干燥步骤>
将上述第三洗脱液浓缩，干燥，得到本发明的夏枯草提取物。所述浓缩和干燥方法可采用本领域常规方法操作。例如，所述浓缩可采用减压浓缩，回收乙醇。所述干燥可采用蒸干或真空干燥。
<夏枯草提取物制剂>
本发明的夏枯草提取物制剂是采用上述方法制得的夏枯草提取物作为药用原料制得的制剂。具体而言，本发明的夏枯草提取物制剂含有上述制备方法制得的夏枯草提取物，可以不含有或含有其他用于治疗失眠的药用组分或药用原料，并含有药学上可接受的载体。在本发明中，药学上可接受的载体并没有特别限定，具体的实例包括但不限于淀粉、糖粉、糊精、乳糖、微晶纤维素、甘露醇、水(包括注射用水)、植物油等。本发明的药物制剂形式并没有特别限制，可以为经口服、舌下、经皮、经肌肉或皮下、皮肤粘膜、静脉、直肠途径给药的多种剂型，并优选采用舌下、肌肉或皮下、静脉、直肠途径给药的剂型，例如滴丸剂、注射剂、栓剂等。本发明所提供的各种药物剂型均可以以药学常规方法制备而成。
<制药用途>
本发明的夏枯草提取物可用于制备预防或治疗失眠的药物。
采用水或特定浓度的乙醇水溶液提取夏枯草，所得粗提物再置于大孔树脂柱，依次经过水和10～30vol％的乙醇水溶液洗脱除杂后，再经50～95vol％的乙醇水溶液洗脱，所得洗脱液干燥后，得到本发明的夏枯草提取物。本申请意外地发现，上述方法得到的提取物对于治疗失眠具有显著效果，且未见毒副作用。以下提取物治疗失眠的效果尤其显著：(1)提取步骤采用水提取，洗脱步骤中第三洗脱剂采用乙醇浓度为50～60vol％乙醇水溶液洗脱得到的夏枯草提取物；和(2)提取步骤采用乙醇水溶液提取，洗脱步骤中第三洗脱剂采用乙醇浓度为65～75vol％乙醇水溶液洗脱后所得的夏枯草提取物。
以下通过实施例示例性地描述本发明的夏枯草提取物的制备方法，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1-夏枯草提取物a
(1)用水作为提取溶剂提取夏枯草，加热回流提取2次，每次加10倍量水提取1h，合并提取液，提取液减压浓缩，干燥，得到夏枯草粗提物。
(2)将所述夏枯草粗提物分散于去离子水中，得到夏枯草粗提物含量为31g/100ml的上样液，将上样液置于ab-8大孔树脂柱，依次采用2倍体积的去离子水、3倍体积的20vol％乙醇水溶液和5倍体积的50vol％乙醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱。
(3)收集50vol％乙醇水溶液洗脱后的洗脱液，浓缩、干燥，得到夏枯草提取物a。
实施例2-夏枯草提取物b
(1)用70vol％乙醇水溶液作为提取溶剂超声法提取夏枯草，于45℃下超声提取2次，每次加20倍量乙醇水溶液提取1h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，干燥，得到夏枯草粗提物。
(2)将所述夏枯草粗提物分散于水中，得到夏枯草粗提物含量为31g/100ml的上样液，将上样液置于ab-8大孔树脂柱，依次采用2倍体积的去离子水、3倍体积的20vol％乙醇水溶液和5倍体积的70vol％乙醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱。
(3)收集70vol％乙醇水溶液洗脱后的洗脱液，将该洗脱液浓缩，干燥，得到夏枯草提取物b。
实施例3
(1)用水作为提取溶剂提取夏枯草，超声提取3次，超声温度35℃，每次加10倍量水提取1.5h，合并提取液，提取液减压浓缩，干燥，得到夏枯草粗提物；
(2)将所述夏枯草粗提物分散于去离子水中，得到夏枯草粗提物含量为50g/100ml的上样液，将所述上样液置于ab-8大孔树脂柱，依次采用4倍体积的去离子水、2倍体积的15vol％乙醇水溶液和5倍体积的60vol％乙醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱；
(3)收集60vol％乙醇水溶液洗脱后的洗脱液，浓缩，干燥，得到夏枯草提取物。
实施例4
(1)用50vol％乙醇水溶液作为提取溶剂，超声法提取夏枯草，于45℃下超声提取2次，每次加20倍量乙醇水溶液提取1h，合并提取液，减压浓缩至无醇味，干燥，得到夏枯草粗提物；
(2)将所述夏枯草粗提物分散于水中，得到夏枯草粗提物含量为20g/100ml的上样液，将所述上样液置于ab-8大孔树脂柱，依次采用2倍体积的去离子水、4倍体积的25vol％乙醇水溶液和6倍体积的75vol％乙醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱；
(3)收集75vol％乙醇水溶液洗脱后的洗脱液，将该洗脱液浓缩，干燥，得到夏枯草提取物。
实施例5
(1)用乙醇水溶液作为提取溶剂，加热回流提取夏枯草3次，三次提取操作的乙醇水溶液的浓度分别是95vol％、70vol％和20vol％，三次加溶剂量分别是夏枯草药材的10倍量、12倍量、12倍量，提取时间分别是1h、1h、1h，合并提取液，提取液减压浓缩，干燥，得到夏枯草粗提物；
(2)将所述夏枯草粗提物分散于水中，得到夏枯草粗提物含量为25g/100ml的上样液，将所述上样液上ab-8大孔树脂柱，依次采用3倍体积的去离子水、4倍体积的10vol％乙醇水溶液、5倍体积的75vol％乙醇水溶液和5倍体积的90vol％乙醇水溶液作为洗脱剂，进行梯度洗脱；
(3)分别收集75vol％乙醇水溶液洗脱后的洗脱液，和90vol％乙醇水溶液洗脱后的洗脱液，将所述洗脱液混合，浓缩，干燥，得到夏枯草提取物。
以下通过实验例对本发明的夏枯草提取物的药效及安全性进行验证。
实验例
<实验动物、材料和仪器>
以下实验例中，采用的小鼠为健康昆明小鼠，laf/spf级别，体重30～40g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号：scxk(京)2015-000。实验环境为：温度24±0.5℃，湿度保持在60±2％，室内光线控制在正常昼夜节律(早上8时亮灯)，动物自由获取食物和水。
以下实验例中采用的夏枯草提取物a是通过实施例1获得的；夏枯草提取物b是通过实施例2获得的产品。
小鼠自动活动分析系统：采用30cm×30cm×40cm纸箱，内部涂黑，罗技(logitech)c920高清摄像头(1200万像素)记录小鼠活动，采用digbehv动物行为分析系统2.0，上海吉量软件科技有限公司。
<夏枯草提取物毒理学试验>
实验一急性毒性实验
采用健康的昆明小鼠，随机分为10组，每组10只，其中五组给予夏枯草提取物a(加水制成1.31g/ml)，另外5组给予夏枯草提取物b(加水制成1.31g/ml)，均采用腹腔注射。两种药物试验的给药剂量相同，均为依次10.75g/kg、13.44g/kg、16.80g/kg、21.00g/kg和26.25g/kg，人体等效剂量依次为71.59g/60kg、89.50g/60kg、111.88g/60kg、139.84g/60kg和174.81g/60kg。
人体日正常给药剂量为30g/60kg，即0.5g/kg，根据小鼠与人给药剂量换算指数为9.01:1，计算得到夏枯草提取物a的无小鼠死亡剂量相当于人体给药剂量的194.26倍，夏枯草提取物b的无小鼠死亡剂量相当于人体给药剂量的159.5倍。现代药理学认为，动物实验给药为人体给药量的100倍以上，而无明显毒副作用且无迟发毒性反应，即可认为该药无明显毒副作用，因此通过本发明夏枯草提取物的急性毒性实验研究，认为其具有很好的安全性。
实验二长期毒性实验
采用健康的昆明小鼠，随机分为7组，每组20只，雌雄各半。其中1组为空白对照组；3组给予夏枯草提取物a，3组给予夏枯草提取物b，均为各自按0.2ml/20g体重给药，剂量按照最低无死亡剂量及其0.7倍和0.49倍腹腔注射给药，即：夏枯草提取物a：给药剂量分别为10.8g/kg、0.756g/kg、0.529g/kg；夏枯草提取物b：给药剂量分别为10.8g/kg、0.756g/kg、0.529g/kg。均为每日给药2次，时间间隔6小时，连续给药30天。
实验结果如下：
一般症状观察结果：小鼠饮水、进食、外观体征、一般行为活动均正常，连续观察30天，夏枯草提取物a组和夏枯草提取物b组均未见昆明小鼠死亡。
体重观察结果：给药后昆明小鼠活动正常。观察30日内，动物未见死亡，一般状况良好，饮食、二便正常，且外观、皮毛、行为、呼吸均正常，鼻、眼、口腔无异常分泌物，与对照组比较，夏枯草提取物a组和夏枯草提取物b组均未见明显异常反应，差异无统计学差异(p＜0.05)。
解剖观察结果：观察结束后处死昆明小鼠，解剖，肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等各主要脏器色泽、形状、大小等，夏枯草提取物a组和夏枯草提取物b组小鼠均未见异常。
可见，本发明的夏枯草提取物a和夏枯草提取物b，连续给药30天，无明显毒副作用，亦无明显的蓄积毒性，认为夏枯草提取物a和夏枯草提取物b具有很好的安全性。
<夏枯草提取物镇静催眠药效的实验研究>
实验一夏枯草提取物对小鼠自主活动的影响
1实验材料
1.1动物：健康昆明小鼠。
1.2药物：夏枯草提取物a和夏枯草提取物b，分别加水配制成0.14g/ml；安定：0.3g/ml。
1.3仪器：小鼠自主活动分析系统。
2实验方法
2.1分组：随机分为4组，每组10只，依次为去离子水组、安定组、夏枯草提取物a组(以下简称本发明a组)、夏枯草提取物b组(以下简称本发明b组)。
2.2给药：均为腹腔注射药，给药剂量见表1。
表1给药剂量
2.3方法：给药前将小鼠放入自主活动场箱内，适应3min后，连续记录5min自主活动视频，腹腔注射给药后20min，同前法，再次记录小鼠自主活动5min，并通过软件进行分析。
3实验结果
小鼠自主活动总路程见表2。在各组给药前总路程差异无统计学意义。给药后，与去离子水组比较，安定组和本发明a组、本发明b组的小鼠自主活动总路程均显著减少。
表2小鼠自主活动总路程(mm，
**表示与去离子水组相较，p＜0.01
小鼠自主活动时间见表3。在各组给药前活动时间差异无统计学意义。给药后，与去离子水组比较，安定组和本发明a组、本发明b组的小鼠自主活动时间显著减少。
表3小鼠自主活动时间(sec，
**表示与去离子水组相较，p＜0.01
实验二夏枯草提取物对阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡只数影响
1实验材料
1.1动物：健康昆明小鼠。
1.2药物：夏枯草提取物a和夏枯草提取物b，分别加水配制成0.14g/ml；安定：0.3g/ml；戊巴比妥钠：1.8mg/ml。
1.3仪器：小鼠自主活动分析系统。
2实验方法
2.1分组：随机分为4组，每组13只，依次为去离子水组、安定组、夏枯草提取物a组(以下简称本发明a组)、夏枯草提取物b组(以下简称本发明b组)。
2.2给药：均为腹腔注射药。
2.3方法：给药后30min，腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠(18mg/kg)，记录小鼠翻正反射消失和恢复时间，翻正反射消失＞1min记为入睡。
3实验结果
阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡情况结果见表4。
表4阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡情况(n＝13)
**表示与去离子水组相较，p＜0.01
实验三夏枯草提取物对小鼠自主活动的影响
1实验材料
1.1动物：健康昆明小鼠。
1.2药物：夏枯草提取物a和夏枯草提取物b，分别加水配制成0.14g/ml；安定：0.3g/ml；戊巴比妥钠：1.8mg/ml。
1.3仪器：小鼠自主活动分析系统。
2实验方法
2.1分组：随机分为4组，每组10只，依次为去离子水组、安定组、夏枯草提取物a组(简称本发明a组)、夏枯草提取物b组(简称本发明b组)。
2.2给药：均为腹腔注射给药，给药剂量见表5。
表5给药剂量
2.3方法：给药前将小鼠放入自主活动场箱内，适应3min后，连续记录5min自主活动视频。腹腔注射给药后20min，再次将小鼠放入场箱内，同前法，记录小鼠自主活动5min，并通过软件进行分析。
3实验结果
小鼠自主活动总路程见表6。在各组给药前总路程差异无统计学意义。给药后，与去离子水组比较，安定组和本发明a组、本发明b组的小鼠自主活动总路程显著减少。
表6小鼠自主活动总路程(mm，
**表示与去离子水组相较，**p＜0.01，*p＜0.05
小鼠自主活动时间见表7。在各组给药前活动时间差异无统计学意义。给药后，与去离子水组比较，安定组和本发明a组、本发明b组的小鼠自主活动总路程显著减少。
表7小鼠自主活动时间(sec，
*表示与去离子水组比较，p＜0.01。
实验四夏枯草提取物量效关系及半数有效量(ed50)测定
1实验材料
1.1动物：健康昆明小鼠。
1.2药物：夏枯草提取物a，加水配制成0.245g/ml；戊巴比妥钠溶液：1.8mg/ml。
2实验方法
2.1分组：分组随机分为6组，每组10只，给药剂量从小到大，按1:0.7等比级增加，依次为剂量1、2、3、4、5组及去离子水组。
2.2给药：均为腹腔注射药，各组给药剂量见表8。
表8各组给药剂量
2.3方法：给药前将小鼠放入自主活动场箱内，适应5min后，连续记录5min自主活动视频。腹腔注射给药后20min，提前3min将小鼠放入场箱内，再次记录小鼠自主活动5min，并通过软件进行分析。
给药30min后，腹腔注射阈下剂量戊巴比妥钠(18mg/kg)，记录小鼠翻正反射消失和恢复时间，翻正反射消失＞1min记为入睡。
3实验结果
小鼠自主活动总路程见表9。由表可见，夏枯草提取物a不同剂量组之间减少量差异无统计学意义。
表9小鼠自主活动总路程(mm，
*表示与去离子水组比较，p＜0.05
**表示与去离子水组比较，p＜0.01
小鼠自主活动总路程减少百分比结果见表10。由表可见，夏枯草提取物a的不同剂量组之间减少量差异无统计学意义。
表10小鼠自主活动总路程减少百分比(
*表示与去离子水组比较，p＜0.05
**表示与去离子水组比较，p＜0.01
通过spss17.0软件，采用回归分析曲线拟合quadratic(二次模型)，得到回归方程：y＝-1.8749x2+15.845x+46.186，及其决定系数r2＝0.8221，方差分析，f＝4.621，p＝0.178＞0.05，回归方程无统计学意义。因此，各剂量组小鼠活动总路程较空白对照组均明显减少，差异具有统计学意义。各剂量组总路程减少绝对值相较，相差不多，差异无统计学意义。各剂量组总路程减少量占各自百分比相较，相差亦不多，差异无统计学意义，所表现的量效趋势并不明显，所得拟合曲线及回归方差无统计学意义。
阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡情况见表11。
表11阈下剂量戊巴比妥钠致小鼠入睡率(n＝10)
**表示与去离子水组相比，p＜0.01
※※表示与剂量1组相比，p＜0.01
通过spss17.0软件，采用回归分析曲线拟合logarithmic(对数模型)，得到回归方程：y＝64.7ln(x)-12.187，及其决定系数r2＝0.9454，方差分析，f＝51.923，p＝0.006＜0.01，回归方程具有统计学意义。采用probit回归分析，得到夏枯草提取物a半数有效量及其95％可信区间，结果见表12。
表12夏枯草提取物a半数有效量(ed50)及其95％可信区间
注：绝对剂量表示夏枯草提取物的重量。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。