一种布渣叶黄酮碳苷组合物及其制备方法和应用与流程

本发明属于中药、天然药物领域，涉及中药来源的布渣叶黄酮碳苷，更具体的涉及一种布渣叶黄酮碳苷组合物及其制备方法和应用。
背景技术：
：急性肺损伤（acutelunginjury，ali）是各种直接和间接损伤因素导致的肺泡上皮细胞及毛细血管内皮细胞损伤，从而造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，导致急性低氧性呼吸功能不全。ali发展至严重阶段即被称为急性呼吸窘迫综合征（acuterespiratorydistresssyndrome，ards）。目前认为多种效应细胞参与了肺损伤过程，其中，巨噬细胞激活以及中性粒细胞聚集，促进促炎因子的释放，从而造成肺部上皮细胞和内皮细胞损伤。迄今为止，仍然缺乏有效治疗ali的药物。脂多糖（lps，lipidpolysaccharides）是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成分，与细菌内毒素活性密切相关。lps可刺激一些效应细胞产生活性因子，尤其是刺激单核巨噬细胞和内皮细胞产生多种促炎症细胞因子。受lps刺激的细胞所产生的细胞因子，可迅速活化不同组织器官的细胞，导致机体代谢、激素水平和神经内分泌的改变，进而造成细胞功能的异常和不同器官的进行性衰竭。因此，寻找和发现能有效降低lps诱导的生物学毒性的有效成分，对急性肺损伤及肺部炎症药物开发和利用有着重要的科学意义和应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种黄酮碳苷组合物。所述黄酮碳苷类组合物具有改善lps所致模型小鼠急性肺损伤的作用，对肺水肿和肺部炎症具有明显的改善作用，还具有明显降低肺组织炎症因子tnf-α、il-1β和il-6含量的作用，对急性肺损伤及肺部炎症药物开发和利用具有重要的应用价值。本发明的另一目的在于提供所述布渣叶黄酮碳苷组合物的制备方法。本发明的再一目的在于提供所述布渣叶黄酮碳苷组合物的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：一种布渣叶黄酮碳苷组合物，由布渣叶水提取物经大孔树脂吸附后，依次经水洗脱、10%乙醇洗脱后，收集70%乙醇洗脱流份，并对该流份进行酸水解、中和得到过渡产物，对过渡产物用80%乙醇洗脱，分离纯化获得；所述黄酮碳苷组合物包括如下组分：牡荆苷，异牡荆苷，芹菜素-6,8-c-二葡萄糖苷，芹菜素-6-c-阿拉伯糖-8-c-葡萄糖苷，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-阿拉伯苷，芹菜素-6-c-木糖-8-c-葡萄糖苷，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-鼠李糖苷，芹菜素-6-c-鼠李糖-8-c-葡萄糖苷；所述8种组分均为芹菜素碳苷类化合物，其含量之和占黄酮碳苷组合物质量的50%以上。优选地，过渡产物经葡聚糖凝胶柱色谱用80%甲醇进行洗脱。本发明所述布渣叶黄酮碳苷组合物制备的具体步骤为：将布渣叶经水浸提、浓缩后离心得到粗提物，粗提物经大孔树脂吸附后依次采用纯水、10%乙醇溶液、70%乙醇溶液洗脱，取70%乙醇洗脱流份进行酸水解、中和得到过渡产物，对过渡产物用葡聚糖凝胶柱色谱分离，80%甲醇洗脱，洗脱液经制备色谱分离、纯化后即得所述黄酮碳苷组合物。布渣叶水提取液经离心后去除了提取液中的不溶物和部分固形物，选择上清液进行后续的分离过程，避免了不溶物和部分固形物对过柱分离过程的影响。上述步骤中70%乙醇洗脱流份中同时含有黄酮氧苷和黄酮碳苷，将其经过酸水解后，其中黄酮碳苷不发生水解作用，而黄酮氧苷水解成为糖和苷元，水解产生的糖和苷元在后续的纯化过程中从黄酮碳苷中分离出去；酸水解的作用是分离黄酮碳苷和黄酮氧苷，以得到含量较高的黄酮碳苷化合物。所述黄酮碳苷组合物的结构通式如式（i）所示：（i）；所述黄酮碳苷组合物中组分的结构如下表所示：序号化合物r1r21牡荆苷hglc2异牡荆苷glch3芹菜素-6,8-二-c-葡萄糖苷glcglc4芹菜素-6-c-阿拉伯糖-8-c-葡萄糖苷araglc5芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-阿拉伯苷glcara6芹菜素-6-c-木糖-8-c-葡萄糖苷xylglc7芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-鼠李糖苷glcrha8芹菜素-6-c-鼠李糖-8-c-葡萄糖苷rhaglc优选地，所述布渣叶提取物酸水解所用酸为2～10%hcl溶液。更优选地，所述布渣叶提取物酸水解所用酸为5%hcl溶液优选地，所述布渣叶提取物经酸水解时间为0.5～4h。更优选地，所述布渣叶提取物经酸水解时间为2h。优选地，所述布渣叶黄酮碳苷组合物中包括如下质量份数的芹菜素碳苷类化合物：牡荆苷5～25份，异牡荆苷5～25份，芹菜素-6,8-二-c-葡萄糖苷0.5～8份，芹菜素-6-c-阿拉伯糖-8-c-葡萄糖苷0.5～8份，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-阿拉伯苷0.5～8份，芹菜素-6-c-木糖-8-c-葡萄糖苷0.5～8份，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-鼠李糖苷2.5～20份，芹菜素-6-c-鼠李糖-8-c-葡萄糖苷5～25份。更优选地，所述布渣叶黄酮碳苷组合物包括如下质量百分数的芹菜素碳苷类化合物：牡荆苷12±0.5%，异牡荆苷16.4±0.9%，芹菜素-6,8-二-c-葡萄糖苷3±0.6%，芹菜素-6-c-阿拉伯糖-8-c-葡萄糖苷3.6±0.7%，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-阿拉伯苷3.8±0.6%，芹菜素-6-c-木糖-8-c-葡萄糖苷2.9±0.4%，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-鼠李糖苷13.2±1.7%，芹菜素-6-c-鼠李糖-8-c-葡萄糖苷19.7±1.8%。本发明同时还保护了所述布渣叶黄酮碳苷组合物在制备治疗急性肺损伤药物中的应用。优选地，所述布渣叶黄酮碳苷组合物在制备治疗lps诱导的急性肺部损伤药物中的应用。更优选地，所述布渣叶黄酮碳苷组合物在制备治疗肺部炎症药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：本发明中的布渣叶黄酮碳苷组合物中含有总量不少于总质量50%的芹菜素碳苷类化合物，且经实验验证其能有效改善lps所致模型小鼠急性肺损伤，对肺水肿、肺血管通透性、肺部炎症和肺组织中炎症因子tnf-α、il-1β和il-6的含量和表达量有明显的改善作用；其40mg/kg剂量组的改善效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。布渣叶源于药食同源植物，而本发明中的布渣叶黄酮碳苷组合物从布渣叶中提取得到，其组分安全可靠、无毒副作用，其在治疗急性肺损伤药物或肺部炎症药物的开发中具有较好的应用前景。附图说明图1为实施例1中布渣叶黄酮碳苷组合物的提取过程示意图。图2为从布渣叶中提取的布渣叶黄酮碳苷组合物（acgs）的hplc定量分析色谱图及组分含量结果。图3为布渣叶黄酮碳苷组合物（acgs）对lps诱导的急性肺损伤模型小鼠的肺组织病理学作用的观察结果图。图中为肺组织切片h&e染色（x100），其中a为pbs组，b为lps组，c为lps+地塞米松10mg/kg组，d为lps+acgs10mg/kg组，e为lps+acgs20mg/kg组，f为lps+acgs40mg/kg组。图4为布渣叶黄酮碳苷组合物（acgs）对lps诱导的急性肺损伤模型小鼠的肺部水肿和微血管通透性的影响结果。其中（a）为肺部组织的干湿重比；（b）为肺泡灌洗液中性粒细胞的数量；（c）为肺泡灌洗液中总蛋白的浓度；（d）为肺组织髓过氧化物酶mpo的含量。图5为布渣叶黄酮碳苷组合物（acgs）对lps诱导的急性肺损伤模型小鼠的肺组织中炎症因子tnf-α、il-1β和il-6的含量和表达量的影响结果。其中，（a）、（b）、（c）为黄酮碳苷组合物（acgs）对小鼠的肺组织中炎症因子tnf-α、il-1β和il-6表达量的影响结果；（d）、（e）、（f）为黄酮碳苷组合物（acgs）对小鼠的肺组织中炎症因子tnf-α、il-1β和il-6含量的影响结果。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备，除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。实施例1：按照图1所示的过程提取布渣叶黄酮碳苷组合物。取5kg布渣叶，加80l去离子水，加热回流提取2次，每次2小时。提取液经浓缩、3000r/min离心10min，并将上清液调节到约10l后上d101或ab-8大孔树脂柱吸附，然后依次用去离子水、10%乙醇和70%乙醇顺序洗脱，将70%乙醇洗脱液浓缩后用5%hcl-甲醇在80℃条件下水解2h，中和，浓缩后上葡聚糖凝胶lh-20柱层析；以80%甲醇水洗脱，洗脱液经hplc分析，合并含黄酮碳苷的流份，浓缩，得到总黄酮碳苷；再经制备色谱分离（c18柱），用水和甲醇梯度洗脱，洗脱液经280nm波长检测，收集含黄酮碳苷的洗脱液，浓缩并喷雾干燥得到黄酮碳苷组合物（acgs），并用hplc和lc-ms对其进行定性定量分析。布渣叶黄酮碳苷组合物的定性和定量结果如图2所示。从图2中可知，布渣叶黄酮碳苷组合物中，按质量百分数计，各组分及其含量为：芹菜素-6,8-c-二葡萄糖苷（a）3.0±0.6%，芹菜素-6-c-阿拉伯糖-8-c-葡萄糖苷（b）3.6±0.7%，芹菜素-6-c-木糖-8-c-葡萄糖苷（c）2.9±0.4%，牡荆苷（d）12.0±0.5%，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-阿拉伯苷（e）3.8±0.6%，异牡荆苷（f）16.4±0.9%，芹菜素-6-c-葡萄糖-8-c-鼠李糖苷（g）13.2±1.7%，芹菜素-6-c-鼠李糖-8-c-葡萄糖苷（h）19.7±1.8%。以上8种芹菜素碳苷类化合物的质量总和约为74.6%，其质量百分比超过布渣叶黄酮碳苷组合物质量的50%。实施例2:布渣叶黄酮碳苷组合物（acgs）改善lps诱导小鼠急性肺损伤实验实验药品与试剂：脂多糖（e.coli055:b5,sigma公司），mpo试剂盒（南京建成），吉姆萨染色试剂盒（南京建成），bca蛋白定量试剂盒（碧云天）。实验动物：spf级balb/c小鼠，雄性，8～10周龄，由广州中医药大学实验动物中心提供，动物许可证号：scxk（粤）2013-0034。实验方法：8-10周龄雄性balb/c小鼠90只，饲养温度22℃～24℃，湿度60%～65%，12h光照，自由进食饮水。饲养7天后随机分组，每组12只，分为6组，即对照组、lps组、lps+布渣叶黄酮碳苷组合物（acgs）高中低剂量（40mg/kg、20mg/kg、10mg/kg）3组、lps+地塞米松（10mg/kg）组。给药处理：lps+acgs高中低剂量3个组和lps+地塞米松组均在造模前后以灌胃及腹腔注射方式按相应剂量给药3次，即造模手术前一天、造模手术前2h及造模手术后一天分别给药。对照组和lps组灌胃给予处理组同等体积的0.5%羧甲基纤维素钠（cmc-na）。建立lps诱导balb/c小鼠急性肺损伤模型：建模手术当天根据文献方法配制lps-pbs溶液，除对照组气管给予pbs溶液外，其余各组均经气管给予lps-pbs溶液（2mg/kg）构建小鼠急性肺损伤模型。手术后48h处死小鼠取材，收集小鼠血浆、肺组织及肺泡灌洗液（balf）并测定如下指标：（1）组织病理学研究取相同部位的肺叶在冷的pbs溶液中清洗3次，在4%多聚甲醛中固定24h，石蜡包埋，切片（4μm），苏木素和曙红染色，光镜下观察。（2）肺干湿重比的测定取右肺中叶精密称重得到肺湿重，置于60℃的烘箱48h得到肺干重。记录干燥前后的重量，并通过下方公式计算出肺干湿比：肺干湿比=右肺湿重/右肺干重。（3）肺血管通透性检测收集1mlpbs溶液灌洗3次的balf，4℃下1500rpm离心10min。沉淀用pbs（100μl）重悬，瑞氏染色后进行细胞涂片，用于检测中性粒细胞的数目。上清液用elisa测定炎症因子（tnf-α、il-1β和il-6），用bca法测定蛋白质浓度。（4）肺组织mpo的测定mpo活性按照mpo活性测定盒的步骤要求测定，观察在460nm下od值的改变。实验结果（1）组织病理学观察结果6组小鼠肺组织病理切片分析结果见图3。空白对照组（con）的肺组织均呈正常形态：支气管腔内无渗出物，管壁及其周围组织无炎性浸润；肺泡间隔未增厚，无炎性浸润，肺泡腔内物渗出物。lps组的肺组织呈现中度至重度支气管炎及间质性肺炎，易见支气管上皮细胞变性、坏死，腔内亦可见少量坏死细胞及渗出物；肺泡壁增厚，易见大量淋巴细胞，中性粒细胞等炎性浸润。lps+acgs40mg/kg剂量组的肺组织炎性浸润减轻，部分支气管上皮细胞无变性、坏死，腔内未见渗出物。lps+acgs20mg/kg剂量组和10mg/kg剂量组与lps组相比均有一定的改善作用。阳性对照lps+地塞米松10mg/kg组的肺组织可见部分支气管上皮细胞无变性、坏死，肺泡腔内未见渗出物。可知，lps+acgs40mg/kg剂量组与阳性对照lps+地塞米松10mg/kg组的肺组织切片形态接近。（2）肺干湿重比的测定结果6组小鼠肺组织干湿重比的结果见图4（a）。由图可知，与空白对照组相比，小鼠经气管灌注lps（2mg/kg）后肺组织的湿重/干重比显著地升高，提示模型组出现肺水肿；与lps组相比，阳性对照地塞米松5mg/kg组的肺组织湿重/干重比明显降低，黄酮碳苷组合物（acgs）20mg/kg和40mg/kg组的肺组织湿重/干重比同样也能明显降低，且acgs40mg/kg剂量组的降低效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。表明acgs具有有效改善ali肺水肿方面的活性。（3）肺血管通透性检测结果6组小鼠的肺泡灌洗液中中性粒细胞数的检测结果见图4（b）。由图可知，与空白对照组相比，小鼠经气管灌注lps（2mg/kg）后肺泡灌洗液中性粒细胞数显著升高。与lps组相比，阳性对照地塞米松10mg/kg能明显降低肺泡灌洗液中性粒细胞数，acgs20mg/kg和40mg/kg同样也能明显降低肺泡灌洗液中性粒细胞数，且40mg/kg剂量组效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。6组小鼠的肺泡灌洗液中蛋白浓度检测结果见图4（c）。由图可知，与空白对照组相比，小鼠经气管灌注lps（30mg/kg）后肺泡灌洗液中蛋白浓度显著升高。与lps组相比，阳性对照地塞米松10mg/kg能明显降低肺泡灌洗液中蛋白浓度，acgs20mg/kg和40mg/kg同样也能明显降低肺泡灌洗液蛋白浓度，且40mg/kg剂量组效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。（4）肺组织mpo的测定结果6组小鼠的肺组织匀浆液中mpo含量测定结果见图图4（d）。由图可知，与空白对照组相比，小鼠经气管灌注lps（30mg/kg）后肺组织匀浆液中mpo的含量显著升高。与lps组相比，阳性对照地塞米松10mg/kg能明显降低mpo含量，acgs20mg/kg和40mg/kg同样也能明显降低mpo含量，且40mg/kg剂量组效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。由图4中（b）、（c）、（d）可知，acgs40mg/kg剂量组在改善ali中肺部炎症方面的活性与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当，且呈一定的剂量依赖性。acgs对lps诱导的急性肺损伤模型小鼠的肺泡灌洗液中炎症因子tnf-α、il-1β和il-6的含量和表达量的影响结果见图（5）。由图5（a、b、c）结果可见，与空白组相比，小鼠经气管灌注lps（2mg/kg）后肺组织中促炎症因子tnf-α，il-6和il-1β基因表达量显著升高。与lps相比，阳性对照地塞米松10mg/kg能明显降低肺组织中促炎症因子tnf-α，il-6和il-1β的基因表达量，acgs20mg/kg和40mg/kg同样也能明显降低肺组织中促炎症因子tnf-α，il-6和il-1β的基因表达量，且40mg/kg剂量组的降低效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。表明acgs具有有效改善ali中肺部炎症方面的活性，且呈一定的剂量依赖性。由图5（d、e、f）结果可见，与空白组相比，小鼠经气管灌注lps（2mg/kg）后肺泡灌洗液中促炎症因子tnf-α,il-6和il-1β的含量水平显著升高。与lps相比，阳性对照地塞米松10mg/kg能明显降低肺泡灌洗液中促炎症因子tnf-α,il-6和il-1β的浓度，acgs20mg/kg和40mg/kg同样也能明显降低肺泡灌洗液中促炎症因子tnf-α,il-6和il-1β的浓度，且40mg/kg剂量组的降低效果与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当。由图5可知，40mg/kg剂量组在改善ali中肺部炎症方面的活性与阳性对照地塞米松10mg/kg组相当，且呈一定的剂量依赖性。综上所述，acgs在改善lps诱导的急性肺损伤方面，剂量为40mg/kg时，显示出与地塞米松10mg/kg剂量相当的活性，在防治急性肺损伤和肺部炎症方面有较好的应用前景，在相应的药物制剂研究方面极具开发价值。当前第1页12