一种对愈伤有效的中药组合物的制作方法

本发明属中药技术领域，具体涉及一种具有创伤愈合作用的中草药——白花檵木叶及其提取物。

背景技术：

檵木为金缕梅科檵木属植物，主产于江西。其叶收载于《中国药典》1977年版(一部)，是民间常用的草药。具有清热解毒，收敛，止血的功效。可用于烧、烫伤，外伤出血，吐血，崩漏，腹泻以及胃溃疡的治疗。现代药理研究表明，檵木叶具有：抗氧化(清除自由基)、抗菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌等)等多种功效。檵木有白花檵木和红花檵木之分，现代研究表明，其主要成分为酚类、黄酮类、鞣质、有机酸等成分。

白花檵木又称为白檵木loropetalumchinense(r.br.)oliv.，是金缕梅科檵木属原生种灌木或小乔木，叶、根、花、果均可入药，为江西区域性特色药用资源，民间用其治疗外伤出血。然而，至今未见有对于单纯使用白花檵木叶及其组合物对创伤愈合作用的报道。目前，江西省已经建成白花檵木药用资源规范化种植基地(种植基地6500亩，育苗基地达500亩)。因此，研究白花檵木叶对于创伤愈合的作用，在白花檵木进一步的药用开发上具有重要的作用和意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种具有创伤愈合作用的中草药及其组合物。

本发明所述中草药为白花檵木叶。

本发明所述白花檵木叶组合物提取溶剂及制备方法包括水煮、水提醇沉或乙醇提取。提取时溶剂用量为药材重量的8-12倍；提取溶剂可以为水或50-90％乙醇；回流前浸渍时间20-50分钟；回流提取时间为30-90分钟；回流次数1-2次，醇沉浓度为50-80％；最后减压干燥得到组合物。

本发明白花檵木叶组合物含有总酚酸11个，总黄酮15个。

本发明白花檵木叶组合物通过小鼠皮肤打孔创伤愈合实验、小鼠扭体和毛细血管通透性实验，观察得到了白花檵木叶各个组合物能够明显加快小鼠背部皮肤打孔所引起创伤的愈合速度；各组合物能明显抑制腹腔注射醋酸导致的腹痛扭体反应，扭体次数较模型组明显减少，还能明显延长小鼠扭体出现的潜伏期，显著抑制醋酸导致的腹腔毛细血管通透性增加，降低伊文思蓝的渗出量，从而确定其具有显著的抗炎镇痛的作用；病理研究结果表明，白花檵木叶组合物具有显著的抑制皮下组织炎症及促进皮下纤维结缔组织增生作用。因此，白花檵木叶组合物具对创伤愈合具有较好的效果，这为白花檵木叶的进一步要用开发奠定了基础。

以下通过具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明，本领域技术人员可以根据发明做出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

附图说明

图1白花檵木叶的抗炎镇痛作用

图2皮肤及皮下组织病理图片

a：模型组，皮下组织，he×200，皮下组织大量炎细胞浸润，纤维结缔组织增生不明显，损伤累及皮下肌层，部分肌细胞变性

b：阳性药组，皮下组织，he×200，皮下组织明显的炎细胞浸润，纤维结缔组织轻度增生。

c：白花檵木叶醇提组，皮肤及皮下组织，he×200，可见痂皮下鳞状细胞增生修复缺损的组织，皮下纤维结缔明显增生，轻微的炎细胞浸润。

d：白花檵木叶水提组大剂量，皮下组织，he×200，左侧痂皮下可见部分增生修复的鳞状上皮，皮下组织中渗出较模型组明显减轻，可见轻到中度的炎细胞浸润及较明显的纤维结缔组织增生。

e：白花檵木叶水提组中剂量，皮下组织，he×200，皮下组织中可见较明显的炎细胞浸润和纤维结缔组织增生。

f：白花檵木叶水提组低剂量，皮肤及皮下组织，he×200，痂皮下可见增生修复的鳞状上皮，皮下组织中可见轻度的炎细胞浸润及纤维结缔组织增生。

图3四种单咖啡酰奎宁酸化合物的二级质谱图

图4负离子模式下绿原酸的裂解规律

图5三种p-香豆酰奎宁酸化合物的二级质谱图

图6负离子模式下3-p-香豆酰奎宁酸的裂解规律

图7槲皮素裂解规律

图8槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷/半乳糖苷质谱图(a为其一级质谱图，b为465的二级谱图，c为303的三级谱图)

图9槲皮素-3-o-β-d-鼠李糖苷质谱图(a为其一级质谱图，b为449的二级谱图，c为303的三级谱图)

图10山柰酚的二级谱图

图11山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷/半乳糖苷质谱图(a为其一级质谱图，b为449的二级谱图，c为287的三级谱图)

图12银锻苷正离子模式下的裂解规律

图13杨梅素-3-o-β-d-鼠李糖苷质谱图(a为其一级质谱图，b为465的二级谱图，c为319的三级谱图)

图14杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷/半乳糖苷质谱图(a为其一级质谱图，b为481的二级谱图，c为319的三级谱图)

具体实施方式

下面实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。

实验例1白花檵木叶组合物1(水提)

实施例2白花檵木叶组合物2(醇提)

实施例3白花檵木叶组合物3(水提醇沉)

实施例4酚酸类及黄酮类化合物的鉴定

1、酚酸类化合物的鉴定

由混合标准品总离子流图可知，酚酸类化合物多数在高极性部位出峰。在液相7.63min发现化合物3，一级质谱质核比m/z为169.0140，且存在质核比m/z为339.0353的[2m-h]-碎片离子。在二级谱图中给出质核比m/z为125.0242的[m-co2-h]-碎片和质核比m/z为107.1631的[m-co2-h2o-h]-碎片。与标准溶液对比可确定该化合物为没食子酸。在液相3.07min发现化合物2，一级质谱质核比m/z为191.0558，且存在质核比m/z为383.1184的[2m-h]-碎片离子。在二级谱图中给出质核比m/z为173.0454的[m-h2o-h]-碎片和m/z为147.0294的[m-co2-h]-碎片，初步确定该化合物为奎宁酸。

在液相14.42min，16.60min，14.99min，11.92min发现化合物14、16、15、8，它们的一级质谱质核比m/z均为353，确定这四个化合物为同分异构体，且化合物14与混合标准品中的绿原酸有相同的保留时间，确定14为绿原酸，其余三种化合物均为绿原酸的同分异构体。分析这四种化合物的二级质谱发现其均存在质核比m/z为191，179，173等特征碎片离子，根据文献^[7]可确定它们为cqa(单咖啡酰奎宁酸)类化合物。化合物14、16、8在二级谱图中都失去咖啡酰基，生成基峰m/z为191的[quinicacid-h]-碎片离子，同时都产生了质核比m/z为179的[caffeicacid-h]-的碎片离子，但化合物14产生的质核比m/z为179的碎片比化合物8产生的丰度比低。化合物15在二级谱图中生成基峰m/z为173的[quinicacid-h-h2o]-碎片离子。文献表明^[7-10]5-cqa的179碎片丰度较3-cqa低，1-cqa极性较3-cqa低，4-cqa产生的基峰为m/z173。故可以鉴定化合物14为绿原酸(5-cqa)，16为1-咖啡酰奎宁酸(1-cqa)，15位隐绿原酸(4-cqa)，8为新绿原酸(3-cqa)。其二级谱图如图3所示。以绿原酸为例阐述这四种化合物的裂解规律，如图4所示。

此外，以绿原酸为母核的基础上鉴定液相2.86min化合物1。其一级质谱m/z为499.0712，在二级质谱中给出m/z为353.0888的[m-146]-碎片离子。初步鉴定其可能为绿原酸鼠李糖苷。鉴定液相18.32min化合物19，其一级质谱m/z为367.1068，在二级质谱中给出m/z为191.0560、173.0454的碎片离子。初步鉴定其可能为绿原酸甲酯。

在液相17.12min，19.13min，14.13min发现化合物18、22、13，它们的一级质谱质核比m/z均为337，确定这四个化合物为同分异构体，分析这四种化合物的二级质谱发现其均存在质核比m/z为191，173，179等特征碎片离子，根据文献^[7]可确定它们为p-coqa(p-香豆酰奎宁酸)类化合物。化合物18、22在二级谱图中都失去p-香豆酰基，生成基峰m/z为191的[quinicacid-h]-碎片离子，同时都产生了质核比m/z为163的[p-coumaroylquinicacid-h]-碎片离子。而化合物13在二级谱中基峰为质核比m/z为163的[p-coumaroylquinicacid-h]-碎片离子，同时产生质核比m/z为191的[quinicacid-h]-碎片离子。文献表明^[7-8，11]1-p-coqa与5-p-coqa的基峰离子均为m/z191，而3-p-coqa的基峰离子为m/z163，且1-p-coqa比5-p-coqa极性大。故可以鉴定化合物18为1-p-香豆酰奎宁酸(1-p-coqa)，化合物22为5-p-香豆酰奎宁酸(5-p-coqa)，化合物13为3-p-香豆酰奎宁酸。其二级谱图如图5所示。以3-p-香豆酰奎宁酸为例阐述这三种化合物的裂解规律，如图6所示：

2、黄酮类化合物的鉴定

由混合标准品总离子流图可知，黄酮类化合物多数在低极性部位出峰。液相29.02min发现化合物34，一级质谱质核比m/z为303.0502，在二级质谱中给出^0，2a+碎片(m/z＝165.0191)，^1，3a+碎片(m/z＝153.0190)，同时给出连续掉两个co的[m-co+h]+和[m-2co+h]+碎片。通过与对照品比较，化合物34确定为槲皮素。同时参考文献^[5]可确定其裂解过程如图7。

在这个母核的基础上鉴定了20.85min、23.88min化合物24、28，它们均为槲皮素的单糖苷。化合物24的一级质谱质核比m/z为465.1029，在二级质谱中给出质核比m/z为303.0503的[m-162]+碎片，在303的三级质谱中发现[m-162]+碎片的裂解规律与槲皮素相似，说明其为槲皮素的葡萄糖或半乳糖苷。其质谱图如图8。根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷和槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷，所以鉴定化合物24可能为槲皮素-3-o-β-d-半乳糖苷或槲皮素-3-o-β-d-葡萄糖苷。化合物28的一级质谱质核比m/z为449.1082，在二级质谱中给出质核比m/z为303.0503的[m-146]+碎片，在303的三级质谱中发现[m-146]+碎片的裂解规律与槲皮素相似，说明其为槲皮素的鼠李糖苷。其质谱图如图9。根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到槲皮素-3-o-β-d-鼠李糖，所以鉴定化合物28可能为槲皮素-3-o-β-d-鼠李糖。同时，还鉴定了21.17min化合物25，其一级质谱质核比m/z为601.1188，在二级质谱中给出m/z为465.1031的[m-136]+和m/z303.0503的[m-136-162]+碎片，推测其可能为槲皮素苷与龙胆酸结合而成的酯，初步鉴定此化合物为槲皮素苷龙胆酸酯。

液相29.32min发现化合物35，一级质谱质核比m/z为287.0554，在二级质谱中给出^0，2a+碎片(m/z＝165.0188)，^1，3a+碎片(m/z＝153.0189)，同时给出连续掉两个co的[m-co+h]+和[m-2co+h]+碎片。通过与对照品比较，化合物35确定为山柰酚。根据山柰酚对照品和化合物35质谱数据可以看出其裂解规律与槲皮素素相似，二级质谱中存在[m-h2o]+、[m-co]+、[m-h2o-co]+、[m-2co]+等碎片离子。其二级质谱图如图10。

在这个母核的基础上鉴定了27.09min、25.30min，24.84min，23.61min化合物32、30、29、27，它们均为山柰酚的单糖苷。化合物32的一级质谱质核比m/z为433.1128，在二级质谱中给出质核比m/z为287.0552的[m-146]+碎片，在287的三级质谱中发现[m-146]+碎片的裂解规律与山柰酚相似，说明其为山柰酚的鼠李糖苷。根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到山柰酚-3-o-β-d-鼠李糖苷，所以鉴定化合物32可能为山柰酚-3-o-β-d-鼠李糖苷。化合物30，29的一级质谱质核比m/z相近，分别为419.0967、419.0973，在二级质谱中均给出质核比m/z为287(287.0548、287.0551)的[m-132]+碎片，说明其为山柰酚的阿拉伯糖苷和山柰酚木糖苷。根据本文综述未曾有人从白花檵木叶中分离得到山柰酚的阿拉伯糖苷或山柰酚木糖苷，所以只能初步鉴定化合物可30，29为山柰酚的阿拉伯糖苷和山柰酚木糖苷，无法确定其构型。化合物27的一级质谱质核比m/z为449.1083，在二级质谱中给出质核比m/z为287.0551的[m-162]+碎片，在287的三级质谱中发现[m-162]+碎片的裂解规律与山柰酚相似，说明其为山柰酚葡萄糖苷或山柰非半乳糖苷。其质谱图如图11。根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷和山柰酚-3-o-β-d-半乳糖苷，所以鉴定化合物27可能为山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷或山柰酚-3-o-β-d-半乳糖苷。同时，还鉴定了22.74min化合物26，其一级质谱质核比m/z为601.1189，在二级质谱中给出m/z为449.1081的[m-153]+和m/z为287.0553的[m-136-162]+碎片，推测其可能为黄芩苷(山柰酚苷)与没食子酸结合而成的酯，根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到黄芪苷2″-o-没食子酸酯和黄芪苷6″-o-没食子酸酯，所以鉴定此化合物为黄芪苷2″-o-没食子酸酯或黄芪苷6″-o-没食子酸酯。

此外，在此母核的基础上在液相28.79min发现化合物33，一级质谱质核比m/z为595.1445，且存在287.0551碎片，推测其母核为山柰酚，为标准品对照确定其为银锻苷。其裂解规律如图12。

液相26.91min发现化合物31，一级质谱质核比m/z为319.0445。根据文献报道^[6]，曾从白花檵木叶中分离得到杨梅素，其[m+h]精确分子量为319.0448，与化合物31测定值的误差为-1.203ppm，所以初步确定化合物31为杨梅素。

在这个母核的基础上鉴定了20.58min、18.68min，18.45min化合物23、21、20，它们均为杨梅素的单糖苷。化合物23的一级质谱质核比m/z为465.1028，在二级质谱中给出质核比m/z为319.0465的[m-146]+碎片，在319的三级质谱中发现[m-146]+碎片的裂解规律与杨梅素相似，说明其为杨梅素的鼠李糖苷。其质谱图如图13。根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到杨梅素-3-o-β-d-鼠李糖苷，所以鉴定化合物23可能为杨梅素-3-o-β-d-鼠李糖苷。化合物21，20的一级质谱质核比m/z均为481.0977，在二级质谱中均给出质核比m/z为319(319.0464、319.0448)的[m-162]+碎片，说明其为杨梅素葡萄糖苷苷和杨梅素木糖苷。其质谱图如图14。根据前人报道^[6]曾从白花檵木叶中分离得到杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-β-d-半乳糖苷，所以鉴定化合物21和20为杨梅素-3-o-β-d-葡萄糖苷和杨梅素-3-o-β-d-半乳糖苷。

实施例5抗炎试验

摘要：采用醋酸诱导的小鼠扭体和毛细血管通透性增高模型观察了白花檵木叶组合物的镇痛作用。组合物给药5天后，给小鼠腹腔注射1％冰醋酸生理盐水溶液，造成小鼠疼痛扭体模型，观察并记录20min内小鼠出现扭体的潜伏期和扭体次数；该模型同时可造成腹腔毛细血管通透性增加，引起腹腔急性渗出性炎症。故在扭体观察结束后，给动物尾静脉注射0.5％伊文思蓝溶液，测定腹腔液中伊文思蓝含量。结果表明白花檵木叶10.0g生药/kg(2倍临床量)以上剂量具有明显的抗炎作用，表现为显著抑制醋酸导致的腹腔毛细血管通透性增加，降低伊文思蓝的渗出量，抑制率为60.0％；2.5g生药/kg(1/2倍临床量)以上剂量具有明显的镇痛作用，表现为小鼠扭体次数的明显减少，其中以20.0g生药/kg剂量组(4倍临床量)效果较强，不但扭体次数的抑制率最高，为56.0％，尚能明显延长扭体出现的潜伏期。本研究结果提示，白花檵木叶具有明显的镇痛、抗炎作用。

1试验目的

观察白花檵木叶对醋酸诱导的小鼠腹痛扭体和对腹腔急性渗出的影响，以证明其是否具有镇痛、抗炎作用，并确定其有效剂量。

2受试物

2.1白花檵木叶组合物1

简称：檵木叶1

临床常用量：30g/人/天，按60kg体重计算，人临床用量为0.5g/kg

贮存条件：-20℃保存。

配制：用蒸馏水将受试物配制成4种浓度，分别为0.125、0.25、0.5、1g生药/ml。

剂量：口服体积20ml/kg，剂量分别为2.5、5、10、20g生药/kg，按体表面积折合(小鼠按10计算)相当于1/2、1、2、4倍临床等效量。

2.2阳性药(西药)

名称：阿司匹林泡腾片

临床剂量：2g/人/日，按60kg体重计算，人临床用量为0.03g/kg

贮存条件：常温避光保存。

来源：阿斯利康制药有限公司

配制：用蒸馏水将其配制成10mg/ml。

剂量：口服体积20ml/kg，剂量为200mg/kg，按体表面积折合(小鼠按10计算)相当于2/3倍临床等效量。

3剂量设计及给药方法

白花檵木叶在临床上的常用剂量均为30g生药/人/天，人的体重按60kg计算，则临床剂量相当于0.5g生药/kg。在动物试验中两种受试物的剂量设计为4个水平，分别约为1/2临床量、临床量、2倍临床量和4倍临床量。按体表面积折算，则小鼠剂量分别为2.5、5.0、10.0、20.0g生药/kg。所有动物均采用灌胃给药，给药体积为20ml/kg。

4实验动物

品种：小鼠

品系：icr

级别：spf级(speceficpathogenfree，无特定病原体)

来源：购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为scxk(京)2006-0009。

性别：雄性

体重：19-21g

动物房：试验期间动物饲养于中国中医科学院医学实验动物中心动物房，实验设施许可证syxk(京)2008-0023。设施管理遵循中华人民共和国国家标准gb14925-2001《实验动物环境及设施》。

喂养条件：采用人工光照12小时明暗周期，环境温度维持在20-24℃，湿度在40％-70％，每小时换气15次。动物饲养于聚碳酸酯小鼠饲养笼，每笼饲养同剂量组的5只同性别小鼠。每2天更换一次清洁动物笼和垫料。

饲料及其提供单位：使用标准小鼠颗粒饲料，由北京市科澳协力饲料有限公司提供，产品许可证号：scxk(京)2009-0012，登记证号：京饲(配)字第238号。

饮用水：纯净水，动物可自由摄取，每日更换新的水瓶和新鲜水。

5试验对照

空白对照组：给予等体积蒸馏水。

模型对照组：给予等体积蒸馏水。

阳性对照组：阿司匹林，剂量为经前期预试验的有效剂量，为200mg/kg，按体表面积折合(小鼠按10计算)相当于2/3倍临床等效量。

6仪器与试剂

6.1仪器

thermovarioskanflash多功能酶标仪(美国)，sartoriusbsa3202s-cw天平(德国)。

6.2试剂

冰醋酸，北京化学试剂公司；伊文思蓝，批号：wc20070607，沃凯国药集团化学试剂有限公司。

7试验方法

icr小鼠，雄性，131只。按体重随机分为：正常对照组，模型组，阿司匹林200mg/kg，白花檵木叶2.5、5、10、20g生药/kg共7组，除正常对照组10只、模型组13只动物外，其余各组均12只动物。各组按体重灌胃给予药物0.2ml/10g，每日给药1次，连续给药5d。正常对照组和模型组给予等体积蒸馏水。末次给药前16-18h禁食不禁水，末次给药后60min，除正常对照组外，其余各组均腹腔注射1％冰醋酸生理盐水溶液0.1ml/10g，正常对照组注射等体积生理盐水。给予醋酸后，立即观察并记录小鼠出现扭体的潜伏期和20min内小鼠发生扭体反应的次数。20min内未出现扭体的动物，其潜伏期记为20min。

于注射冰醋酸生理盐水溶液(正常对照组注射生理盐水)后30min，所有动物尾静脉注射0.5％伊文思蓝溶液0.2ml/10g，20min后脱颈椎处死。将2ml生理盐水注入腹腔，轻柔腹部30次后，收集腹腔液，再用4ml生理盐水分2次洗涤腹腔，每次2ml，分别收集腹腔液，合并3次的腹腔液后定容至8ml。将腹腔液经3000rpm离心15min，取上清液在630nm处比色，读取吸光度值。并以不同浓度的伊文思兰为标准，绘制标准曲线，计算腹腔液中伊文思蓝含量。

8统计分析

各组试验数据均以均数±标准差表示，用单因素方差分析(anova)进行组间比较(注：家中没有spss统计软件，下述为t检验的结果，先这样看一下吧)。按下列公式计算其抑制率％。

扭体抑制率(％)＝(扭体次数模型组-扭体次数药物组)/扭体次数模型组×100伊文思蓝渗出量抑制率(％)＝(伊文思蓝渗出量模型组-伊文思蓝渗出量药物组)/伊文思蓝渗出量模型组×100

9试验结果

小鼠腹腔注射1％的冰醋酸后，引起动物腹痛，呈现扭体反应。同时模型组动物由于腹腔毛细血管通透性增高，腹腔内伊文思蓝渗出量较对照组显著性增高(p＜0.001)。阳性药阿司匹林能明显抑制炎性渗出(p＜0.001)，并具有明显的镇痛作用，表现为明显延长扭体出现的潜伏期和较少扭体次数(p＜0.05，p＜0.01)。白花檵木叶2.5g-20.0g生药/kg剂量均能明显抑制腹腔注射醋酸导致的腹痛扭体反应，扭体次数较模型组明显减少(p＜0.05)，2.5、5.0、10.0、20.0g生药/kg4个剂量组的抑制率分别为14.8％、36.1％、34.5％、45.2％，20.0g生药/kg剂量组尚能明显延长小鼠扭体出现的潜伏期(p＜0.05)；10.0和20.0g生药/kg剂量组能显著抑制醋酸导致的腹腔毛细血管通透性增加，降低伊文思蓝的渗出量(与模型组比较p＜0.01，p＜0.001))，抑制率分别为38.9％，57.3％。结果表明白花檵木叶1具有明显的镇痛抗炎作用(见表1、图2)。

实施例6小鼠皮肤打孔创伤愈合试验

1试验目的

评价白花檵木叶对小鼠背部皮肤打孔致创伤的愈合作用，进一步确定药物的有效剂量，以决定进一步开发的可能性。

2受试物

2.1白花檵木叶组合物2

简称：水提

临床常用量：30g/人/天，按60kg体重计算，人临床用量为0.5g/kg

贮存条件：-20℃保存。

配制：用蒸馏水将受试物配制成3种浓度，分别为0.125、0.25、0.5g生药/ml。

剂量：口服体积20ml/kg，剂量分别为2.5、5.0、10.0g生药/kg，按体表面积折合(小鼠按10计算)相当于0.5、1、2倍临床等效量。

2.2白花檵木叶组合物3

简称：水提醇沉

临床常用量：30g/人/天，按60kg体重计算，人临床用量为0.5g/kg

贮存条件：-20℃保存。

配制：用蒸馏水将受试物配制成1种浓度，为0.25g生药/ml。

剂量：口服体积20ml/kg，剂量为5g生药/kg，按体表面积折合(小鼠按10计算)相当于临床等效量。

2.3阳性药

名称：云南白药

贮存条件：常温避光保存。

名称：云南白药

贮存条件：常温避光保存。

配制：用蒸馏水将其配制成16.5mg/ml。

剂量：口服体积20ml/kg，剂量为330mg/kg，按体表面积折合(小鼠按10计算)相当于临床等效量。

3剂量设计及给药方法

根据白花檵木叶单味药对醋酸诱导的小鼠扭体和毛细血管通透性增高模型的药效观察，初步确定有效剂量为10.0g生药/kg。为进一步确定是否具有进一步开发的可能性，本次实验设檵木叶水提2.5、5.0、10.0g生药/kg组，同时设檵木叶水提醇沉物5.0g生药/kg组，观察是否较低的剂量为有效剂量。所有动物均采用灌胃给药，给药体积为20ml/kg。

4实验动物

品种：小鼠

品系：icr

级别：spf级(speceficpathogenfree，无特定病原体)

来源：购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为scxk(京)2006-0009。

性别：雄性

体重：20-23g

动物房：试验期间动物饲养于中国中医科学院医学实验动物中心动物房，实验设施许可证syxk(京)2008-0023。设施管理遵循中华人民共和国国家标准gb14925-2001《实验动物环境及设施》。

喂养条件：采用人工光照12小时明暗周期，环境温度维持在20-24℃，湿度在40％-70％，每小时换气15次。动物饲养于聚碳酸酯小鼠饲养笼，每笼饲养同剂量组的5只同性别小鼠。每2天更换一次清洁动物笼和垫料。

饲料及其提供单位：使用标准小鼠颗粒饲料，由北京市科澳协力饲料有限公司提供，产品许可证号：scxk(京)2009-0012，登记证号：京饲(配)字第238号。

饮用水：纯净水，动物可自由摄取，每日更换新的水瓶和新鲜水。

5试验对照

模型对照组：给予等体积蒸馏水。

阳性对照组：云南白药，为临床等效量。

6试验方法

小鼠用0.5％水合氯醛麻醉(0.8ml/10g体重)，宠物电动推子剃掉背部毛发，用脱毛膏彻底脱毛后，75％酒精消毒背部脱毛部位皮肤。镊子提起背部脊柱上方皮肤，打孔器在距脊柱中线约0.5cm处穿透所提皮肤打出直径0.6cm的沿脊柱对称的两个孔。用直尺测量左右孔的直径，取两孔均值，以此均值结合动物体重将小鼠随机分为：模型组、阳性药组、檵木叶醇提5g生药/kg组、檵木叶水提2.5、5.0、10.0g生药/kg组。术后第二天，开始灌胃给药，连续4天，20ml/kg，模型组灌胃等容量蒸馏水。从灌胃第一天开始，每天于灌胃给药后6h用千分卡尺测量背部打孔孔径，左右两侧孔径的平均值作为该动物该天的孔径值，连续测量观察3天，末次给药后6h，脱毛，测量孔径值后，取打孔处皮肤，固定于福尔马林溶液中，脱水，包埋，切片，he染色，进行病理评分。

7统计分析

各组直径测量数据均以均数±标准差表示，用单因素方差分析(anova)进行组间比较；病理结果用秩和检验。

8试验结果(见表2)

云南白药、白花檵木水提醇沉物和水提各个剂量组除给药第一天外，对小鼠背部皮肤打孔引起的创伤具有一定的伤口愈合作用，孔径值均较模型组偏小，其中，醇提组在给药第4天，与模型组比较，孔径值有明显的减小趋势(p＝0.0566，＜0.1)，其余各组均未见明显的统计学意义。各组动物伤口均未出现明显的红肿发炎状况。

表2白花檵木叶组合物对小鼠背部打孔致创伤的愈合作用

注：与模型组比较^*p＜0.1

实施例6小鼠皮肤打孔创伤愈合试验病理实验

1实验目的

观察小鼠背部皮肤打孔对小鼠皮肤及皮下组织的病理损害；云南白药、白花檵木叶醇提及白花檵木叶水提高、中、低剂量对皮肤及皮下组织病变的影响。

2送检脏器

送检样本为10％的福尔马林固定的80只icr小鼠打孔部位的背部皮肤及皮下组织，分为模型组16个、阳性药组(云南白药组)12个、白花檵木叶醇提组(5g生药/kg组)13个、白花檵木叶水提组高剂量组(10g生药/kg组)13个、中剂量组(5g生药/kg组)13个、低剂量组(2.5g生药/kg组)13个。

3实验方法

将固定好的皮肤及皮下组织取材修块后，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后，切片(厚度4μm)，进行he染色。用光学显微镜进行病理组织学检查。

4结果

模型组、阳性药组、白花檵木叶醇提及白花檵木叶水提高、中、低剂量组皮肤创伤表面覆盖一层痂皮，痂皮下可见不同程度粉染渗出物，炎细胞浸润，成纤维细胞等纤维结缔组织增生，皮下组织可见不同程度的出血，部分动物的病变累及皮下肌层，可见肌细胞变性。在对小鼠皮下组织炎症病变影响方面，与模型组比较，白花檵木叶醇提及白花檵木叶水提低、高剂量组皮下组织的炎细胞浸润明显减轻(p＜0.01，p＜0.05)，阳性药组及白花檵木叶水提中剂量组较模型组略有减轻，无明显的统计学差异。在对小鼠皮下组织间质增生病变影响方面，与模型组比较，阳性药、白花檵木叶醇提及白花檵木叶水提高、中、低剂量组皮下组织的纤维结缔组织增生较模型组均有不同程度的增加，其中以白花檵木叶醇提组的增生较明显，但均无明显的统计学差异。各组的具体病变分级情况见表3～4。皮肤及皮下组织病变见图3。

5结论

白花檵木叶醇提及水提物对小鼠背部皮肤打孔创伤的愈合均有一定促进作用。白花檵木叶水提2.5g生药/kg组能明显抑制皮下组织炎症，表明白花檵木叶水提组低剂量即有一定的促进创伤愈合的作用，但其促进皮下纤维结缔组织增生作用不明显；白花檵木叶醇提组较同等剂量的水提组抑制皮下组织炎症及促进皮下纤维结缔组织增生作用均略强，但并无明显的统计学差异。

表3各组小鼠皮下组织炎症病变比较

注：(1)“+”：轻度；“++”：中度；“+++”：重度；

(2)“*”：与模型组比较，p＜0.05；“**”：与模型组比较，p＜0.01

表4各组小鼠皮下组织间质增生病变比较

注：“+”：轻度；“++”：中度；“+++”：重度。