水溶性富勒烯结构在制备治疗肿瘤的药物中的应用的制作方法

本发明要求北京福纳康生物技术有限公司和中国科学院化学研究所于2017年5月9日向中国专利局提交的、申请号为cn201710322042.0、发明名称为“水溶性富勒烯纳米颗粒在制备抑制肿瘤生长药物中的应用”的中国专利申请的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本发明中。

本发明要求北京福纳康生物技术有限公司于2016年10年8月向中国专利局提交的、申请号为cn201610878746.1、发明名称为“一种水溶性富勒烯纳米材料及其制备方法与应用”的中国专利申请的优先权，该申请的全部内容通过引用结合在本发明中。

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种水溶性富勒烯结构在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术：

癌症，即恶性肿瘤作为21世纪影响人类生命健康的重大疾病已经得到人们普遍关注。国际癌症研究机构在2013年出版的《世界癌症报告》中指出，根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人。在目前肿瘤治疗的过程中，化疗是最常用的手段之一，但是化疗药物缺乏靶向性，在杀死肿瘤细胞的同时也会引起正常细胞的死亡，因此常常会引起严重的副作用。随着抗肿瘤研究的不断发展，也出现了一批抗癌新疗法，例如靶向治疗、免疫疗法、热疗、光动力疗法等。

肿瘤血管是肿瘤进行生殖、生长发育和修复的基础，也是肿瘤细胞逃逸、转移的重要途径之一。肿瘤血管是由一种异常的基膜组成的，其中绝大多数是增生的内皮细胞，且肿瘤血管中的毛细血管网络呈现一种混乱无序而且分级分支的结构，这些均与正常的脉管系统是明显不同的。

富勒烯，由不同数目碳原子组成的笼状碳原子簇，因为其独特的分子结构决定了它独特的物理化学性质。近年来，随着富勒烯水溶化方法的不断拓展，水溶性富勒烯的种类也不断被丰富和壮大，并在生物领域中发挥着重要的作用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种水溶性富勒烯结构在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的目的之二是提供一种使用上述水溶性富勒烯结构治疗肿瘤的药物组合物及方法。本发明的目的之三是提供一种使用上述水溶性富勒烯结构改善肿瘤的保健品或保健食品。

为了实现目的，本发明提供了以下技术方案：

一种水溶性富勒烯结构在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述水溶性富勒烯结构包括：水溶性空心富勒烯及其可药用的盐和可药用的酯中的至少一种。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，包括向患有肿瘤的受试者施用有效量的水溶性富勒烯结构，所述水溶性富勒烯结构包括：水溶性空心富勒烯及其可药用的盐和可药用的酯中的至少一种。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的药物组合物，包括至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构作为有效成分：水溶性空心富勒烯及其可药用的盐和可药用的酯，所述药物组合物还包括可药用的载体、可药用的稀释剂和可药用的赋形剂中的至少一种。

本发明还提供了一种改善肿瘤的保健品或保健食品，包括至少一种选自下组的水溶性富勒烯结构作为有效成分：水溶性空心富勒烯及其可药用的盐和可药用的酯，所述保健品或保健食品还包括保健品或保健食品中可接受的载体、稀释剂和赋形剂中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性空心富勒烯选自下组的一种或多种：(1)在空心富勒烯本体的碳笼外表面修饰有亲水基团的改性富勒烯；(2)空心富勒烯本体的碳笼外表面被亲水性生物小分子包裹的改性富勒烯；(3)空心富勒烯本体被具有生物相容性的载体材料负载而形成的改性富勒烯；(4)自组装形成的水溶性超分子体系的富勒烯。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述空心富勒烯本体包括一种或多种通式为c2m的由碳原子组成的笼状结构，30≤m≤60，例如；c60，c70，c84等。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述亲水基团包括羟基、羧基、巯基、氨基和水溶性氨基酸残基中的一种或多种。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸残基是指水溶性氨基酸在修饰空心富勒烯本体时，失去氨基酸分子的一部分后剩余的不完整的氨基酸，即：氨基酸残基是氨基酸分子的一部分，其是不完整的氨基酸。缺少氨基酸分子中的任何一个部分都算是氨基酸残基，如：失去氨基酸中氨基上的氢、失去氨基酸中羧基上的氢或羟基等。可选的，所述水溶性氨基酸残基为丙氨酸残基、甘氨酸残基、丝氨酸残基、精氨酸残基、赖氨酸残基和天门氨酸残基中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性空心富勒烯的通式为c2a(oh)b(aminoacid)c，aminoacid代表水溶性氨基酸残基；20≤a≤60，可选的30≤a≤60，a为30或35；0<b<50，可选的0<b<30，还可选的b＝13、20、22、24等；0≤c<20，可选的c＝2-15，还可选的c＝6。上述结构通式表示羟基和/或水溶性氨基酸残基连接于空心富勒烯本体上。通式c2a(oh)b(aminoacid)c中b，c均不一定是整数，b和c都是通过检测计算得出的统计平均值，可以是非整数。可通过调节反应条件改变x、y的数量。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述亲水性生物小分子包括氨基酸和肽链中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述具有生物相容性的载体材料包括脂质体和细胞膜载体的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性富勒烯结构的平均水合粒径在1-1000nm。水溶性富勒烯结构的尺寸可通过以下方式来控制：在溶剂环境中通过改变溶剂种类、调节溶剂浓度等方法来控制分子间相互作用形成的团聚的纳米颗粒物的尺寸。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性空心富勒烯是通过对空心富勒烯本体进行水溶性改性获得的。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性改性的方法为以下方法中的任一种：

(1)在空心富勒烯本体的碳笼外表面修饰羟基的方法包括以下2种方法中的至少一种：

方法一为固液反应：将空心富勒烯本体、双氧水和碱溶液(即：氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液)混合并进行反应，将反应液进行洗涤，之后收集沉淀然后透析；

可选的，固液反应为：(a)将质量百分含量为1-40％的双氧水和质量百分含量为10-80％的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液按照体积比为1-10:1混合得到混合液，在每10-200ml混合液中加入20-500mgc60固体或c70固体，搅拌(可选的在50-80℃的条件下搅拌，搅拌速度为1000r/min)至固体全部溶解，过滤，保留滤液；(b)将所述滤液加入过量的浓度为85％-100％的乙醇进行洗涤，并离心(可选的离心转速为10000r/min，离心时间为1-10min)后收集沉淀，将所述沉淀溶于水，得到溶液；(c)将(b)步骤得到的溶液进行透析处理(可选的透析至所述溶液在室温的电导率小于1μs/cm)。进一步可选的透析处理后还包括冷冻干燥的步骤，以便获得羟基化空心富勒烯固体。

方法二为液液反应：将空心富勒烯本体、相转移催化剂四甲基氢氧化铵、和氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液混合并进行反应，将反应液进行洗涤，之后收集沉淀然后透析。

(2)在空心富勒烯本体的碳笼外表面修饰氨基的方法为：将上述固液反应或液液反应中的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液替换成氨水即可。

(3)物理包覆的方法为：将空心富勒烯本体与聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮和环糊精中的至少一种混合并进行球磨或超声等就可以得到被包覆的水溶性空心富勒烯，如聚乙二醇包覆的富勒烯和/或聚乙二醇包覆的空心富勒烯，聚乙烯吡咯烷酮包覆的富勒烯和/或聚乙烯吡咯烷酮包覆的空心富勒烯。

(4)在空心富勒烯本体的碳笼外表面修饰氨基酸残基时，制备方法选自以下二者之一：

方法一：包括以下步骤：(a)使用水溶性氨基酸和naoh/koh配制水溶性氨基酸碱溶液(可选的，水溶性氨基酸和naoh/koh的摩尔比为1:1-10，还可选的为1:2或1:1-8；可选的，水溶性氨基酸碱溶液中naoh/koh的质量分数可为10～50％，还可选的为14％或10～30％)；(b)按照氨基酸与空心富勒烯本体摩尔比为1-1000:1，可选的为50-1000：1，100-1000:1，200-1000:1，将氨基酸碱溶液与空心富勒烯本体进行混合；(c)将上述混合物40-80℃反应(可选的，所述反应为搅拌反应1-7小时)，过滤除去未反应的少量固体粉末；(d)滤液透析除去小分子杂质，过滤后，得到的棕黑色溶液即为本发明的氨基酸修饰的水溶性空心富勒烯。可选的，透析所使用的透析袋的截留分子量mw＝3500；可选的，透析后的过滤所使用的微孔滤膜的孔径200-220nm；可选的，透析至透析袋外液体的电导率小于1μs/cm；

方法二：将含有水溶性氨基酸的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液与乙醇混合，并加入到c60或c70的甲苯溶液中，搅拌，除去上层甲苯层，下层产物透析。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述水溶性氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、精氨酸、赖氨酸和天门氨酸中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物、保健品或保健食品在另一种实施方式中，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、结肠直肠癌、肾癌、胰腺癌、骨癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、食管癌、胃癌、口腔癌、鼻癌、喉癌、胆管癌、宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、脑膜瘤、皮肤癌、黑色素瘤和肉瘤中的至少一种。

上述应用、方法、药物组合物在另一种实施方式中，所述治疗肿瘤包括：抑制肿瘤体积增大、抑制肿瘤质量增大、减慢肿瘤体积增大的速度、减慢肿瘤质量增大的速度、破坏肿瘤结构、减小肿瘤体积、减小肿瘤质量、破坏肿瘤血管结构、破坏肿瘤血管的内皮连接、降低肿瘤部位ve-cadherin的含量中的至少一种。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物可以是片剂、丸剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气溶胶、软膏、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶液或无菌包装粉针剂的制剂。本发明中将有效成分制备成药物或药物组合物，使其在施用于受试者后速释、缓释或延迟释放有效成分，例如：有效成分可以与载体混合，用载体稀释或者包封在载体中。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体、赋形剂和稀释剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、树脂、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水糖浆(watersyrup)、甲基纤维素、尼泊金甲酯和丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和液状石蜡。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，适宜作为载体的一些实例包括水、生理盐水、pbs缓冲液和tris-hcl溶液中的至少一种；可选的，所述生理盐水的浓度为0.85～0.90％；可选的，pbs缓冲液的浓度为0.01～0.1mol/l，组成的组分具体为na2hpo4、kh2po4、nacl和kcl；可选的，tris-hcl溶液的浓度为0.05mol/l。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，该药物或药物组合物还可以另外包括润滑剂、润湿剂、乳化和悬浮剂、防腐剂、甜味剂或矫味剂等助剂。

上述应用中的药物或上述药物组合物在另一种实施方式中，当所述药物或所述药物组合物以液体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-100mg/ml，可选的为0.01-10mg/ml，0.01-20mg/ml，0.01-30mg/ml，0.01-40mg/ml；当所述药物或所述药物组合物以固体形式存在时，有效成分在所述药物或所述药物组合物中的浓度为0.01-50mg/g，可选的为0.01-10mg/g，0.01-20mg/g，0.01-30mg/g，0.01-40mg/g。

上述方法在另一种实施方式中，所述受试者为人或动物，动物可以为哺乳动物，如小鼠、豚鼠、大鼠、狗、兔子、猪、猴子等。

上述方法在另一种实施方式中，所述水溶性富勒烯结构施用的时间可选的为肿瘤生长初期、肿瘤血管尚未生成时、肿瘤生长中期和/或肿瘤生长晚期；所述水溶性富勒烯结构施用的方式为静脉注射、腹腔注射、口服和局部给药中的至少一种；所述水溶性富勒烯结构施用的剂量为1mg/kg/d～1000mg/kg/d，可选的为1-100mg/kg/d，1-20mg/kg/d，1-10mg/kg/d，具体的受试者的总给药量按照其体重进行换算；所述水溶性富勒烯结构施用的疗程根据肿瘤的生长周期而定，不同肿瘤的生长速度不同，可施用数天至数十天不等，如5-30天为1个疗程。

上述方法在另一种实施方式中，在向患有肿瘤的受试者施用有效量的水溶性富勒烯结构后，还包括以下步骤：用与所述水溶性富勒烯结构相匹配的辐射能量源对所述受试者的肿瘤部位进行辐照。

上述方法在另一种实施方式中，所述辐射能量源可以是射频。

上述方法在另一种实施方式中，所使用的辐射能量源的频率可为1～1000mhz，可选的为200mhz、1～200mhz、200～1000mhz或150～500mhz；辐射能量源的发射功率为1mw～10kw；生物体吸收的辐照的功率为1～1000mw，可选的为5mw；辐射能量源进行辐照的时间为10min～2h，可选的为1h、10min～1h、1h～2h或10min～1.5h。

上述方法在另一种实施方式中，注射所述药物在0～1h后进行所述辐照；可选的为10min或10min～50h。

本发明所用的术语“有效量”指有效成分经单次或多次施用于患者而给所诊断或所治疗的患者提供预期效应的量或剂量。有效量可由所参与的诊断医师作为本领域技术人员通过已知技术以及在类似情形下所得的观察结果而确定。在确定所施用有效成分的有效量或剂量时，所参与的诊断医师应考虑多种因素，所述因素包括但不限于：哺乳动物的种属；体积、年龄及一般健康；所涉及的具体疾病；该疾病的涉入程度或严重程度；个体患者的响应；所施用的具体化合物；给药模式；所施用制剂的生物利用度性质；所选择的给药方案；伴随药物疗法的使用；以及其它相关的情形。

本发明所用的术语“空心富勒烯本体”是指没有经过水溶性改性的空心富勒烯。

本发明中所有范围的公开应当视为对范围内所有子范围和所有点值的公开。例如：1-1000的公开应当视为也公开了1-200,200-300等范围，同时也公开了200、300、400、500、600、700、800、900和100等点值。

为了方便计量，本发明中所有关于水溶性富勒烯、水溶性金属富勒烯的具体含量、浓度等定量的限定均是以其对应的富勒烯本体或内嵌金属富勒烯本体的具体含量、浓度等来衡量的，例如：有效成分的施用剂量为1mg/kg/d-500mg/kg/d是指每1天每1kg的小鼠要施用的有效成分中对应的富勒烯本体碳笼的量为1mg-500mg。

本领域为发展中的认知领域，本申请的权利要求的解读并不必然受本申请中任何特定的理论或机理或推断的限制。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、与目前临床普遍使用的环磷酰胺、紫杉醇等抗癌药物比较，本发明水溶性富勒烯结构的水溶性好，与生物体有很好的亲和性，毒性低；

2、本发明水溶性富勒烯结构对肿瘤的抑制效率高，既可以抑制肿瘤体积增大、抑制肿瘤质量增大、减慢肿瘤体积增大的速度、减慢肿瘤质量增大的速度，也可以破坏已有肿瘤结构、减小已有肿瘤体积和质量、破坏已有肿瘤血管结构、破坏已有肿瘤血管的内皮连接、降低肿瘤部位ve-cadherin的含量；

3、本发明水溶性富勒烯结构既可以搭配射频使用，也可以单独使用，使用方式灵活，可适用于不同情况的肿瘤患者；

4、本发明水溶性富勒烯结构的原料空心富勒烯成本较为低廉，能普遍推广应用。

附图说明

图1为本发明c70(oh)29·10h2o的热重分析及微商热重分析曲线。

图2为本发明c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4·15h2o的热重分析及微商热重分析曲线。

图3为本发明c70(oh)24·5h2o的热重分析及微商热重分析曲线。

图4为本发明c70(oh)29及c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4在纯水中的水合粒径曲线。

图5为本发明c70(oh)24在纯水中的水合粒径分布曲线。

图6为本发明c70(oh)29在纯水中的zeta电势。

图7为本发明c70(oh)29及c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4对小鼠肝癌肿瘤的治疗效果图。

图8为生理盐水对照组小鼠肝癌肿瘤在治疗前后的照片。

图9为不同试剂对h22肿瘤的作用效果图；其中图9a)为本发明c70(oh)29治疗h22肿瘤后24h解剖时肿瘤处大量淤血的照片；图9b)为生理盐水对照组h22肿瘤的he染色图片；图9c)为本发明c70(oh)29按照实施例4的方法治疗h22肿瘤后24h肿瘤的he染色图片；图9d)为c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4按照实施例4的方法治疗h22肿瘤后24h肿瘤的he染色图片。

图10为生理盐水组、c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4治疗后24h小鼠各器官的he染色图片；图10中，a1-a5分别为生理盐水组治疗心、肝、脾、肺、肾的he染色图片，b1-b5分别为c70(oh)29治疗心、肝、脾、肺、肾的he染色图片，c1-c5分别为c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4治疗心、肝、脾、肺、肾的he染色图片

图11为生理盐水组、c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4对小鼠肉瘤s180的治疗前后的效果对比图，其中图11中a1、a2、a3分别为生理盐水组、c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4对小鼠肉瘤s180的治疗前的图片；图11b1、b2、b3分别为生理盐水组、c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4对小鼠肉瘤s180的治疗后的图片。

图12为本发明实施例6中c70(oh)29药物组及生理盐水对照组在不同时间点的肿瘤部位荧光成像。

图13为本发明实施例6中c70(oh)29药物组及生理盐水对照组的肿瘤生长曲线。

图14为本发明实施例6中c70(oh)29在治疗后4h通过透射电镜观察的肿瘤血管内皮连接的变化。

图15为本发明实施例6中c70(oh)29在治疗后2h和6h时通过cd31染色观察肿瘤血管内皮连接的变化。

图16为本发明实施例6中c70(oh)29在治疗后不同时间点时肿瘤中ve-cadherin的免疫印迹实验结果。

图17为本发明实施例6中c70(oh)29药物组及生理盐水对照组小鼠的体重变化曲线。

图18为本发明实施例7中c70-oh抑制小鼠肝癌肿瘤生长的实验流程图。

图19为本发明实施例7中不同组在不同时间点的小鼠肝癌肿瘤的生长情况图片，其中saline(ip)为腹腔注射生理盐水的对照组；c70-oh(ip)为腹腔注射c70-oh的药物组；c70-oh(iv)为静脉注射c70-oh的药物组。

图20为本发明实施例7中药物组及对照组在实验结束时每组的各4只平行小鼠的肝癌肿瘤的对比照片。

图21为本发明实施例7中药物组及对照组的肿瘤体积及质量数据。

图22为本发明实施例7中药物组及对照组在实验期间小鼠的体重增长曲线。

图23为本发明实施例7中药物组及对照组常规血液指标数据。

图24为本发明实施例7中药物组及对照组血生化指标数据，其中alt为谷丙转氨酶；ast为谷草转氨酶；alp为碱性磷酸酶；bun为尿素氮。

图25为本发明实施例8中药物组及对照组的肿瘤生长曲线。

图26为本发明实施例8中药物组及对照组在实验期间小鼠的体重增长曲线。

图27为本发明实施例8中药物组及对照组血生化指标数据，其中alt为谷丙转氨酶；ast为谷草转氨酶；alp为碱性磷酸酶；bun为尿素氮。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中所用的原料富勒烯c70固体，纯度99％，购自厦门福纳新材料科技有限公司。

下述实施例中，水溶性富勒烯结构中修饰的羟基数目及氨基酸数目均为加权平均值，是通过元素分析及热重分析综合计算所得。

实施例1、水溶性富勒烯结构的合成

(1)c70(oh)29·10h2o的合成

在甲苯溶液中将c70与浓度为50％的naoh溶液混合，并加入少量相转移催化剂四甲基氢氧化铵(tbah)，搅拌24h，加入乙醇用于沉淀产物，离心除去上层液体，之后将收集的沉淀产物溶于超纯水中，透析除去过量naoh，得到产物c70(oh)29·10h2o，冷冻干燥保存。

(2)c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4·15h2o的合成

将含有丝氨酸的naoh溶液(其中naoh溶液中naoh质量分数为33％，丝氨酸与naoh的摩尔比是1:4)与乙醇混合，并逐滴加入到c70(使丝氨酸与c70的摩尔比为100:1)的甲苯溶液中，搅拌过夜(12h)，除去上层甲苯层，下层产物透析除去过量naoh，冷冻干燥保存。

(3)c70(oh)24·5h2o的合成

(a)将7ml质量百分含量为30％的过氧化氢水溶液和3ml质量百分含量为40％的氢氧化钠溶液加入100ml圆底烧瓶，加入200mg富勒烯c70固体，再加入磁力搅拌子(型号：b200)，使用磁力搅拌器搅拌24h(温度：50℃，转速：1000r/min)，使用溶剂过滤器(容积：1l，滤膜孔径：200nm，津腾公司)过滤得到棕黄色溶液。

(b)将(a)步骤得到的溶液加入50ml的离心管中，再加入过量的浓度为95％的乙醇。经过离心(转速：10000r/min，时间：4min)后去除上层无色溶液，将收集的沉淀溶于超纯水中，得到黄色澄清溶液。

(c)将(b)步骤得到的溶液装入透析袋(截止分子量为3500)放入超纯水中透析，室温透析至超纯水的电导率小于1μs/cm，得到黄色溶液。

(d)将(c)步骤透析后的溶液装入50ml塑料离心管中，使用液氮冷冻后放入冷冻干燥机中冷冻干燥(温度：-29℃，真空度：55pa，时间：48h)，将得到的黄色固体装入棕色样品瓶中备用。

实施例2、修饰水溶性富勒烯结构的羟基数及氨基酸数

(1)测定实施例1中第(1)部分所得水溶性富勒烯结构修饰的羟基数目

根据元素分析(flashea1112)结果：c53.55％，h3.19％，n<0.3％，结合热重分析、微商热重分析曲线(如图1所示)计算实施例1中第(1)部分所得水溶性富勒烯结构修饰的羟基数目。从热重分析可知，c70(oh)x固体粉末中含11.8％的水，约为10个水分子，结合元素分析中h含量推算属于羟基中的h含量为1.87％，由此可计算c70(oh)x中羟基数目为29，所以该产物的平均分子式为c70(oh)29·10h2o，之后简称为c70(oh)29。

(2)测定实施例1中第(2)部分所得水溶性富勒烯结构修饰的羟基数目和氨基酸数目

根据元素分析(flashea1112)结果：c47.99％，h3.21％，n2.68％，结合热重分析、微商热重分析曲线(如图2所示)计算c70(oh)x(ch2ohchnhcooh)y修饰的羟基及丝氨酸数目。从热重分析可知，c70(oh)x(ch2ohchnhcooh)y固体粉末中含12.8％的水，约为15个水分子，结合元素分析中n含量与c含量的比值，可推算碳笼表面修饰了4个丝氨酸分子。再根据元素分析所测粉末h总量与h2o及丝氨酸中h含量的差值，可计算得羟基数目为13，所以该产物的平均分子式为c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4·15h2o，之后简称为c70-ser或c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4。

(3)测定实施例1中第(3)部分所得水溶性富勒烯结构修饰的羟基数目

根据元素分析(flashea1112)的结果：c含量为37.85％，h含量为1.51％，n含量<0.3％，结合热重分析、微商热重分析曲线(如图3所示)计算c70(oh)x中修饰的羟基数目。从热重分析可知，所得固体粉末中含3.7％的水，约为5个水分子，结合元素分析中h含量与c含量的比值，可推算碳笼表面修饰了24个羟基，所以该产物的平均分子式为c70(oh)24·5h2o，之后简称为c70(oh)24或c70-oh。

实施例3、水溶性富勒烯纳米材料水合粒径的测定

取少量本发明实施例1制备的c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4和c70(oh)24粉末溶于水配成稀溶液，由于分子间相互作用，c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4和c70(oh)24在水中团聚成纳米颗粒，形成水合粒径在1～200nm的颗粒。

采用动态光散射(dls，zetasizernanozsp)测定了在ph＝7.0的纯水中纳米颗粒的水合粒径，c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4和c70(oh)24的平均粒径分别为136.4±0.5nm、134.7±0.4nm和135.9nm，参见图4和图5。c70(oh)29的zeta电势为-55.6mv，参见图6。

实施例4、c70(oh)29、c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4对小鼠肝癌肿瘤的治疗效果

动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：小鼠肝癌h22瘤株。

实验分组：药物a组：c70(oh)29；药物b组：c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4(c70-ser)；对照组：生理盐水。

给药方式：静脉注射。

给药剂量：5mg/ml，单次注射150μl。

实验方法：小鼠皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的h22肝癌细胞。生长约5-7天后，肿瘤尺寸达到50-100mm³进行实验。对药物a组和b组分别通过尾静脉注射c70(oh)29及c70-ser这两种药物150μl(5mg/ml)于荷瘤鼠体内，注射药物10分钟后，施加射频(200mhz，5mw)治疗1h。对照组注射同等剂量的生理盐水。观察治疗前后肿瘤部位的变化，实验结束后取小鼠脏器及肿瘤，用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：对比药物组和对照组(图7和图8)能明显发现，治疗后肿瘤部位发生了明显的变黑，随着时间的延长，肿瘤部位变黑更为明显。在本实施例中只观察到治疗后24h，解剖小鼠肿瘤发现肿瘤内部出现大量出血现象，这主要是由于肿瘤血管较正常组织血管有很大不同，肿瘤血管的内皮细胞间隙较大、结构不完整，导致肿瘤血管通常包含有大量纳米尺度的小孔，富勒烯颗粒能嵌入这些小孔破坏肿瘤血管，从而导入肿瘤内部大量出血，切断了肿瘤组织的营养供应，进而抑制了肿瘤的生长。从he染色切片(图9)可知，c70(oh)29及c70-ser治疗后，肿瘤细胞大量坏死凋零，而对照组肿瘤细胞则呈现旺盛生长的趋势，说明本发明水溶性富勒烯纳米材料对肝癌肿瘤有明显的抑制效果。而且从短期观察看，c70(oh)29及c70-ser这两种药物对小鼠各器官未造成明显的损伤，参照图10，说明c70(oh)29及c70-ser这两种药物短期使用无毒害作用。

实施例5、c70(oh)29及c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4对小鼠肉瘤的治疗效果

动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：小鼠肉瘤s180瘤株。

实验分组：药物a组：c70(oh)29；药物b组：c70(oh)13(ch2ohchnhcooh)4(c70-ser)；对照组：生理盐水。

给药方式：静脉注射。

给药剂量：5mg/ml，注射150μl。

实验方法：小鼠皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的s180肉瘤细胞。生长约5-7天后，肿瘤尺寸达到50-100mm³进行实验。对药物a组和b组分别通过尾静脉注射c70(oh)29及c70-ser这两种药物150μl(5mg/ml)于荷瘤鼠体内，注射药物10分钟后，随后施加射频(200mhz，5mw)治疗1h。对照组注射同等剂量的生理盐水。观察治疗前后肿瘤部位的变化。实验结束时取小鼠脏器及肿瘤，用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：对比药物组和对照组(图11)能明显发现，治疗前后肿瘤部位发生了明显的变黑，说明本发明c70(oh)29及c70-ser这两种药物对小鼠肉瘤也有较好的治疗效果。

实施例6、c70(oh)29对小鼠乳腺癌肿瘤的治疗作用

动物品系：balb/c裸鼠，雌性，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：绿色荧光蛋白标记的小鼠乳腺癌瘤株(4t1-gfp)。

给药方式：静脉注射。

给药剂量：4mg/ml，单次注射150μl，共注射2次。

实验分组：c70(oh)29药物组；生理盐水对照组。

实验方法：小鼠皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的4t1-gfp乳腺癌肿瘤细胞。生长约5-7天后，肿瘤尺寸达到50-100mm³进行实验。对药物组通过尾静脉注射c70(oh)29150μl(4mg/ml)于荷瘤鼠体内。对照组注射同等剂量的生理盐水。观察治疗前后肿瘤部位的变化并进行荧光成像，观察7天后进行第2次给药，并于第11天结束实验，取小鼠脏器及肿瘤，用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：对比药物组和对照组(图12)能明显发现，治疗后肿瘤部位荧光强度显著降低，且在24h时最为明显。从长期观察小鼠的肿瘤生长情况(如图13)可知，4t1-gfp瘤株在治疗后第7天开始，对照组肿瘤生长迅速，而注射c70(oh)29的药物组对肿瘤有明显的治疗作用，这从肿瘤的体积上得以体现。

取治疗后4h的小鼠肿瘤进行组织透射观察，正常肿瘤组织具有完整、连续的血管内皮连接(如图14)，经过c70(oh)29的药物治疗后，血管内皮细胞连接遭到破坏，出现断裂。在治疗后2h和6h取肿瘤做cd31免疫染色，也发现，血管内皮连接出现断裂，红细胞大量外渗(如图15)。这些结果说明c70(oh)29能够破坏肿瘤血管内皮连接，造成红细胞渗出，破坏肿瘤生长。

分别取治疗后不同时间的肿瘤做免疫印迹试验(westernblot)，从图16中能看出c70(oh)29治疗后4h肿瘤部位的ve-cadherin含量显著减少，说明c70(oh)29能靶向降低肿瘤血管的ve-cadherin，从而破坏肿瘤血管内皮连接，造成肿瘤血管的破裂，切断肿瘤细胞的营养供应抑制肿瘤生长。随着时间的延长，肿瘤部位的ve-cadherin含量有逐渐恢复的情况，说明4t1-gfp的瘤株有复发的趋势，所以实验设计中进行了二次治疗防止复发。ve-cadherin(血管内皮钙粘蛋白，也称为血管内皮钙粘附素)属于ⅱ型钙粘蛋白，是血管内皮细胞表面特异的跨膜粘附蛋白。它介导了相邻内皮细胞之间的粘附连接，并且在保持血管的完整性、调节内皮细胞之间的通透性、调节内皮细胞内的信号传导、血管发生形成和血管内环境的稳定中发挥了重要作用。

从图17可得知，通过对比c70(oh)29药物组及对照组小鼠的体重变化，注射c70(oh)29药物的小鼠体重一直处于稳定上升的趋势，基本与对照组小鼠保持一致的状态，说明c70(oh)29无明显的毒副作用，这也表明了c70(oh)29药物的安全性。

实施例7、c70-oh(即c70(oh)24)对小鼠肝癌肿瘤的生长抑制作用

动物品系：balb/c雌鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：小鼠肝癌h22瘤株。

给药方式：静脉注射(iv)，腹腔注射(ip)。

实验分组：1、药物a组：c70-oh(ip)；2、药物b组：c70-oh(iv)；3、对照组：生理盐水(saline(ip))。每组4只balb/c雌鼠。

实验方法：小鼠皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的h22肝癌细胞，接种24h后开始给药，药物组和对照组分别按照图16进行给药。药物a组和药物b组使用1mg/ml的c70-oh，连续给药6天后每隔一天给药一次，共给药10次。实验期间每隔一天称量小鼠体重并观察肿瘤生长情况，观察至接种后15天结束实验(如图18)。取小鼠肿瘤称重及测量体积，同时取脏器用4％的多聚甲醛固定液固定。给药剂量：1mg/ml，单次注射0.15ml，共注射10次。

实验结果：对比药物组及对照组，能发现药物组肿瘤明显小于对照组，表示c70-oh药物能抑制肿瘤生长。

从长期观察小鼠的肿瘤生长情况(如图19)可知，从接种h22瘤株第7天开始，对照组肿瘤逐渐开始成熟长大，而注射c70-oh的两个药物组均对肿瘤有一定的抑制作用，由于静脉注射药物吸收率更佳，抑制作用更为明显，这从肿瘤的体积及质量上也得以体现。图20和图21中静脉注射c70-oh组的肿瘤体积及质量都比腹腔注射的更小。

从图22可得知，通过对比不同组小鼠的体重变化，对照组小鼠在前期体重上升较快，但在接种11天后体重反而呈现下降的趋势，表面肿瘤过大已经影响了小鼠的正常生长；注射c70-oh药物的两组小鼠体重一直处于稳定上升的趋势，虽然前期上升幅度没有对照组大，但是后期涨幅较快，说明c70-oh可以有效地抑制小鼠肿瘤的生长，并无明显的毒副作用。从图23和图24可知，c70-oh药物组与对照组在常规血液指标及血生化指标上无明显差异，这也表明了c70-oh药物的安全性。

实施例8、c70-oh(即c70(oh)24)对小鼠乳腺癌肿瘤的生长抑制作用

动物品系：balb/c雌性裸鼠，5周，体重在16-20g之间。

肿瘤模型：人源乳腺癌mda-mb-231。

给药方式：腹腔注射。

实验分组：1、生理盐水对照组；2、阳性药物(紫杉醇，paclitaxel)对照组；3、试验组(c70-oh，1mg/ml)。

实验方法：皮下接种100μl浓度为5×10⁷/ml的人源乳腺癌mda-mb-231细胞，接种24h后开始给药。各个组的给药剂量如下：生理盐水组每天给200μl生理盐水；阳性药物对照组每隔3天给药1次，每次给药的剂量为10mg/kg；试验组每天给药，每天给药的剂量为5mg/kg；到第21天结束试验。实验期间每隔一天称量小鼠体重并观察肿瘤生长情况，观察至接种后21天结束实验，取小鼠肿瘤称重及测量体积，同时取脏器用4％的多聚甲醛固定液固定。

实验结果：如图25所示，阳性药物对照组及试验组的肿瘤体积明显小于生理盐水对照组，从实验结束时肿瘤重量看(如下表)，阳性药物对照组及试验组的肿瘤重量也明显小于生理盐水对照组，表示c70-oh药物能抑制肿瘤的生长。

对比不同组小鼠的体重变化，从图26可得知，阳性对照药物组的小鼠体重先有所增加，在用药中期快速下降，当用药时间持续加长时，体重下降明显，体现了阳性对照药的副作用。试验组小鼠在前期体重上升较快，整个用药期间其体重都高于生理盐水对照组小鼠的体重，说明c70-oh对小鼠并无明显的毒副作用。从图27可知，c70-oh药物组与对照组在常规血液指标及血生化指标上无明显差异，这也表明了c70-oh药物的安全性。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。