一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法与流程

本发明属于生物学和组织工程学技术领域，具体涉及一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法。

背景技术：

为了维持3D打印精确的打印分辨率，在生物墨水中接种的细胞密度不宜过大，然而高密度细胞是组织工程中间充质干细胞生成细胞外基质的必要条件。间充质干细胞是具有多种功能的前体细胞，具有软骨、成骨及脂肪分化的能力，同时还能分泌多种细胞因子，在细胞凋亡、分化及免疫反应中具有重要的调控作用。间充质干细胞易于分离和收集，在生物打印过程中应用广泛。然而，在软骨分化过程中间充质干细胞过度增生依然是无法攻克的难题。研究发现NR2F2在调控肌肉和脂肪功能中具有重要作用，且NR2F2的激活与间充质干细胞成成骨分化以及肌肉生成相关。进一步实验发现NR2F2基因过低表达的内皮细胞有向间充质干细胞转化的趋势，然而NR2F2基因过高表达则呈现相反的结果。因此构建间充质干细胞NR2F2基因过高表达诱导软骨分化具有可行性和应用前景。

组织工程的出现为软骨损伤的修复提供了一种新的、有效的治疗手段。通过生物3D打印并种植人间充质干细胞体外诱导分化构建功能关节软骨是一种极具科学研究和临床治疗意义的方法。同时，探讨NR2F2在间充质干细胞二维培养、三维细胞球培养以及生物打印软骨组织培养过程中对软骨分化及生成的作用。而NR2F2介导间充质干细胞软骨分化的机制可能与间充质干细胞缺氧通路有关。

综上所述，软骨组织工程领域迫切需要开发一种新的构建功能软骨的方法，在能够有效达到促进软骨组织分化生长目的的同时，还能有效缓解间充质干细胞过度增长的缺陷。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，现提供一种能够极大促进间充质干细胞分化促进关节软骨组织生长的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法，其创新点在于：包括以下步骤：a）分离人间充质干细胞，b）在间充质干细胞中利用慢病毒稳定过表达NR2F2基因以及小RNA干扰技术下调NR2F2基因表达，c）间充质干细胞NR2F2基因过表达以及下调表达后3D细胞微球的培养，d）将人间充质干细胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引发剂以及PBS混合制备生物墨水，e）使用生物打印机在生物打印纸上打印过表达NR2F2基因的3D水凝胶软骨组织，f）在软骨形成培养基及小鼠皮下培养3D水凝胶软骨组织21天以形成关节软骨组织。

进一步的，所述步骤a）中间充质干细胞来源于22岁男性骨髓捐献者，所有实验均使用第三代细胞。

进一步的，所述步骤b）中使用转染试剂将慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP 或pCDH-EF1-T2A-GFP序列与pCMV-VSVG 及 pCMV-dvpr共同转入293FT细胞中扩增培养，2-3天后离心收集上清液，慢病毒使用浓度为10MOI同时给予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因过表达效率达到初始含量的40倍以上。

进一步的，所述步骤b）小RNA干扰人骨髓间充质干细胞NR2F2基因的表达中使用的是脂质体转染试剂及OMEM，RNA使用终浓度调整为10nM，其中作用时间为72小时，转染效率达到80-90%。

进一步的，所述步骤c）中分别将NR2F2基因过表达组及其对照组和NR2F2基因下调表达组及其对照组的间充质干细胞的细胞数目调整为5×10⁵个，离心机300g离心5分钟后继续培养2-3天，待球型颗粒形成后转移至低粘附的24孔板内继续培养21天。

进一步的，所述步骤d）中先取一定量的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于PBS中形成终浓度为10%(w/v)的溶液，然后加入丙烯酸酯肽使终浓度为1mM，最后加入光引发剂2959并调整溶液浓度为0.05%(w/v)，然后过滤除菌，将培养状态良好的NR2F2基因过表达人间充质干细胞以及对照组人间充质干细胞在以上溶液中混合均匀，并调整细胞密度为6×10⁶cells/ml。

进一步的，所述步骤e）中生物打印机在生物打印纸上打印构建NR2F2基因过表达的3D水凝胶软骨组织的具体步骤包括：生物打印机打印前准备工作；将制备好的生物墨水装入打印笔内并用锡箔纸包住；使用打印软件设计目标模型及模型尺寸；在3D生物打印纸上层层打印以及同时光聚反应构建NR2F2基因过表达的3D水凝胶软骨组织以及其对照组的3D水凝胶软骨组织。

进一步的，所述步骤f）中将NR2F2基因过表达的3D打印软骨组织及其对照组的3D打印软骨组织分别转移24孔板，在体积为1ml和10ng/mL TGFβ的诱导培养基中继续培养21天，培养温度均为37℃，培养环境为含5%(v/v) CO₂的湿润空气，每3天更换培养基一次，或者将NR2F2基因过表达的3D打印软骨组织及其对照组3D打印软骨组织分别植入小鼠皮下继续培养21天。

本发明的有益效果如下：本发明提供的一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进间充质干细胞软骨组织分化，能够为软骨组织工程的科学研究以及软骨损伤的临床治疗提供有益的参考，为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。

附图说明

图1为本发明一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法中由间充质干细胞NR2F2稳定过表达及干扰表达第7天及第21天后的情况。

图2为本发明一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法中由间充质干细胞第21天NR2F2过表达及干扰后细胞微球3D培养过程中软骨分化及生成基因的表达情况。

图3为本发明一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法中由间充质干细胞第7天及21天NR2F2过表达及干扰后细胞微球3D培养过程中软骨组织相关蛋白及DNA表达情况。

图4为本发明一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法中由间充质干细胞第21天NR2F2过表达后3D生物打印体内培养过程中新生软骨组织生成情况。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。

一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法，包括以下步骤：a）分离人间充质干细胞，b）在间充质干细胞中利用慢病毒稳定过表达NR2F2基因以及小RNA干扰技术下调NR2F2基因表达，c）间充质干细胞NR2F2基因过表达以及下调表达后3D细胞微球的培养，d）将人间充质干细胞、聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯、丙烯酸酯肽和2959光引发剂以及PBS混合制备生物墨水，e）使用生物打印机在生物打印纸上打印过表达NR2F2基因的3D水凝胶软骨组织，f）在软骨形成培养基及小鼠皮下培养3D水凝胶软骨组织21天以形成关节软骨组织。

优选的，步骤a）中间充质干细胞来源于22岁男性骨髓捐献者，所有实验均使用第三代细胞。

优选的，步骤b）中使用转染试剂将慢病毒pCDH-EF1-Nr2f2-T2A-GFP 或pCDH-EF1-T2A-GFP序列与pCMV-VSVG 及 pCMV-dvpr共同转入293FT细胞中扩增培养，2-3天后离心收集上清液，慢病毒使用浓度为10MOI同时给予2mg/mL嘌呤霉素，其中NR2F2基因过表达效率达到初始含量的40倍以上。

优选的，步骤b）小RNA干扰人骨髓间充质干细胞NR2F2基因的表达中使用的是脂质体转染试剂及OMEM，RNA使用终浓度调整为10nM，其中作用时间为72小时，转染效率达到80-90%。

优选的，步骤c）中分别将NR2F2基因过表达组及其对照组和NR2F2基因下调表达组及其对照组的间充质干细胞的细胞数目调整为5×10⁵个，离心机300g离心5分钟后继续培养2-3天，待球型颗粒形成后转移至低粘附的24孔板内继续培养21天。

优选的，步骤d）中先取一定量的聚乙烯乙二醇二甲基丙烯酸酯溶于PBS中形成终浓度为10%(w/v)的溶液，然后加入丙烯酸酯肽使终浓度为1mM，最后加入光引发剂2959并调整溶液浓度为0.05%(w/v)，然后过滤除菌，将培养状态良好的NR2F2基因过表达人间充质干细胞以及对照组人间充质干细胞在以上溶液中混合均匀，并调整细胞密度为6×10⁶cells/ml。

优选的，步骤e）中生物打印机在生物打印纸上打印构建NR2F2基因过表达的3D水凝胶软骨组织的具体步骤包括：生物打印机打印前准备工作；将制备好的生物墨水装入打印笔内并用锡箔纸包住；使用打印软件设计目标模型及模型尺寸；在3D生物打印纸上层层打印以及同时光聚反应构建NR2F2基因过表达的3D水凝胶软骨组织以及其对照组的3D水凝胶软骨组织。

优选的，步骤f）中将NR2F2基因过表达的3D打印软骨组织及其对照组的3D打印软骨组织分别转移24孔板，在体积为1ml和10ng/mL TGFβ的诱导培养基中继续培养21天，培养温度均为37℃，培养环境为含5%(v/v) CO₂的湿润空气，每3天更换培养基一次，或者将NR2F2基因过表达的3D打印软骨组织及其对照组3D打印软骨组织分别植入小鼠皮下继续培养21天。

为了进一步了解本发明方法的效果，对培养出来的软骨组织进行了相应的鉴定。

（1）实时定量PCR分析软骨细胞基因表达

采用组织破碎仪将制备的细胞微球、3D打印软骨物以及人软骨组织于0.5mLTrizol破碎完全，提取上述样品中RNA并采用Nanodrop 2000测定样品中RNA的含量及纯度，最后逆转录得cDNA，采用TaqMan基因表达检测探针利用RT-PCR检测软骨相关基因表达情况。如图1、图2所示，分别为以上基因在NR2F2过表达及干扰表达情况下的表达情况。结果表明NR2F2基因能够对3D细胞微球培养及打印软骨的基因表达水平产生影响。

（2）生化检测

样品经组织破碎仪破碎后，100μg/mL胃蛋白酶4℃消化7天或125mg/mL木瓜蛋白酶60℃消化16小时后，二甲基亚甲基蓝染料测定粘多糖GAG含量，ELISA检测试剂盒测定I型、II型胶原，CyQUANT试剂盒检测得到样品中DNA含量，检测发现人间充质干细胞3D微球培养第7天时碱性磷酸酶ALP水平随着NR2F2基因过表达而减少，NR2F2表达减少而增多，结果如图3所示。

（3）打印组织皮下植入

将过表达NR2F2基因的间质干细胞打印组织及对照的间质干细胞打印组织分别植入6周龄雄性小鼠皮下，异氟烷麻醉后沿着胃中线剪开约8mm的切口以创建皮下口袋，将打印组织放入离切口约1cm的口袋内，切口3号线缝合，继续观察1-2小时待老鼠完全恢复，继续饲养21天后观察。

（4）组织学分析

根据标准组织学检测方法，收集细胞水凝胶结构组织置于10%（v/v）福尔马林中固定过夜，按照操作方案脱水完全后转移至二甲苯透明直至包埋入石蜡中，然后进行石蜡切片，切片厚度为5微米。最后用番红O或固绿对上述制备的切片进行染色，观察样品中的细胞及蛋白聚糖，结果如图4所示。

（5）打印组织机械性能测试

采用步进式压缩的方式，用测试速度为0.1mm/s的应变荷载将水凝胶压缩至最大压缩张力的20%。结果表明所过表达NR2F2基因打印的软骨组织机械强度于21天明显强于正常打印的软骨组织，表明过表达NR2F2基因打印的软骨组织达到或优于天然软骨的生物力学特性。

（6）生物支架溶胀系数检测

将打印的支架水凝胶在37℃的DMEM中放置48小时后称重，得到溶胀后质量Ws；将打印的支架水凝胶冻干48小时，称重得到干重Wd。平衡溶胀比Q= Ws /Wd，水含量M=（Ws -Wd）/ Ws。结果表明所打印的关节软骨组织和天然组织非常相似。

本发明提供的一种促进间充质干细胞软骨组织分化的方法可靠、操作简便、可重复性强，能够有效促进间充质干细胞软骨组织分化，能够为软骨组织工程的科学研究以及软骨损伤的临床治疗提供有益的参考，为生物打印技术的临床化提供有效的方法及技术支撑。

上述实施例只是本发明的较佳实施例，并不是对本发明技术方案的限制，只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案，均应视为落入本发明专利的权利保护范围内。