一种提高硫酸新霉素抗菌药效的增效剂的制作方法

本发明属于医药技术领域，涉及水产养殖细菌感染的防治新方法，具体是一种提高硫酸新霉素抗嗜水气单胞菌药效的增效剂。

背景技术：

嗜水气单胞菌在河流、湖泊、池塘、食物、动物及人体等自然环境中广泛存在。嗜水气单胞菌属于条件性致病菌，可引起多种水生动物和陆生动物患病，是一种典型的人-畜-鱼共患病病原菌，当环境条件恶劣，机体抵抗力下降可导致鱼类、两栖类、爬行类等冷血动物和哺乳动物发病，引发水生动物细菌性出血病、体表溃疡症以及哺乳动物腹泻等，是鱼类、爬行类和人类的一种致命传染源。为了预防和治疗病原菌引起的疾病，多采用抗生素的方法，而长期滥用抗生素导致水产用抗菌药物出现多重耐药、交叉耐药现象严重，给水产动物疾病防治带来极大的困难。因此，针对水产养殖过程中嗜水气单胞菌感染的问题，开发一种防治水产养殖动物嗜水气单胞菌的药物防治策略，以提高防治效果、降低嗜水气单胞菌耐药性和避免抗菌药物的残留问题，促进水产养殖业的健康和可持续发展。

硫酸新霉素为氨基糖苷类抗生素，可抑制细菌蛋白质合成，对葡萄球菌属、需氧革兰氏阴性杆菌、部分结核分支杆菌有较好的抗菌活性，常用于畜禽、养殖鱼类细菌性病害的防治。由于该药物具有较强的耳毒性和肾毒性，残留在食品中的硫酸新霉素是潜在的安全隐患。因此，在具有相同杀菌效果的情况下，大幅降低或控制该药物在水产养殖中的使用量，对于水产品安全和生态环境保护具有重要的意义。

精氨酸作为一种α-氨基酸，分子式为C₆H₁₄N₄O₂，分子量为174.2，是构成蛋白质的20种氨基酸之一。在哺乳动物，精氨酸被分类为半必要或条件性必要的氨基酸，视乎生物的发育阶段及健康状况而定。目前研究集中在斑点叉尾鮰、建鲤、大菱鲆、草鱼等几种鱼类，国内外已经开展了许多关于精氨酸在水产动物体内的合成、生理功能和需求量等方面的研究，并取得了较大的进展。精氨酸作为水产动物营养需求的重要氨基酸，在水产养殖饲料中添加适量的精氨酸，可以提高饲料蛋白质的营养价值。研究表明，精氨酸对鲤鱼、鲫鱼、鲂鱼和大麻哈鱼有诱食作用。精氨酸提高鱼体的免疫作用表现在，精氨酸能增强鱼鳃组织物理屏障功能，提高吞噬细胞吞噬能力和杀菌活性，提高抗菌物质杀菌活性和免疫球蛋白含量，以增强鱼类非特异性和特异性免疫功能。同时，精氨酸具有抗炎作用，能保护鱼体免受免疫应答的自我损伤。总的来说，精氨酸作为一种功能性氨基酸，对鱼类的特异性免疫和非特异性免疫都起着很重要的作用。然而，精氨酸作为抗菌药物增效剂的研究尚未见报道。如将精氨酸作为药物或饲料添加剂，用于防治水产养殖中容易出现的病害完全符合无公害水产业、生产绿色水产品的疾病防治准则，尤其适用于当前水产业集约化、规模化生产的需要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种提高硫酸新霉素抗菌药效的增效剂，精氨酸与硫酸新霉素联合使用能够大幅度增强硫酸新霉素的杀菌效果，提高鱼体感染细菌后的存活率，为水产养殖过程中硫酸新霉素的使用提供了一种新方法，精氨酸与硫酸新霉素的联合使用能够大幅度降低抗生素的使用量，同时提高鱼体对细菌感染的防治水平。

本发明为实现上述目的采用如下技术方案：

一种提高硫酸新霉素抗菌药效的增效剂，其特征在于：该增效剂为精氨酸，通过精氨酸与硫酸新霉素的联合使用以增强抗菌药物硫酸新霉素的药效，进而减少硫酸新霉素的用药量。

进一步优选，所述的精氨酸与硫酸新霉素的重量比为1.36-871:1。

进一步优选，所述的精氨酸作为增效剂用于增加硫酸新霉素在体外杀灭细菌的能力。

进一步优选，所述的精氨酸作为增效剂用于增加硫酸新霉素在体内清除细菌的能力。

进一步优选，所述的精氨酸作为增效剂用于与硫酸新霉素联合使用以提高鱼体感染细菌的存活率。

进一步优选，所述的细菌为嗜水气单胞菌。

本发明经体外、体内实验证实，精氨酸能够增强硫酸新霉素的杀菌效果；其联合运用能提高鱼体嗜水气单胞菌感染的治疗效果，大幅增加鱼体存活率。在水产养殖业病原菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，大幅度降低抗菌药物硫酸新霉素的使用量，同时提高抗菌药物硫酸新霉素的防治效果，有助于无公害水产养殖技术的推广。

附图说明

图1是10mM精氨酸添加前后不同硫酸新霉素作用后的细菌存活率图；

图2是不同剂量精氨酸联合硫酸新霉素作用后的细菌存活率图；

图3是10mM精氨酸添加前后硫酸新霉素杀菌的时间依赖关系图；

图4是精氨酸联合硫酸新霉素作用后淇河鲫肝脏、脾和肾脏中细菌含量图；

图5是细菌攻毒后注射精氨酸或/和硫酸新霉素对鱼体的保护作用对比图；

图6是细菌攻毒后口服精氨酸或/和硫酸新霉素对鱼体的保护作用对比图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1

精氨酸增加硫酸新霉素在体外杀灭细菌的能力

1、细菌培养与生存率体外实验方法

（1）挑取嗜水气单胞菌单菌落接种于100mL LB培养基中，28℃振荡培养过夜；

（2）取适量的菌液于12000rpm、5min离心收集菌体，用质量浓度为0.85%的生理盐水洗涤菌体2次，悬浮于含10mM 乙酸钠的M9培养基中，调OD600值至0.6；

（3）加入相应的代谢物和适量的抗生素于试管中，加M9培养基至5mL体系，28℃培养6h；

（4）在特定的时间点，取100uL样品，采用系列稀释法，取10uL进行点板计数，计算细菌cfu/mL（菌落形成单位/毫升）。不经过抗生素和代谢物处理的样品作为起始细菌数，细菌菌落数在20-200的数据可用于统计分析。细菌存活率（percent survival）是抗生素和代谢物处理后的细菌cfu与起始细菌cfu的百分比。

2、精氨酸在提高硫酸新霉素杀菌效果方面具有抗生素浓度依赖效应

10mM精氨酸能显著提高硫酸新霉素的杀菌作用，随着抗生素浓度的增加其增效作用也越来越明显。精氨酸提高硫酸新霉素对嗜水气单胞菌的杀菌倍数，分别增加6.6、10.6、45.4、86.5、135和199倍（图1）。从图中虚线标识可以看出，单独使用32μg/mL硫酸新霉素，尚不及精氨酸联合8μg/mL硫酸新霉素的杀菌效果，即精氨酸与硫酸新霉素联合使用，至少可降低4倍硫酸新霉素使用量。

3、精氨酸在提高硫酸新霉素杀菌效果方面具有物质剂量依赖效应

选择细菌存活率在50%左右的抗生素浓度，进一步探讨精氨酸物质梯度的作用效果。结果发现，0.078mM的精氨酸也明显提高硫酸新霉素的杀菌作用。对嗜水气单胞菌来说，在8μg/mL硫酸新霉素条件下，0.3125-20mM的精氨酸提高杀菌倍数为3.1、3.6、6.4、8.7、10.9、44.2、52.2和166.1倍（图2）。

4、精氨酸在提高硫酸新霉素杀菌效果方面具有作用时间依赖效应

进一步研究了精氨酸协同硫酸新霉素杀菌作用与时间的关系。对于嗜水气单胞菌，采用20mM精氨酸分别与8μg/mL硫酸新霉素协同杀菌，在0、2、4、6、8、10h取样，并点板计数，结果可以看到，随着时间延长，同时添加硫酸新霉素和精氨酸的试验组生存率下降越来越显著，在10h分别提高硫酸新霉素对该种细菌的杀菌作用为217.2倍（图3）。

实施例2

精氨酸增加硫酸新霉素在体内清除细菌的能力

1、鱼体感染与细菌清除实验：嗜水气单胞菌Ah-479为高毒力菌株，淇河鲫腹腔注射100μL 1.0×10⁷cfu/mL的细菌悬液，24h后，淇河鲫随机分为4组，每组6尾，分别为：生理盐水对照组、代谢物组、抗生素组和相应浓度的抗生素与代谢物组。精氨酸的剂量为100mg/kg，硫酸新霉素的使用剂量为40mg/kg。治疗24h后，取鱼体肝脏、肾脏、脾等组织并称重，加入1mL生理盐水充分研磨匀浆，进行梯度稀释并平板计数检测组织中的细菌含量（cfu/g）。

2、精氨酸联合硫酸新霉素能显著清除鱼体组织中的嗜水气单胞菌

细菌计数结果表明，单独精氨酸治疗能促进鱼体对病原菌的清除，特别是肝脏组织中，与对照组相比，细菌数下降约10倍。精氨酸协同硫酸新霉素组具有最为明显的作用，在三个组织中，细菌数下降分别为23、7.5、20倍（图4）。

实施例3

精氨酸联合硫酸新霉素提高鱼体感染细菌的存活率

精氨酸联合硫酸新霉素提高鱼体治疗效果

Ah-479的半数致死剂量（LD₅₀）为1.55×10⁶cfu/g，当注射剂量为100μL 5.0×10⁷cfu/mL剂量时，在攻毒1h后，用注射或口服两种给药方式进行治疗。每种给药方式分为4个组：对照组为生理盐水、精氨酸组使用量为100mg/kg、硫酸新霉素组使用量为40mg/kg和100mg/kg精氨酸+40mg/kg硫酸新霉素组同时使用，所有注射注射或口服用药均为100μL/尾，每组20尾淇河鲫。细菌感染后，每12h观察一次鱼的发病和死亡情况，持续7d。药物保护率=[1-(给药组死亡率/对照组死亡率)]×100%。

注射实验结果显示，当注射剂量为100μL 5.0×10⁷cfu/mL细菌时，48h时以后鱼体的死亡情况稳定，不会再有死亡情况发生。对照组48h时鱼存活率10%；单独的抗生素治疗效果并不明显，48h时鱼存活率为25%；精氨酸组的保护作用明显，48h时鱼存活率为45%左右；精氨酸+硫酸新霉素组，48h时鱼存活率为100%，即注射联合用药对鱼体的保护率达100%（图5）。

口服实验结果显示，对照组48h时鱼存活率10%；单独的口服抗生素效果并不明显，48h时鱼存活率为20%；精氨酸组的保护作用明显，48h时鱼存活率为50%左右；精氨酸+硫酸新霉素组，48h时鱼存活率为85%，即口服联合用药对鱼体的保护率达88.2%（图6）。

以上实施例描述了本发明的基本原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。