本发明属于药学领域，具体而言涉及通佐溴铵在抗人巨细胞病毒感染中的应用。
背景技术：
人类疱疹病毒是一种双链DNA病毒，包括α、β、γ三个亚科。人类巨细胞病毒(HCMV)在分类上归疱疹病毒β亚科。HCMV只感染人类，主要的靶细胞有上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、外周血白细胞，能在体内进行传播。HCMV的母婴传播十分常见，先天性HCMV感染的新生儿可能会导致一系列的神经系统损伤，例如失明、耳聋、智力障碍等。因此，HCMV检测成为孕妇和新生儿保健的常规项目之一。当先天性感染的可能性很高并危害较大时，应及时对胎儿进行产前诊断，进行必要的干预或者终止妊娠。免疫功能不全患者例如艾滋病患者、接受治疗的癌症患者以及接受器官移植的患者等在感染HCMV后可能会造成肺炎、肝炎等并发症，很可能会对生命造成威胁，是导致器官移植患者移植失败和死亡的重要原因。此外，一些研究表明HCMV感染与冠心病、冠状血管成形术后再狭窄、动脉粥样硬化、移植血管硬化等心血管疾病的形成有关系。
HCMV蛋白酶是由病毒开放阅读框UL80编码的蛋白酶，是病毒支架蛋白的一部分。UL80全长编码一个大小为80KD的前体蛋白，其N端是具有全部酶活性的HCMV蛋白酶(HCMV protease，Pr)，大小约为29KD。C端是参与衣壳成熟的磷蛋白(Assembly protein，AP)，大小约为50KD。HCMV蛋白酶可对UL80编码的前体蛋白进行剪切，具有三种酶切位点：支架位点(Scaffold site)即成熟位点(Mature site，M位点)、释放位点(Release site，R位点)、自剪切位点(Internal site，I位点)。HCMV蛋白酶对M、R、I这三个酶切位点的催化活性不同。HCMV蛋白酶对M位点的催化活性最强，对自剪切位点I位点的催化活性最弱。抑制HCMV蛋白酶活性之后，能抑制病毒衣壳的成熟，使病毒支架不能相应的解体进而不能为DNA进入壳体提供空间，从而达到抑制病毒复制的作用。因此，HCMV蛋白酶是抗HCMV病毒的理想靶点。我们通过荧光共振能量转移的方法对HCMV蛋白酶抑制剂进行筛选。
目前，对通佐溴铵抗HCMV病毒感染中的应用未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供通佐溴铵在抗HCMV病毒感染中的应用。
所述通佐溴铵为以下化合物：
本发明针对人巨细胞疱疹病毒蛋白酶的抑制剂，抑制剂为通佐溴胺。
本发明所涉及通佐溴铵CAS号为553-08-2，购买于TOP SCIENCE公司。通过对通佐溴铵进行的针对HCMV蛋白酶的抑制活性测定，设立阴性对照，发现该类化合物对HCMV蛋白酶有很好的抑制活性，在通佐溴铵终浓度为40μM时其对HCMV蛋白酶的抑制活性达到85％，表明这类化合物能够有效的抑制HCMV蛋白酶的活性。因此，这类化合物有望成为抑制HCMV病毒的潜在药物。
本发明提供一种用于一种预防或治疗含有人巨细胞病毒蛋白酶感染的药物，其活性成分为通佐溴铵，该药物包含上述含有通佐溴铵以及一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂、增效剂。该药物可制成注射剂、片剂、丸剂、胶囊、悬浮剂或乳剂的形式使用。其给药途径可为口服、经皮、静脉或肌肉注射。
本发明具有的优点和积极效果是：HCMV蛋白酶是抗人巨细胞病毒药物靶点，本化合物为HCMV蛋白酶的非拟肽类抑制剂，有成为新型的具有抗耐药性药物的潜能。
附图说明
图1是通佐溴铵对HCMV蛋白酶的抑制曲线。
具体实施方式
下面将详细描述本发明的具体实施方式，这仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述试验中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从普通商业途径得到。
HCMV蛋白酶由本组表达纯化，荧光底物MCA-RRVVNASSRLNK-DNP(大于95％)，购自上海吉尔生化有限公司。酶抑制剂活性测定用到的化学试剂及生化试剂二甲基亚砜(DMSO)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
测试酶活性采用的荧光酶标仪(Spectra max GEMINI xps)，产自Molecular Devices公司。
(1)HCMV protease基因由苏州泓迅生物科技有限公司全合成，全合成所在载体为pUC57-Amp；
(2)通过PCR将目的基因HCMV protease的第143位丙氨酸(A)突变为谷氨酰胺(Q)命名为HCMV-A143Q，并将HCMV-A143Q片段用BamH I与Xho I酶切，用琼脂糖凝胶回收大小为约为780bp的目的基因片段；
(3)将目标载体pGEX-6P-1用BamH I与Xho I酶切，然后用琼脂糖凝胶回收酶切片段；
(4)将(2)和(3)获得的片段连接(将酶切回收后的基因片段和目标载体片段按照摩尔比5：1～10：1的比率混合在16℃下连接10-18h)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB平板(含有100mg/ml氨苄青霉素)培养过夜，将筛选得到的阳性克隆进行双酶切鉴定，鉴定正确的载体送于金唯智生物科技有限公司进行测序，测序结果表明，HCMV-A143Q基因已被正确的克隆到pGEX-6P-1载体中；
(5)将含有编码HCMV病毒蛋白酶基因的pGEX-6P-1载体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并用LB平板(含有100mg/ml氨苄青霉素)筛选阳性克隆；
(6)在(5)所述的LB平板上挑取阳性克隆，培养过夜，然后转入0.8L的LB培养基(含100mg/ml氨苄青霉素)，当OD值达到0.6-0.8时加入1mM IPTG，在16℃培养16-18h；
(7)4200rpm离心20min收集细胞，高压破菌5～6次；破菌液6000rpm离心1.5h后收集上清液；
(8)将上清液加入GST亲和层析柱中，层析柱经过含500mM NaCl 50mM Tris-HCl pH8.2 10％甘油的悬菌缓冲溶液预平衡，2h后用悬菌缓冲溶液冲结合目的蛋白的GST亲和介质至G250不变蓝，最后加入400ul浓度为2mg/ml的人类鼻病毒3C蛋白酶，4℃过夜酶切后用悬菌缓冲液将目的蛋白洗下；
(9)将上一步骤得到的HCMV-A143Q蛋白酶再用HiTrap Q阴离子交换层析和superdex75 10/300凝胶过滤层析进行纯化，得到纯度较高的HCMV-A143Q蛋白酶；
(10)HCMV-A143Q蛋白酶的活性测定是使用荧光底物MCA-RRVVNASSRLNK(DNP)(纯度大于95％，上海吉尔生化有限公司)来完成的；
(11)用于荧光强度测定的仪器为Fluoraskan Ascent荧光仪(Thermo)，激发光和发射光的波长分别为320nm和405nm；
(12)用于酶反应的缓冲体系是50mM Tris-HCl(pH8.2)30％甘油125uM EDTA，用缓冲液配置HCMV-A143Q蛋白酶(终浓度0.8193uM)，加入备选样品溶解物(终浓度为50uM)，震荡10s，25℃孵育3min，迅速加入荧光底物，底物终浓度为48.89uM，1200rpm震荡10s，每4s记录一次荧光度数，共测定200个点；
(13)通过酶标仪记录的酶反应相关数据，根据荧光强度以及反应时间，采用GraphPad Prism 6软件分析前35s的酶促反应速率，设定V0为不加抑制剂的酶促反应初速度，Vi为加抑制剂的酶促反应初速度，根据酶促反应速率，计算出每个化合物的剩余活性Ra(Residual Activity，Ra)(Vi/V0)以及抑制率Ir(Inhibition Rate，Ir)(1-Vi/V0)；
(14)对于剩余活性<20％的化合物进行复筛，排除假阳性的可能，对于剩余活性低于15％的化合物设计荧光淬灭实验，综合考虑化合物的剩余活性百分率和荧光淬灭率可以判断化合物对HCMV-A143Q蛋白酶的抑制作用；
(15)为了排除假阳性结果，设计荧光淬灭实验，将HCMV-A143Q蛋白酶与荧光底物反应一段时间，让体系荧光达到最大值Q1，再在体系中加入与实验组等量的化合物，并检测体系的荧光值为Q2，将两者的荧光值按照公式计算得出荧光淬灭率Qr(Qr＝(Q1-Q2)/Q2*100％)，当荧光淬灭率高于20％为假阳性结果需排除，当荧光淬灭率低于20％时为阳性结果可进行下一步的研究。
本发明属于药学领域，具体涉及一种通佐溴铵在抗人巨细胞病毒感染中的应用。本发明涉及的通佐溴铵在终浓度为40μM对人巨细胞病毒蛋白酶抑制活性达到85％，在制备人巨细胞病毒蛋白酶的小分子抑制剂方面有很大应用潜力。