青藤碱在制备用于治疗人脑胶质瘤的药物中的应用的制作方法

本发明是关于一种青藤碱在医药领域的新用途，更具体地说，是关于一种盐酸青藤碱在制备用于治疗人脑胶质瘤的药物中的用途。

背景技术：

颅内肿瘤中以胶质瘤最常见，胶质瘤约占所有颅内肿瘤的45％～50％，此类肿瘤以恶性者多见，而且由于肿瘤的侵润性生长，利用传统的手术治疗难以彻底切除，是目前严重威胁人类健康的一大疾病。近年来恶性肿瘤的治疗有了明显的进步，抗肿瘤药物研究经过40余年的努力已发展到一个新的阶段，其研究领域已远远超过传统的以核酸及其组成成分为靶点的细胞毒类药物。为寻找有新的作用机理及独特化学结构的细胞毒类药物，人们一直在做着努力，最近人们认为治疗恶性肿瘤的药物应该是通过刺激肿瘤细胞凋亡来使其死亡，而细胞毒性自噬途径同样引起了人们的关注。

青藤碱是植物药青风藤中所提纯的生物碱，具有抗炎、镇痛及免疫调控的作用，其片剂和针剂已经成为国家正式批准使用的药物。现已经用于风湿性关节炎的治疗，并取得了满意效果。近年来，随着对青藤碱研究的深入，发现了一些新的药理作用及作用机制，尤其是抗肿瘤方面的作用越来越受到国内外学者的重视。

关于青藤碱在抗胶质瘤方面的作用目前仅见对鼠源性胶质瘤C6细胞株抑制作用的报道，例如CN101002773A以鼠源性胶质瘤C6细胞株为靶细胞，发现经碱溶并重结晶后得到的盐酸青藤碱单晶对于鼠源性胶质瘤C6细胞株具有抑制作用，抑制率随剂量的增加而提高。然而，C6细胞是经硝基甲脲诱发Wistar种系大鼠获得的脑胶质瘤细胞，与人脑胶质瘤存在种属差异。关于药物的抗肿瘤机制比较复杂，通常与肿瘤细胞的种类有关，甚至在不同的肿瘤细胞中的作用机制也有很大的不同，对不同肿瘤细胞的影响作用不同。例如，Curicumin能够抑制C6胶质瘤细胞增殖，但却不能明显抑制缺乏野生型PTEN基因的U87MG胶质瘤细胞的分裂增殖。

目前，并未见关于青藤碱在抗人脑胶质瘤方面的报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的在于提供一种青藤碱在医药领域的新应用，特别是盐酸青藤碱在制备用于治疗人脑胶质瘤的药物中的应用。

本发明中所述的青藤碱包括其盐的形式，例如盐酸青藤碱。

本案发明人在研究中意外地发现，市售普通的青藤碱(无需经碱溶并重结晶处理)对人源性胶质瘤U87MG和SF767细胞株具有抑制作用，并随剂量和时间的递增而提高。并且，本发明的青藤碱能够诱导自噬体的增加，能够增加自噬囊泡的数量，促进人胶质瘤细胞LC3B-Ⅱ的表达增加，能够诱导人胶质瘤细胞自噬性死亡，能够抑制U87MG细胞异种移植瘤生长。

从而，本发明提供了青藤碱的新应用。

具体而言，本发明提供了青藤碱在制备用于治疗人脑胶质瘤的药物中的应用。

本发明还提供了所述的青藤碱在制备对人源性胶质瘤U87MG和SF767细胞株具有抑制作用的抑制剂中的应用。根据本发明的具体实施方案，所述抑制作用随青藤碱剂量和作用时间的增加而提高。

本发明还提供了所述的青藤碱在制备诱导自噬体的增加的制剂中的应用。

本发明还提供了所述的青藤碱在制备增加自噬囊泡的数量的制剂中的应用。

本发明还提供了所述的青藤碱在制备促进人胶质瘤细胞LC3B-Ⅱ的表达的制剂中的应用。

本发明还提供了所述的青藤碱在制备诱导人胶质瘤细胞自噬性死亡的制剂中的应用。

本发明还提供了所述的青藤碱在制备抑制U87MG细胞异种移植瘤生长的制剂中的应用。

综上所述，本发明所述的青藤碱是一种很有潜力的新型、有效的抗胶质瘤新药，可用于制备治疗人脑部肿瘤药物，为人脑部肿瘤的内科治疗开辟一条新途径，也拓宽了青藤碱的医药应用。

附图说明

图1A显示本发明的盐酸青藤碱对人源性胶质瘤U87MG细胞株的抑制作用。

图1B显示本发明的盐酸青藤碱对人源性胶质瘤SF767细胞株的抑制作用。

图2显示本发明的盐酸青藤碱诱导自噬体的实验中的透射电镜观察结果。

图3显示本发明的盐酸青藤碱对自噬囊泡影响实验中的MDC染色观察结果。

图4显示本发明的盐酸青藤碱影响人胶质瘤细胞LC3B-Ⅱ表达水平的实验结果。

图5A显示本发明的盐酸青藤碱诱导人源性胶质瘤U87MG细胞株的自噬性死亡实验结果。

图5B显示本发明的盐酸青藤碱诱导人源性胶质瘤SF767细胞株的自噬性死亡实验结果。

图6A～图6D显示本发明的盐酸青藤碱对U87MG细胞异种移植瘤裸鼠体重及肿瘤组织重量及体积的影响。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施过程和产生的有益效果，旨在帮助阅读者更好地理解本发明的实质和特点，不作为对本案可实施范围的限定。各实施例中未详细注明的实验方法，按照所属领域的常规操作进行。各实施例中所用的本发明的盐酸青藤碱为市售普通产品，商购品即直接用于本发明，未经碱溶、重结晶等处理。

实施例1、以人源性胶质瘤U87MG和SF767细胞株为靶细胞进行盐酸青藤碱对于人胶质瘤细胞株的抑制作用的实验

实验方法为：将由中国医学科学院细胞资源中心提供的人源胶质瘤细胞株U87MG和SF767用胰酶消化后，悬浮于含10％胎牛血清的培养液中，利用玻璃滴管轻轻吹打成细胞悬液，显微镜下用细胞计数板计数活细胞。将肿瘤细胞接种于无菌的96孔培养板，每孔加肿瘤细胞悬液100μl。将细胞置于37℃、体积百分比为5％的CO₂培养箱中24小时后，弃去上清液，然后加入不同浓度的盐酸青藤碱溶液。在37℃、体积百分比5％的CO₂培养箱中分别孵育24小时、48小时、72小时，转移上清液，在每孔中加入10微升CCK8，同等条件孵育1小时，在酶标仪上以波长为450nm，测定各孔吸光度，计算细胞生存率。

实验结果参见图1A与图1B。结果表明，不同浓度的本发明的盐酸青藤碱对人源性胶质瘤U87MG和SF767细胞株具有不同程度的抑制。

实施例2、盐酸青藤碱能够诱导自噬体的增加

实验方法：细胞经处理后，2000转/分，离心10min，去除上层培养基，并用冷的PBS洗涤3次，离心后保留下层细胞，轻轻的加入2.5％的戊二醛固定液，固定24小时，2％锇酸固定2小时，梯度脱水：50％、70％、90％、100％的丙酮酸脱水，每级10分钟，60℃包埋24小时，使细胞成块，切片，透射电镜观察。

观察结果请参见图2所示，与其中的图片A对照组比较，经0.5mM盐酸青藤碱处理后人胶质瘤U87MG和SF767细胞胞浆内均观察到多个双层膜性结构，即自噬体，其中图片C为图片B的局部放大。结果表明，盐酸青藤碱能够诱导自噬体的增加。

实施例3、盐酸青藤碱能够增加自噬囊泡的数量

实验方法：单丹磺酰戊二胺(MDC)染色，其能够选择性地聚集于自噬体，溶酶体和自噬溶酶体等酸性囊泡中，当MDC在激发光下，呈蓝绿色或黄绿色颗粒状结构，可用荧光显微镜进行观察，是检测自噬的一种常用方法。将细胞接种于共聚焦单孔培养皿内，5×10⁴个细胞/孔，3复孔，加入100μmol/LMDC工作液，重新置于37度温箱内孵育30min，PBS洗细胞两遍，加入4％多聚甲醛1ml固定15min，PBS清洗细胞2次，上机检测。

实验结果请参见图3所示。结果显示，对照组细胞中少见酸性囊泡，而0.5mM盐酸青藤碱处理后的细胞中酸性囊泡数量显著提高，与自噬抑制剂3MA共同作用后则明显减少。表明，盐酸青藤碱能够增加人胶质瘤U87MG和SF767细胞中酸性囊泡的数量，且其作用可被自噬抑制剂部分阻断。

实施例4、盐酸青藤碱能够促进人胶质瘤细胞LC3B-Ⅱ的表达增高

实验方法：LC3B是自噬研究领域公认的自噬特异性标志物，以胞浆形式存在的LC3B-I在自噬激活过程中，逐渐转变为自噬体形式的LC3B-II，后者的表达与细胞中自噬体的数量呈正相关。利用Western blot检测0.0625，0.125，0.25和0.5mM盐酸青藤碱作用U87及SF767细胞24h后，其自噬相关的特异性标志物LC3B的表达变化。

结果如图4所示，在U87和SF767细胞中，与对照组比较，LC3B-Ⅱ的表达量随着盐酸青藤碱作用浓度的提高而显著增加。表明，盐酸青藤碱能够诱导人胶质瘤细胞自噬的发生。

实施例5、盐酸青藤碱能够诱导人胶质瘤细胞自噬性死亡

实验方法：3MA为目前通用的自噬抑制剂，将细胞株U87和SF767用胰酶消化后，悬浮于含10％胎牛血清的培养液中，利用玻璃滴管轻轻吹打成细胞悬液，显微镜下用细胞计数板计数活细胞。将肿瘤细胞接种于无菌的96孔培养板，每孔加肿瘤细胞悬液100ul。将细胞置于37度、体积百分比为5％的CO₂培养箱中24小时后，弃去上清液，然后加入0.5mM盐酸青藤碱溶液及同等浓度含5mM 3MA的盐酸青藤碱溶液。在37度、体积百分比5％的CO₂培养箱中孵育48小时，转移上清液，在每孔中加入10微升CCK8，同等条件孵育1小时，在酶标仪上以波长为450nm，测定各孔吸光度。

实验结果请参见图5A和图5B所示。结果显示，盐酸青藤碱能够降低人胶质瘤U87和SF767细胞的存活率，与自噬抑制剂3MA共同作用后，其细胞存活率显著提高。表明，盐酸青藤碱能够诱导人胶质瘤细胞自噬性死亡。

实施例6、盐酸青藤碱对U87MG细胞异种移植瘤裸鼠的影响

实验方法：取生长状态好的U87MG细胞，制成细胞悬液。于BALB/c裸鼠颈肩背部皮下接种，细胞量为2×10⁶/只。随机分为三组：对照组，75mg/kg盐酸青藤碱组，150mg/kg盐酸青藤碱组(n＝7)。接种后次日，腹腔注射连续给药14天，使用游标卡尺每两日测量肿瘤直径L(mm)和宽径W(mm)，按照下列公式计算肿瘤体积，V＝(L×W²)/2，同时每日称量荷瘤裸鼠体重(g)。并于最后一日，处死荷瘤裸鼠，小心取出肿瘤组织，使用电子天平称量记录肿瘤重量(g)。

实验结果请参见图6A至图6D所示。图6A为取材后的瘤组织，图6B为盐酸青藤碱对裸鼠瘤重的影响，图6C为盐酸青藤碱对裸鼠瘤体积的影响，图6D为盐酸青藤碱对裸鼠体重的影响。结果表明，盐酸青藤碱能够明显抑制U87MG细胞异种移植瘤生长，降低瘤体积及瘤重，且对裸鼠体重无影响。

上述结果表明，盐酸青藤碱对人胶质瘤细胞株U87和SF767具有抑制效果，并随剂量的递增而提高，其作用机制与诱导细胞自噬性死亡有关。此结果表明，盐酸青藤碱是一种很有潜力的新型、有效的抗人胶质瘤新药，可用于制备治疗脑部肿瘤药物，为脑部肿瘤的内科治疗开辟一条新途径，也拓宽了盐酸青藤碱的医药应用。