专利名称：一种白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球、应用及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗胶质瘤的药物，特别是一种抗胶质瘤的双药纳米载药微球及其制备方法。
背景技术：
替莫唑胺于1991年8月通过FDA批准用于治疗成人顽固性多形性成胶质细胞瘤， 是治疗恶性神经胶质瘤的一线药物。其主要剂型为口服胶囊制剂，口服后血浆药物浓度于 Ih内达峰，能不经肝脏代谢广泛分布于全身，并可透过血脑屏障，进入脑脊液中枢神经系统达到有效的药物浓度。但是由于其口服消除迅速，在脑内难以维持有效的药物浓度。同时由于其口服剂量较大，容易产生一定的副作用。如其重度的恶心呕吐(CTC 3级或4级)的发病率为10或6，而且具有一定的剂量依赖性的骨髓抑制毒性，对临床应用产生了明显的限制。
此外，自替莫唑胺应用于临床治疗脑胶质瘤以来，众多的研究结果显示其临床有效率不足45%，还有一部分患者应用替莫唑胺后近期疗效较好，但长期应用的疗效不佳，这严重影响了它在临床中的广泛应用。究其原因，是因为肿瘤细胞对替莫唑胺具有原发或继发性耐药作用。因此寻找能够有效逆转替莫唑胺耐药性以及增强替莫唑胺疗效的方法势在必行。
白藜芦醇作为一种中药单体，已经被发现作为天然的肿瘤化学预防剂对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用。目前已经有许多研究报道了白藜芦醇在体内及体外实验中有效的抑制肝癌、乳腺癌、胃癌等肿瘤的生长。但其由于极差的水溶性使其在应用和开发上收到了极大的限制。
因此，有相关人员采用纳米负载的方法来制备替莫唑胺或者白藜芦醇的单药载药微球。如中国专利号ZL200610161053. 3公布了一种替莫唑胺聚乳酸纳米微球的制备方法。 但由聚乳酸等形成的纳米微球稳定性不够理想，体外环境以及体内环境中容易降解。而且该法制备出的粒径分布范围较广，在IOnm-1O μ m之间，均一性较差，静脉应用容易后容易形成栓塞，将限制其在临床上的进一步应用。中国专利申请号200710306513. 5，中国专利号 CN 101579291· B，中国专利申请号201110030051. 5，中国专利申请号201110029485. 3均公布了白藜芦醇的单药纳米载药微球的制备方法。但是以上专利均为单药替莫唑胺或者白藜芦醇的纳米载药微球的制备方法，所得到的单药纳米微球仍然不能避免单药治疗所存在的问题。
如何克服现有技术的不足已成为当今抗肿瘤药物技术领域中亟待解决的重大难题。发明内容
本发明的目的是，为克服现有技术的不足，提供双药纳米载药微球及其制备方法，以及在抗胶质瘤的应用，本发明制得的抗胶质瘤的双药纳米载药微球不仅具有显著的抗肿瘤效果，而且其毒性反应显著降低；本发明的制备方法简便可靠，能够保证产品的质量和应用的效果。
本发明的技术方案包括白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球、应用及其制备方法，本发明白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料混合组成，其中，载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA);白藜芦醇(RES)和载药材料二种原料组分溶于水溶性无毒性溶剂有机溶剂中，替莫唑胺溶解于纯水并经搅拌后；去掉溶剂并用220±30nm的微孔滤膜过滤所得到的(一般为)淡蓝色分散液即为粒径为80-120nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；并经加热干燥或冻干。
进一步的，由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球与外加的冻干保护剂混合组成，其中，冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
进一步的，按重量配比的组份为由3-18份替莫唑胺(TEM)、3-18份白藜芦醇 (RES)和64-94份载药材料混合组成。
进一步的，按重量配比的组份为替莫唑胺(TEM) 5-15份、白藜芦醇(RES) 5-15份和载体材料70-90份混合组成。
进一步的，由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球与外加的冻干保护剂混合组成，其中，冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
进一步的，按重量配比的组份为由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球混合药20-30份和外加的冻干保护剂70-80份混合组成。
所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球或外加的冻干保护剂的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球在抗胶质瘤的应用。
本发明的另一种技术方案是在前述技术方案或者优选方案的基础上，由替莫唑胺 (TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球与外加的冻干保护剂混合组成，其中，冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluixmic F-68)。本发明另一种技术方案的优选方案，其特征是按重量配比的组份为由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球混合药20-30份和外加的冻干保护剂70-80份混合组成。
所述的一种抗肿瘤的双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取3-18份替莫唑胺(TEM)、3_18份的白藜芦醇(RES)和64-94份的载药材料；载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇 (mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的白藜芦醇(RES)和载药材料(二亲嵌段共聚物)二种原料组分溶于一定量的丙酮或乙醇(也包括异丙醇、丁醇等水溶性无毒性溶剂)有机溶剂中，其中，按组分的重量配比，原料药及载体50-80份、有机溶剂20-50份； 将步骤一中称取的替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺20-50份，蒸馏水50-80份；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的有机溶剂在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中；再将所得到的有机溶剂与水的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中；其中有机溶剂与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶剂与水的混合溶液蒸馏水=1:5-8 ；
步骤四，纯化将步骤三得到的有机溶剂稀释液，通过旋转蒸发法除去有机溶剂， 或者用透析法(透析袋Cutoff分子量在20kd以下)除去有机溶剂；
步骤五，过滤将步骤四得到的除去有机溶剂的稀释液，用220±30nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径为80-120nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥或冻干将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于 40+-5°C的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品；或者在步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，冷冻干燥后即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品，其中，按组分的重量配比，该溶液冻干成品中的双药纳米载药微球混合药20-30、冻干保护剂70-80。
有机溶剂(水溶性溶剂)包括丙酮或乙醇、异丙醇、丁醇、乙二醇、二甘醇、丙二醇、 丙三醇(甘油)，甚至还包括甲醇。本发明中实施例中采用了丙酮或乙醇。但上述水溶性溶剂均可以使用，由于药物的成品是去掉有机溶剂的，不至产生药物毒性。
白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球在抗胶质瘤的应用按现有替莫唑胺的药量进行使用。如典型的应用为替莫唑胺胶囊(泰道)在临床上化疗的常用剂量为 175-200mg/m2/日，每日一次，共五天，休息23天(即每个周期为28天，服药时间为5天)。
根据体表面积与体重换算可得出人的给药剂量即为4. 73-5. 41mg/kg,再根据动物与人之间的换算公式可得出小鼠与人的等效剂量为55. 2-63. lmg/kg。在本实验中我们选取了远小于临床等效剂量的剂量进行试验，双药微球中替莫唑胺的剂量为20mg/kg，白藜芦醇的剂量为30mg/kg。由图7中可见，白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米微球的冻干粉剂复溶后经静脉给药对U87裸鼠皮下移植瘤产生了优于裸药替莫唑胺以及替莫唑胺与白藜芦醇裸药联合的抑瘤效果。
本发明的作用原理是第一，本发明选择白藜芦醇(RES)作为替莫唑胺(TEM)的协同药，不仅白藜芦醇本身具有抗胶质瘤细胞增生和诱导凋亡的抑瘤增效作用，而且还能够明显协同增强替莫唑胺(TEM)的抗胶质瘤疗效。第二，利用具有可生物降解特性的医用聚己内酯与聚乙二醇等合成的二亲嵌段共聚物作为负载替莫唑胺与白藜芦醇的双药载药材料，聚己内脂作为疏水端、聚乙二醇作为亲水端，两者在水相中能够自动合成二嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)的纳米载药微球，将替莫唑胺与白藜芦醇同时投入该纳米载药微球，即可避免其双药的各自聚集并凸显其双药纳米载药微球的稳定性。第三，聚己内脂的疏水性能够使具有一定脂溶性的替莫唑胺与白藜芦醇更容易被载入纳米载药微球，而聚乙二醇的亲水性则使纳米载药微球在患者体内循环的时间大大延长，更容易穿透血脑屏障从而达到对脑肿瘤部位发挥药效，同时该双药纳米载药微球具有单药或单药纳米载药微球所不能比拟的低毒副作用，为在患者使用中增加药物的使用剂量而又不引起过高的毒性反应提供了保证。第四，该双药纳米载药微球能够通过肿瘤细胞的包吞作用被摄入细胞内， 这种进入方式效率远大于小分子裸药逐渐渗入方式的效率，从而使替莫唑胺与白藜芦醇能够迅速在细胞内达到较高的药物浓度，产生更好的协同抗胶质瘤效果。
本发明有益效果是与现有技术相比其显著优点是第一，本发明通过纳米载药体系共同投递替莫唑胺与白藜芦醇，充分发挥白藜芦醇具有增强替莫唑胺抗胶质瘤的协同作用，从而提高双药协同抗肿瘤的药效。第二，本发明的双药纳米载药微球的粒径在IOOnm 左右，可用于静脉给药，能够在体内长时间的循环，从而达到更加优越的抗肿瘤药效，副作用明显减小。第三，本发明的双药纳米载药微球的制备方法简便易行，可以显著提高其双药纳米载药微球的稳定性，易实现工业化生产。
图1是本发明提出的一种抗胶质瘤的双药纳米载药微球成品制备方法的流程示意图。
图2是本发明提出的一种抗胶质瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品制备方法的流程示意图。
图3是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇双药纳米载药微球在冻干前的透射电子显微镜影像照片。
图4是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇双药纳米载药微球在室温条件下的体外释放曲线。
图5是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇两药联合对大鼠胶质瘤C6的体外协同抑瘤效果评价。
图6是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇双药纳米载药微球对大鼠胶质瘤C6的体外协同抑瘤效果评价。
图7是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇双药纳米载药微球对人胶质瘤U87的体内协同抑瘤效果评价。
图8是本发明的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球(冻干粉剂)在裸小鼠人胶质瘤U87细胞的体内协同抑瘤效果评价。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。结合附图1和图2，制备本发明提出的一种抗胶质瘤的双药纳米载药微球成品或者一种抗胶质瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品，所采用的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇 (RES)和载药材料以及溶剂、冻干保护剂等全部原料均为市售医药原料，符合中华人民共和国药典标准。其中载药材料为聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇 (mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)合成的二亲嵌段共聚物，不论采用所述的何种载药材料都能够达到本发明所述的载药效果。本发明的原料规格如下
1、替莫唑胺(TEM):分子式C6H6N602 ;分子量194. 15 ;纯度HPLC>99。2、白藜芦醇 (RES):分子式C14H1203 ;分子量228. 24 ;纯度HPLC>99。3、载药材料
①聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物为聚己内脂-聚乙二醇 (mPEG-PCL);经过核磁(NMR)和凝胶滤过色谱(GPC)验证。
②聚乳酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物为聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA);经过核磁(NMR)和凝胶滤过色谱(GPC)验证。
③聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物为聚羟基乙酸-聚乙二醇 (mPEG-PLGA);经过核磁(NMR)和凝胶滤过色谱(GPC)验证。
4、溶剂①丙酮为色谱纯乙醇为色谱纯；③蒸馏水为色谱纯。
5、冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)，又名Lutrol F68 (泊洛沙姆188)， 分子式(C3H60C2H40)X ;分子量:8350 ;级别医用级。
结合附图1，以制备IOOOg抗胶质瘤的双药纳米载药微球成品为例，本发明的具体实施方式
如下。
实施例1:
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取30g替莫唑胺(TEM)、30g汉白藜芦醇(RES)以及940g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PCL分子量20000 (分子量主要分布于此区间)；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的30g白藜芦醇(RES)和940g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分80、丙酮溶剂20); 将步骤一中称取的30g替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，(其中按组份的重量配比，替莫唑胺20，蒸馏水80)；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的丙酮在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再将所得到的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中。其中丙酮与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，丙酮与水的混合溶液蒸馏水=1:5。即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化将步骤三得到的双药微球丙酮及水的混合溶液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤将步骤四得到的除去丙酮溶剂的溶液，用220nm的微孔滤膜(常用的规格)过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径96. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
有机溶剂还可以采用乙醇、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇，均可以除去， 对药物无显著影响。
实施例2
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取IOOg替莫唑胺(TEM)UOOg汉白藜芦醇(RES)以及800g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLA分子量40000 ；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的IOOg白藜芦醇(RES)和800g载药材料等原料组分溶于一定量的乙醇溶剂中(按组分的重量配比，原料组分60、丙酮溶剂 40);将步骤一中称取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺40，蒸馏水60 ；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的乙醇在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再将所得到的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中。其中乙醇与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，乙醇与水的混合溶液蒸馏水=1:6。即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化将步骤三得到的双药微球丙酮及水的混合溶液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤将步骤四得到的除去丙酮溶剂的溶液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径108. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
有机溶剂还可以采用丙酮、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇，均可以除去， 对药物无显著影响。
实施例3
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取150g替莫唑胺(TEM)、150g汉白藜芦醇(RES)以及700g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLGA分子量36000 ；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的150g白藜芦醇(RES)和700g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分50、丙酮溶剂 50);将步骤一中称取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺50，蒸馏水50 ；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的有机溶剂在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的 水溶液中。再将所得到的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中。其中有机溶剂与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶剂与水的混合溶液蒸馏水=1:6。即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化将步骤三得到的双药微球丙酮及水的混合溶液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤将步骤四得到的除去丙酮溶剂的溶液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径100. 5nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，干燥将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40°C的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品。
以上述条件(溶剂略加减少)采用75g替莫唑胺(TEM)、150g白藜芦醇(RES);和 150g替莫唑胺(TEM)、75g白藜芦醇(RES)能够得到抗肿瘤的双药纳米载药微球成品(成品中替莫唑胺(TEM)与白藜芦醇的重量比不同)。总之，载体投入量按比例调整即可。
结合附图2，以制备7000g抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品为例，本发明的具体实施例如下。
实施例4
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取30g替莫唑胺(TEM)、30g汉白藜芦醇(RES)以及940g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PCL分子量20000 ；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的30g白藜芦醇(RES)和940g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分80、丙酮溶剂20); 将步骤一中称取的30g替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺20，蒸馏水80 ；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的有机溶剂在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再将所得到的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中。其中有机溶剂与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶剂与水的混合溶液蒸馏水=1:5。即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化将步骤三得到的双药微球丙酮及水的混合溶液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；步骤五，过滤将步骤四得到的除去丙酮溶剂的溶液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径96. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干将步骤五得到的纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚 (Pluronic F-68) 5000g，冷冻干燥后即制得含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液冻干成品。
实施例5
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取IOOg替莫唑胺(TEM)UOOg汉白藜芦醇(RES)以及800g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLA分子量40000 ；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的IOOg白藜芦醇(RES)和800g载药材料等原料组分溶于一定量的丙二醇溶剂中(按组分的重量配比，原料组分60、丙酮溶剂 40);将步骤一中称取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺40，蒸馏水60 ；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的丙二醇在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再将所得到的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中。 其中丙二醇与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，丙二醇与水的混合溶液蒸馏水=1:6。 即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化将步骤三得到的双药微球丙二醇及水的混合溶液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙二醇溶剂全部除去；
步骤五，过滤将步骤四得到的除去丙二醇溶剂的溶液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径108. 3nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干将步骤五得到的纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚 (Pluronic F-68) 6000g，冷冻干燥后即制得含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液冻干成品。
实施例6
步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取150g替莫唑胺(TEM)、150g汉白藜芦醇(RES)以及700g载药材料，其中，载药材料为聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)，其中mPEG分子4000、PLGA分子量36000 ；
步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的150g白藜芦醇(RES)和700g载药材料等原料组分溶于一定量的丙酮溶剂中(按组分的重量配比，原料组分50、丙酮溶剂 50);将步骤一中称取的IOOg替莫唑胺(TEM)溶于一定量的45-50摄氏度的蒸馏水中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺50，蒸馏水50 ；
步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的丙酮(有机溶剂还可以采用乙醇、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇均可以除去，对药物无显著影响)在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再将所得到的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中。其中丙酮与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，丙酮与水的混合溶液蒸馏水 =1:6。即得到淡蓝色的双药微球丙酮及水的混合溶液；
步骤四，纯化将步骤三得到的双药微球丙酮及水的混合溶液装入透析袋中(透析袋cut-off值为12000)，采用透析法将该溶液中的丙酮溶剂全部除去；
步骤五，过滤将步骤四得到的除去丙酮溶剂的溶液，用220nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径100. 5nm的含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液；
步骤六，冻干将步骤五得到的纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚 (Pluronic F-68) 6000g，冷冻干燥后即制得含替莫唑胺(TEM)和白藜芦醇(RES)双药的纳米载药微球溶液冻干成品。
有机溶剂还可以采用乙醇、丙二醇、丙三醇(甘油)、聚乙二醇或甲醇均可以除去， 对药物无显著影响。表1、不同浓度的白藜芦醇联用下替莫唑胺对C6胶质瘤的IC50值(一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%，该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度)
表1.不同浓度的白藜芦醇联用下替莫唑胺对C6胶质瘤的IC50值RESTEMTEMTEM+2pg/mL RES+4pg/mL RESIC50s(pg/mL8 33113.3670.5211.83
本发明经反复实验验证，取得了满意的应用效果。现以替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇 (RES)和聚己内酯与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)混合制得的双药纳米载药微球为例，其应用效果图示如下
图3是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇双药纳米载药微球成品的透射电子显微镜影像照片。图3中可见双药纳米载药微球为较为规则的圆形，表面光滑，其粒径较为均匀， 均在IOOnm左右。
图4是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇双药纳米载药微球在室温条件下的体外释放曲线。图4中可见替莫唑胺与白藜芦醇分别表现为缓慢释放的特征，这样使得该双药纳米载药微球在患者体内发挥疗效时可以通过最初的突释来达到一个较高的血药浓度，而随后的长时释放则为保持一定的有效浓度提供了保证，从而达到了长效缓释的抗肿瘤效果。
图5及表I是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇裸药联合对鼠胶质瘤C6细胞的体外协同抗肿瘤效果评价，采用MTT方法测定。采用IC50法测定协同效果，如表I及图5所示，与细胞作用36小时后，测定单药替莫唑胺对C6的IC50值为113. 36 μ g/mL，而单药白藜芦醇对C6的IC50值为8. 33 μ g/mL。在固定白藜芦醇的浓度分别为2 μ g/mL (该浓度对细胞增殖不产生明显的抑制效果)或4 μ g/mL (该浓度对细胞增殖不产生明显的抑制效果)的情况下，其与替莫唑胺联用后测定替莫唑胺对C6的IC50值分别为70. 51 μ g/mL和11. 83 μ g/ mL。由图5中可以看出在两种不同浓度的白藜芦醇(2μ g/mL或4μ g/mL)与替莫唑胺联用后所测得的IC50值均在两个单药IC50连线内，代表Cl (协同指数Xl (表示两种药物联用具有协同效果)，也即两种单药具有协同抗胶质瘤效果。
图6以及图7是本发明的替莫唑胺与白藜芦醇裸药及双药纳米载药微球对鼠胶质瘤C6细胞(图6)以及人胶质瘤U87细胞(图7)的体外抗肿瘤效果评价。采用MTT方法测定。实验分三组，分别为替莫唑胺裸药(TEM)，替莫唑胺及白藜芦醇裸药联合(TEM+RES)，以及替莫唑胺及白藜芦醇双药纳米载药微球(TEM/RES NPs)。其中，TEM+RES裸药联合以及 TEM/RES NPs双药纳米微球中RES的浓度均设为2 μ g/mL来观察RES对于TEM的细胞抑制作用的影响(在预试验中该浓度对胶质瘤细胞无明显抑制作用)。图5中可见当小剂量的白藜芦醇联合替莫唑胺时，细胞抑制率较之替莫唑胺裸药有了一个明显的升高，而替莫唑胺及白藜芦醇双药纳米载药微球显示了比替莫唑胺及白藜芦醇裸药联合更强的细胞杀伤作用。
图8是本发明的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球(冻干粉剂)在裸小鼠人胶质瘤U87细胞的体内协同抑瘤效果评价。将体外培养人源性胶质瘤U87细胞，使细胞一直处于对数生长期。取制备好的细胞接种于裸小鼠一侧腋下。细胞种植后7 — 8天，选择肿瘤体积100 mm3左右的小鼠为实验模型。将符合条件的小鼠随机分为4组，每组8只。各组药物如图7所示，其中，TEM剂量为20mg/kg，RES剂量为30mg/kg。TEM/TES NPs中的TEM 与RES剂量等同于裸药。各组均静脉给药，隔天测一次肿瘤长径a和垂直于a的最大横径 b,计算瘤体积并且绘制肿瘤体积生长曲线。瘤体积=l/2*a*b2。每日观察各组动物的饮食、 活动、皮色等方面的变化，每2天测量一次小鼠体重，观察体重变化情况。图7中可见体内实验结果显示白藜芦醇与替莫唑胺 双药纳米载药微球产生了显著优于替莫唑胺裸药以及白藜芦醇与替莫唑胺两药联合的抑瘤效果。同时观察各组小鼠的状态可见1、TEM组及对照组小鼠在观察终点时状态较差，活动迟缓，毛色无光泽，每日进食较少。2、TEM+RES组状态较裸药TEM组稍好。TEM/RES NPs组小鼠状态最佳，活动仍灵敏，毛色光亮，每日进食量未见减少。白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球在抗胶质瘤的应用效果良好。
权利要求
1.白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，其特征是由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料混合组成，其中，载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA);白藜芦醇(RES)和载药材料二种原料组分溶于水溶性无毒性溶剂有机溶剂中，替莫唑胺溶解于纯水并经搅拌后；用220±30nm的微孔滤膜过滤所得到的淡蓝色分散液即为粒径为80-120nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；并加热干燥或冻干。
2.根据权利要求1所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，其特征是替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇RES和载药材料组成的纳米载药微球与外加的冻干保护剂混合组成，其中，冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
3.根据权利要求1或2所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，其特征是按重量配比的组份为由3-18份替莫唑胺(TEM)、3-18份白藜芦醇(RES)和64-94份载药材料混合组成。
4.根据权利要求3所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，其特征是按重量配比的组份为5-15份替莫唑胺(TEM)、5-15份白藜芦醇(RES)和70-90份载体材料混合组成。
5.根据权利要求1、2或4所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，其特征是由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球与外加的冻干保护剂混合组成，其中，冻干保护剂为嵌段式聚醚(Pluronic F-68)。
6.根据权利要求5所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，其特征是按重量配比的组份为由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料组成的纳米载药微球混合药20-30份和外加的冻干保护剂70-80份混合组成。
7.根据权利要求1或6之一所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球或外加的冻干保护剂的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球在抗胶质瘤的应用。
8.一种白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于步骤一，配药按原料组分的重量配比分别称取3-18份替莫唑胺(TEM)、3-18份的白藜芦醇(RES)和64-94份的载药材料；载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；步骤二，溶药在常温条件下，将步骤一中称取的白藜芦醇RES和二亲嵌段共聚物载药材料二种原料组分溶于有机溶剂中，其中，按组分的重量配比，药及载体50-80、有机溶剂20-50 ;将步骤一中称取的替莫唑胺TEM溶于45-50摄氏度的纯水(包括蒸馏水等)中，其中按组份的重量配比，替莫唑胺20-50，蒸馏水50-80 ；步骤三，制备将步骤二得到的白藜芦醇及载体的有机溶剂在搅拌条件下逐滴加入替莫唑胺的水溶液中。再将所得到的有机溶剂与水的混合溶液在搅拌条件下缓慢加入一定量的蒸馏水中；其中有机溶剂与水的混合溶液与蒸馏水的体积比为，有机溶剂与水的混合溶液蒸馏水=1 5-8 ；步骤四，纯化将步骤三得到的有机溶剂稀释液，通过旋转蒸发法除去有机溶剂，或者用透析法除去有机溶剂；步骤五，过滤将步骤四得到的除去有机溶剂的稀释液，用220nm±30nm的微孔滤膜过滤以除去未包裹的替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料，所得到的淡蓝色分散液即为粒径为80-120nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；步骤六，加热干燥或冻干。
9.根据权利要求8所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于将步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液置于40+-5°C的烘箱中干燥，至水分完全挥发，即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球成品；或者在步骤五得到的抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液中，加入冻干保护剂嵌段式聚醚Pluronic F-68，冷冻干燥后即制得抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液冻干成品，其中，按组分的重量配比，该溶液冻干成品中的双药纳米载药微球混合药20-30份、冻干保护剂70-80份。
10.根据权利要求8或9所述的白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球的制备方法，其特征在于有机溶剂包括丙酮、乙醇、乙二醇、二甘醇、丙二醇、丙三醇、聚乙二醇或甲醇。
全文摘要
白藜芦醇与替莫唑胺双药纳米载药微球，由替莫唑胺(TEM)、白藜芦醇(RES)和载药材料混合组成，其中，载药材料为聚己内酯或聚乳酸或聚羟基乙酸与聚乙二醇合成的二亲嵌段共聚物聚己内脂-聚乙二醇(mPEG-PCL)或聚乳酸-聚乙二醇(mPEG-PLA)或聚羟基乙酸-聚乙二醇(mPEG-PLGA)；白藜芦醇(RES)和载药材料二种原料组分溶于水溶性无毒性溶剂有机溶剂中，替莫唑胺溶解于纯水并经搅拌后；用220±30nm的微孔滤膜过滤所得到的淡蓝色分散液即为粒径为80-120nm抗肿瘤的双药纳米载药微球溶液；并加热干燥或冻干。
文档编号A61K31/4188GK102988361SQ20121044695
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月9日 优先权日2012年11月9日
发明者王虹, 解卫平, 徐华娥, 李晓林 申请人:徐华娥, 李晓林