枳椇皮提取物在制备治疗肾结石药物中的应用及制备方法与流程

本发明涉及药学技术领域，尤其是枳椇皮提取物在制备治疗肾结石药物中的应用及制备方法。

背景技术：

肾结石是泌尿系统的一种常见病、多发病，其发病率高。西医多以碎石或手术取石方法治疗肾结石，需经过多次手术，这会增加肾脏损害和感染发生率，且治愈后复发率高。中医治疗尿路结石的特色在于把改善体质、消除产生结石的病理状态与促进排石相结合，因此中医药辨治和预防肾结石具有广阔前景。枳椇(Hovenia acerba Lindl)是鼠李科枳椇属下的一个种，高大乔木，别名拐枣、鸡爪树，桔扭子、鸡脚爪等，主产于贵州、河北、河南、浙江、安徽、云南等地^[6]。枳椇子是药食两用的中药材之一，具有较高的医疗价值，其种子可清凉利尿，止咳除烦，解酒毒。其皮可活血，舒筋解毒。其果梗可健胃，补血。食用可用于酿酒、制醋、生食和熬糖等。目前中药治疗肾结石研究方兴未艾。

技术实现要素：

本发明的目的是：提供一种枳椇皮提取物在制备治疗肾结石药物中的应用。

本发明的另一个目的是：以枳椇皮提取物作为有效成分制备治疗肾结石药物的方法。

本发明是这样实现的：枳椇皮提取物在制备治疗肾结石药物中的应用。

枳椇皮提取物的制备方法将鲜枳椇皮粉碎，过100目筛，以水为溶剂，料液比为1：10，单位为g/ml，加热回流提取3小时，再经过浓缩干燥，使产品的含水量降低至10％以下，即得枳椇皮提取物。

为了进一步验证本发明的技术效果，申请人进行了如下实验：

1试验材料

1.1SD大鼠体重180～220g，雄性，购于重庆腾鑫生物技术有限责任公司，合格证号：SCXK(军)2012-0011。

1.2提取物排石颗粒(批号:同药准字Z20044192，江西南昌济生制药厂)；枳椇皮，采于贵州花溪，经贵州大学熊源新教授鉴定为鼠李科植物枳椇Hovenia acerba Lindl的树皮部分。

1.3试剂乙二醇(批号：201405185，成都金山化学试剂有限公司)，氯化铵(批号：(津)XK13-011-00011，天津市永大化学试剂有限公司)。

1.4仪器Uv-5200型紫外可见分光光度计：上海元桥仪器有限公司生产；脱水机：PELORIS型，德国莱卡公司产品；包埋机：YB-9LF型，德国LEICA公司产品；切片机：RM2235，德国LEICA公司产品；电热恒温干燥箱：202-1AB型，天津市泰斯特仪器有限公司；显微镜：BX41型，日本Olympus公司产品；病理图文分析系统：HPIAS-1000型，华海公司产品；全自动生化分析仪：长春迪瑞CS-600B。

2试验方法

2.1大鼠肾结石模型制备及治疗给药方法

取SD大鼠42只，在适应性环境饲养2周后随机均分为5组，每组8只(模型组开始时为10只，其中2只另行标记，两周后为8只)，分别为正常组、模型组、枳椇皮高、低剂量组和排石颗粒组。除正常组每天自由饮自来水外，其余4组给大鼠造模，每天均用1％乙二醇冷开水饮水+1.25％氯化铵溶液30mL/只自由饮，再给30ml自来水自由饮，模型组每天灌胃2ml蒸馏水，阳性药(排石颗粒)组、枳椇皮高、低剂量组分别按100、100、25mg/kg灌胃给药，4周后结束实验。

2.2测定指标

实验结束前1d用代谢笼分别收集各大鼠24h空腹尿液，测定24h排尿量及用甲基百里香酚蓝比色法测24h尿钙(Ca²⁺)分泌量。大鼠心脏采血，离心取血清用于全生化自动测定：除蛋白法测肌酐(Crea)含量、二乙酰-肟比色法测血清尿素氮(BUN)含量^[12]。大鼠处死后取两侧肾称重，计算其肾脏系数。右肾用10％甲醛溶液固定，用于肾组织病理学检查，左肾超低温(-85℃)保存，用于测定肾组织总钙(Ca²⁺)含量。

2.3肾组织病理组织学检查

病理切片组织学观察：实验大鼠肾皮质、髓质分界是否清晰，肾小球、肾小管等有无异常改变，肾间质内有无炎细胞浸润及变性、出血等症状，重点观测肾小管内的草酸钙结晶形成情况，以及周围组织的病变、坏死等。观测指标为肾组织内草酸钙结晶的形成情况，炎性渗出及坏死物的出现情况。

2.4统计学处理

实验数据均以表示，并采用SPSS 22.0统计软件进行数据整理和统计分析，各组间比较采用单因素方差分析。实验结果以P<0.05为差异显著，P<0.01为差异非常显著，具有统计学意义。

3试验结果

3.1肾结石模型建立结果

经造模2周后，各造模组大鼠已变得无神，活动减少，食欲减退，毛色已变黄，此时将模型组另行标记的2只大鼠处死解剖后，取其肾脏，经切片染色观察或肉眼及体视显微镜检查确认已经有明显的结晶形成，见图1，证明造模大鼠肾结石形成明显。

3.2枳椇皮提取物对肾结石大鼠重量、肾脏系数和24h尿量的影响

各实验组大鼠在饮用乙二醇加氯化铵溶液2周后，与之前正常大鼠相比体重减轻；给药后各组的上述情况明显减轻(P<0.05)，并出现尿量增加，精神、饮食活动明显改善等。与模型组比较，枳椇皮提取物组大鼠的体重显著增加(P<0.05)，肾脏系数也有变缓趋势。阳性药排石颗粒可使结石大鼠24h排尿量显著增加(P<0.01)，体重也基本恢复接近正常动物水平。结果见表1。

表1对大鼠体重、肾脏系数和24h尿量的影响(n＝8,)

注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01

3.3枳椇皮提取物对结石大鼠血清尿素氮、肌酐、钙含量及肾组织钙含量、24h尿钙分泌量的影响

模型组大鼠比正常组大鼠血清尿素氮、肌酐、尿酸、肾组织钙含量显著增加(P<0.05)，血清钙含量未见显著变化。与模型组比较，枳椇皮提取物组大鼠的血清钙含量和肾组织钙含量明显降低(P<0.01)，24h尿钙有增加趋势，阳性药(排石颗粒)组大鼠的肾组织钙含量也明显下降(P<0.01)。给药组大鼠其他相关指标均有不同程度的改善趋势。结果见表2。

表2对血清尿素氮、肌酐、尿酸、钙、肾钙、尿钙的影响(n＝8,)

注：与模型组比较，*p<0.05，**p<0.01

3.4枳椇皮提取物对结石大鼠肾组织病理学影响

病理切片组织学观察：模型组可见肾组织内大量急、慢性炎细胞浸润，管内充满块状半透明蓝绿色的草酸钙结晶，肾小管扩张不明显，周围肾小球被挤压，面积减小，肾皮、髓质内可见多处肾小管内有炎性渗出物及坏死，与正常组比较，上述观测指标的差异均具有显著影响。给药组的肾组织内草酸钙结晶较碎小，比模型组明显减少，肾小管内坏死及炎性渗出物较模型组均明显减轻，几乎接近无。与模型组相比，给药组大鼠肾结石情况有不同程度的减少；枳椇皮提取物及阳性药(排石颗粒)组大鼠肾小管内坏死及炎性渗出物显著减轻，结晶减少，零碎散乱。结果见图1。

3.5大鼠24h尿液中草酸钙结晶观察情况

实验结束前一天，收集大鼠24h空腹尿量，测定尿钙，在显微镜下观察草酸钙结晶情况。草酸钙结晶表现为无色方形闪烁发光的八面体，有时呈现菱形，偶为饼形或哑铃型^[13]。

结果显示，枳椇皮提取物组和阳性对照组(排石颗粒组)尿中结晶显著增多。阳性对照组(排石颗粒组)和枳椇提皮取物组能促进大鼠结晶的排泄，减少肾脏结石疾病的发生率。结果见图2。

4讨论

枳椇常用于清凉利尿，止咳除烦，解酒毒等，但用于结石尚未见文献报道。本实验建立大鼠肾结石模型，对其抗结石作用进行了初步研究。结果显示其能缓解大鼠肾结石症状，表明枳椇皮提取物对大鼠肾结石有治疗作用。

本实验肾结石模型大鼠同步灌服一定剂量的枳椇皮提取液后，其可能通过促进肾脏组织和血液中Ca²+的排泄和代谢，降低肾组织Ca²+；同时改善肾组织病变情况，促进结石排出体外，减少肾组织中结石的形成。但其确切的机制尚待进一步的研究。

本发明发现枳椇的提取物能作为治疗肾结石的有效成分，并且经过实验证明，枳椇的提取物能对治疗肾结石具有较好作用，使用该药物对肾结石进行治疗，不仅能缓解肾结石症状，还能降低对肾脏的损害和感染发生率。

附图说明

附图1为病理切片组织学观察(放大倍数：60x 10)；

附图1中，a为正常组；b为排石颗粒组；c为模型组；d为枳椇皮高剂量组；e为枳椇皮低剂量组；

附图2为尿中草酸钙结晶检测(放大倍数：60x 10)

附图2中，a为排石颗粒组；b为模型组；c为枳椇皮高剂量组；d为枳椇皮低剂量组。

具体实施方式

本发明的实施例1：枳椇皮提取物在制备治疗肾结石药物中的应用。

枳椇皮提取物的制备方法，将鲜枳椇皮粉碎，过100目筛，以水为溶剂，料液比为1：10，单位为g/ml，加热回流提取3小时，再经过浓缩干燥，使产品的含水量降低至10％以下，即得枳椇皮提取物。

本发明的实施例2：将实施例1制备得到的醇提物进一步加工，加入药学上可接受的辅剂制溶液剂。