一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法与流程

本发明涉及生物医药领域。更具体地，涉及一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法。

背景技术：

为了应对生物医药领域中活性物质可控释放和靶向传递的挑战，需要提供高效能、耐久性的药物装载方法。传统的药物装载方法因低溶解性、高毒性、与其他物质易发生相互作用越来越不适应于现有临床药物的应用。

蛋白质胶囊是一种外部为微米或纳米大小的聚合物壳，内部包裹着活性物质的结构，其使用蛋白质作为前体物质可以得到具有低免疫原性的传递材料，并且可以特异性的传递药物至疾病组织而不影响健康组织，是目前最具前景的可控释放的载体工具之一。

微乳液制备方法是蛋白质胶囊应用最广泛的制备方法。这种方法使用两种不混溶的液体，一般来说是一种油相和一种水相。活性物质通常溶于油相之中作为被包裹相，水相通常包含蛋白质前体分子用于形成壳体。两种不混溶相形成的微乳液作为模板用于在相界面处合成胶囊。

烟草花叶病毒是一种棒状植物病毒，作为最早被发现及研究的一种植物病毒，其各方面的特性都已经被非常深入的研究。然而，目前为止并没有烟草花叶病毒衣壳蛋白在乳液界面组装制备蛋白胶囊方面的研究报道。因此，提供一种制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的方法具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种以烟草花叶病毒衣壳蛋白作为材料制备蛋白胶囊的方法。该制备方法步骤简单、制备周期短，控制烟草花叶病毒衣壳蛋白组装为棒状结构作为蛋白胶囊的组成基元，以获得较为坚固的蛋白胶囊结构。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤：

1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

在烟草花叶病毒溶液中加入乙酸，混匀后静置，离心去除RNA沉淀；将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸，将所得到的溶液在去离子水中透析12-24h，离心，将所得的沉淀用磷酸缓冲溶液复溶，得到烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液；

2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

在烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液中，加入油相，充分混合，得到烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液；

3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液中滴加稀盐酸调节酸碱度，之后在体系中加入交联剂，在4℃的条件下反应6h使烟草花叶病毒衣壳蛋白在油水界面处交联得到烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。

优选地，步骤1)中，所述烟草花叶病毒溶液的浓度为5-20mg/ml，与乙酸的体积比为1:2，混匀后静置30-40min；在该条件下烟草花叶病毒衣壳蛋白能够充分的被解离出来而又保持其生理活性；

优选地，步骤1)中，所述磷酸缓冲溶液为20-200mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液；更优选的，为100mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液，在该条件下烟草花叶病毒衣壳蛋白能够最好的保持其生理活性；

优选地，步骤1)中，所述离心为在4℃条件下以8000-10000rpm离心8-12min；

优选地，步骤2)中，所述烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液为含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的浓度为0.1-1mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的；更优选地，浓度为0.5mg/ml，在此浓度下烟草花叶病毒衣壳蛋白在油水界面的组装密度较为合适，便于之后的交联制备蛋白胶囊结构。

优选地，步骤2)中，所述油相为全氟萘烷，油水相的比例控制在1:8-1:12，以保证所制备的乳液的稳定性。

优选地，步骤3)中，所述酸碱度被调节至5.3-5.7；此酸碱度条件下烟草花叶病毒衣壳蛋白能够组装成棒状结构，以获得较为坚固的蛋白胶囊结构。

优选地，步骤3)中，所述交联剂为戊二醛，体系中戊二醛的终浓度为2-3％；更优选的，终浓度为2.5％，此浓度下交联效果较好且不影响衣壳蛋白的生理活性。

本发明中在烟草花叶病毒衣壳蛋白在界面组装的过程中，通过调节体系的酸碱度，使其能够以棒状组装形态高效地在油水界面进行组装；使用戊二醛作为交联剂在油水界面进行交联，以获得以棒状蛋白为基本组装单元的较为坚固的烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊结构，克服了烟草花叶病毒衣壳蛋白制备蛋白胶囊存在胶囊表面包覆率低，胶囊坚硬性差的缺点和不足。

本发明的有益效果如下：

本发明首次将烟草花叶病毒衣壳蛋白作为制备蛋白胶囊的材料，制备方法简单、周期短，制备得到的蛋白胶囊表面的衣壳蛋白包覆率高，胶囊结构坚固且均一，与其他结构相比，在生物催化、识别与传递等领域有着更广阔的应用前景。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法的流程示意图。

图2示出本发明实施例1-3所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液在显微镜下观察的图片。

图3示出本发明实施例1-3所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液在调节酸碱度后所得到的乳液液滴的透射电镜图。

图4示出本发明实施例1-3所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的扫描电镜图。

图5示出本发明对比例1所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液在调节酸碱度后所得到的乳液液滴的透射电镜图。

图6示出本发明对比例1所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的扫描电镜图。

图7示出本发明对比例2所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液在调节酸碱度后所得到的乳液液滴的透射电镜图。

图8示出本发明对比例2所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的扫描电镜图。

图9示出本发明对比例3所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液在调节酸碱度后所得到的乳液液滴的透射电镜图。

图10示出本发明对比例3所制备的烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的扫描电镜图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

实施例1一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤(其流程示意图如图1所示)：

(1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

取0.6ml浓度在10mg/ml的烟草花叶病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，将离心管颠倒5次以充分混匀后在4℃冰箱中静置30min。在4℃下以9500rpm离心10min以去除RNA沉淀。将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸部分。将所得到的溶液在去离子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm离心10min。将所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液复溶，获得烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。

(2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的0.5mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作为油相，经过以获得烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液。取一滴所制备的乳液，将其滴在玻璃片上，使用显微镜观察，可以观察到圆形的乳液液滴，如图2所示。

(3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在所得乳液体系中滴加稀盐酸，调节溶液酸碱度至5.5。保持震荡4h，使用透射电镜观察乳液液滴结构，可以看到在乳液液滴表面密集堆积的棒状烟草花叶病毒衣壳蛋白，如图3所示。之后在体系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在体系中的终浓度为2.5％，在4℃的条件下反应6h，以制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。将产物滴在硅片上干燥，之后通过扫描电镜观察。在扫描电镜下观察到坚固且均一的胶囊结构，如图4所示。

实施例2一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

取0.6ml浓度在20mg/ml的烟草花叶病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，将离心管颠倒5次以充分混匀后在4℃冰箱中静置40min。在4℃下以10000rpm离心8min以去除RNA沉淀。将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸部分。将所得到的溶液在去离子水中透析12h，之后在4℃下以8000rpm离心12min。将所得的沉淀加入200mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液复溶，获得烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。

(2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的1mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液2.2ml。加入0.2ml全氟萘烷作为油相，经过以获得烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液。取一滴所制备的乳液，将其滴在玻璃片上，使用显微镜观察，可以观察到圆形的乳液液滴，如图2所示。

(3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在所得乳液体系中滴加稀盐酸，调节溶液酸碱度至5.7。保持震荡4h，使用透射电镜观察乳液液滴结构，如图3所示，可以看到在乳液液滴表面分布着较多的棒状烟草花叶病毒衣壳蛋白。之后在体系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在体系中的终浓度为3％，在4℃的条件下反应6h，以制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。将产物滴在硅片上干燥，之后通过扫描电镜观察。在扫描电镜下观察到坚固且均一的胶囊结构，如图4所示。

实施例3一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

取0.6ml浓度在5mg/ml的烟草花叶病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，将离心管颠倒5次以充分混匀后在4℃冰箱中静置30min。在4℃下以8000rpm离心10min以去除RNA沉淀。将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸部分。将所得到的溶液在去离子水中透析24h，之后在4℃下以9000rpm离心10min。将所得的沉淀加入20mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液复溶，获得烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。

(2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的0.1mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1.6ml。加入0.2ml全氟萘烷作为油相，经过以获得烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液。取一滴所制备的乳液，将其滴在玻璃片上，使用显微镜观察，可以观察到圆形的乳液液滴，如图2所示。

(3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在所得乳液体系中滴加稀盐酸，调节溶液酸碱度至5.3。保持震荡4h，使用透射电镜观察乳液液滴结构，如图3所示，可以看到在乳液液滴表面分布着较多的棒状烟草花叶病毒衣壳蛋白。之后在体系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在体系中的终浓度为2％，在4℃的条件下反应6h，以制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。将产物滴在硅片上干燥，之后通过扫描电镜观察。在扫描电镜下观察到坚固且均一的胶囊结构，如图4所示。

对比例1一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

取0.6ml浓度在5-20mg/ml的烟草花叶病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，将离心管颠倒5次以充分混匀后在4℃冰箱中静置30min。在4℃以9500rpm离心10min以去除RNA沉淀。将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸部分。将所得到的溶液在去离子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm离心10min。将所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液复溶，获得烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。

(2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的0.5mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作为油相，经过以获得烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液。取一滴所制备的乳液，将其滴在玻璃片上，使用显微镜观察，可以观察到圆形的乳液液滴。

(3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在所得乳液体系中滴加稀盐酸，调节溶液酸碱度至6.0。保持震荡4h，使用透射电镜观察乳液液滴结构，如图5所示，可以看到在乳液液滴表面分布着较多的棒状烟草花叶病毒衣壳蛋白。之后在体系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在体系中的终浓度为2.5％，在4℃的条件下反应6h，以制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。将产物滴在硅片上干燥，之后通过扫描电镜观察。在扫描电镜下观察到破碎的胶囊结构，如图6所示。

对比例2一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

取0.6ml浓度在10mg/ml的烟草花叶病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，将离心管颠倒5次以充分混匀后在4℃冰箱中静置30min。在4℃下以9500rpm离心10min以去除RNA沉淀。将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸部分。将所得到的溶液在去离子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm离心10min。将所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液复溶，获得烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。

(2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的0.5mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作为油相，经过以获得烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液。取一滴所制备的乳液，将其滴在玻璃片上，使用显微镜观察，可以观察到圆形的乳液液滴。

(3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在所得乳液体系中滴加稀盐酸，调节溶液酸碱度至7.0。保持震荡4h，使用透射电镜观察乳液液滴结构，如图7所示，可以看到在乳液液滴表面分布着形态不规则烟草花叶病毒衣壳蛋白。之后在体系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在体系中的终浓度为2.5％，在4℃的条件下反应6h，以制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。将产物滴在硅片上干燥，之后通过扫描电镜观察。在扫描电镜下观察到胶囊结构完全破碎后所留下的轮廓结构，如图8所示。

对比例3一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法

一种烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备方法，包括以下步骤：

(1)烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液的制备

取0.6ml浓度在10mg/ml的烟草花叶病毒溶液，向其中加入1.2ml乙酸，将离心管颠倒5次以充分混匀后在4℃冰箱中静置30min。在4℃下以9500rpm离心10min以去除RNA沉淀。将上清液过脱盐柱分离，去除乙酸部分。将所得到的溶液在去离子水中透析18h，之后在4℃下以9000rpm离心10min。将所得的沉淀加入100mM的pH＝8.0的磷酸缓冲溶液复溶，获得烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液。

(2)烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液的制备

配制含有20mM pH＝8.0的磷酸缓冲溶液的0.5mg/ml的烟草花叶病毒衣壳蛋白溶液1.8ml。加入0.2ml全氟萘烷作为油相，经过以获得烟草花叶病毒衣壳蛋白乳液。取一滴所制备的乳液，将其滴在玻璃片上，使用显微镜观察，可以观察到圆形的乳液液滴。

(3)烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊的制备

在所得乳液体系的酸碱度为至8.0。保持震荡4h，使用透射电镜观察乳液液滴结构，如图9所示，可以看到在乳液液滴表面分布着形态不规则烟草花叶病毒衣壳蛋白。之后在体系中加入25％的戊二醛溶液，使得戊二醛在体系中的终浓度为2.5％，在4℃的条件下反应6h，以制备烟草花叶病毒衣壳蛋白胶囊。将产物滴在硅片上干燥，之后通过扫描电镜观察。在扫描电镜下观察到胶囊结构完全破碎后所留下的轮廓结构，如图10所示。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。