本发明涉及一种含有奎宁盐(quininesalt)化合物的悬浊液的抗癌剂组合物，更为详细地涉及一种制剂，其将奎宁盐化合物悬浊液作为主要成分的局部用药注射剂组合物，直接向癌细胞注射从而取得使得癌细胞坏死的抗癌效果。
背景技术：
通常，肿瘤作为一种疾病，其细胞无限增殖从而阻碍正常细胞的功能，根据病理组织学临床学判断标准，分为恶性肿瘤与良性肿瘤，通常所说的癌症(cancer)属于恶性肿瘤。
癌症为国内死亡原因的第一位，并且在全世界也占据死亡原因的前位。癌症的产生原因和治疗方法至今还没有明确的揭露，至今所开发的治疗剂在临床上使用时出现致命的副作用、抗性表达、淋巴细胞及骨髓破坏等的问题，由于这样的副作用而出现体重减轻脱发等症状。
由此，只对癌细胞具有细胞毒性而不对正常细胞造成影响的新的抗癌剂的开发迫在眉睫。
现在人体内产生的癌症大约有270余种，作为用于对此进行研究的细胞株报告有胃癌(mkn45)、肉瘤(sarcoma-180)、黑色素瘤(melanoma)、腺瘤(adenoma)、腺癌(adeno-carcinoma)、埃利希腹水瘤(ehrlichascitestumor)及walker氏癌(walkercarcinoma)等。
另外，奎宁作为抗疟疾剂而广为人知，现在被作为风湿性关节炎、盘状及全身红斑狼疮、光过敏性皮肤疾病的治疗剂而使用，最近报告有肾损伤抑制及安全神经胶质瘤的研究等。
此外，通过降低细胞的活性而用作解热剂也是广为人知的。
韩国专利登记第10-0390332号公开了一种抗癌剂复合组合物，将作为抗疟疾剂经常使用的羟化氯喹(hydroxychloroquine)、氯喹(chloroquine)、伯氨喹(primaquine)等，与作为抗癌剂的阿霉素(doxorubicin)、顺铂(cisplatin)等联合用药，据此降低抗癌剂的最小有效浓度(ic50)，并能够抑制抗癌剂所致的癌细胞的耐药性。
在此，羟化氯喹等抗疟疾剂作为辅助剂用于抑制抗癌剂的耐药性，从而使得抗癌效果提高，通过根据口服、非口服等抗癌剂的用药路径的全身用药而表现出效果。
并且，韩国公开专利公报第10-2006-0034316号(2006.04.24.公开)公开了含有奎宁和龙脑、五倍子和甘草提取物的痔疮治疗用固化剂注射剂。
所述公开专利中，无法找到关于通过奎宁盐进行抗癌治疗的记载，或药物疗效的相关记载。
此外，本申请人登记的登记专利第10-1067443号公开了含有羟化氯喹的用于痔核治疗的局部用药注射剂组合物，10-1208587号公开了含有羟化氯喹的用于抗癌治疗的局部用药注射剂组合物。
通过本申请人的所述登记专利，虽然在痔核及抗癌治疗方面羟化氯喹有效，但是羟化氯喹为水溶性，不仅向痔核及癌细胞扩散，还向周围的正常细胞扩散，从而问题在于，全身毒性的问题较大，为了治疗目的，不仅难以进行高浓度用药，而且也使得正常细胞坏死。
先行技术文献
专利文献
(专利文献0001)kr10-0390332b
(专利文献0002)kr10-1067443b
(专利文献0003)kr10-1208587b
技术实现要素：
本发明人为了解决如上所述问题，目的在于提供一种局部用药抗癌剂组合物，所述局部用药抗癌剂组合物使用难溶于水的奎宁盐悬浊液，从而只对患部癌细胞进行作用，从而使得癌细胞坏死，并作为不对患部周围的正常细胞造成影响的局部用药抗癌剂使用，尤其，用于将抗癌剂组合物直接向癌细胞进行注射或注入，所述抗癌剂组合物不向人体的全身扩散并只对癌细胞具有细胞毒性。
为了实现所述目的，在本发明中，作为羟化氯喹(hydroxychloroquine)的代替化合物使用奎宁盐的悬浊液，从而提供用于抗癌治疗的局部用药注射剂组合物。
本发明的注射剂组合物的作用在于，切断恶性肿瘤(癌细胞)及异常细胞增殖(血行代谢异常细胞增殖、良性肿瘤等)的血行代谢及生理代谢，从而使得患部的细胞坏死。
羟化氯喹作为奎宁的衍生物，用作抗疟疾剂、风湿治疗剂等，并且具有与奎宁类似的药理机制是广为人知的。
<羟化氯喹>
但是，所述的羟化氯喹是水溶性的，从而用于患部时，不仅患部，而且还向全身的正常细胞扩散，从而在体内全身毒性增大到百倍至数百倍以上，进而使得用于治疗的用药的危险性升高，并具有甚至使得正常细胞也坏死的副作用，从而取代其而使用难溶于水的奎宁盐，进而解决所述问题。
奎宁盐能够使用盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐等。
例如，奎宁盐酸盐(quininehydrochloride)具有如下化学结构式。
<奎宁盐酸盐>
所述化合物熔点为57℃，易于溶解至乙醇等有机溶剂，但是难溶于水，常温下以粒子状态的悬浊液(suspension)或固体(solid)存在，此悬浊液根据浓度在一定温度下溶解变为溶液状态(solution)。
表1
在奎宁盐的不同浓度下，剂型的温度变化
本发明人着眼于所述奎宁盐的水的溶解温度，从而解决现有的羟化氯喹注射剂的问题。
本发明的奎宁盐难以溶于水，在热水中溶解，从而以均质的溶液状态存在。
换句话说，将溶解于奎宁盐的水的温度为人体的温度36℃以上的奎宁盐悬浊液用作注射液，从而在比人体温度高的温度下对其进行溶解后，作为注射剂向人体的患部进行注射，因人体的温度而降至结晶温度以下，从而在组织内变为悬浊液(suspension)或固体(solid)状态，进而使得全身移行最小化，由此不再向人体内扩散，并切断细胞的血行代谢及生理代谢，在患部妨碍细胞的代谢，从而在注入注射液的同时使得注药周边细胞固化，由此只使得注射液注入的患部坏死，不向周围的正常细胞扩散，从而不影响正常细胞。
所述奎宁盐溶液虽然实质上看起来像溶液，但是奎宁盐在生理盐水中以均质状态的悬浊液存在，如果向患部注入，则生理盐水吸收至细胞内，并奎宁盐的浓度急剧升高，同时固化为固体(solid)状态，从而切断细胞的生理代谢，并通过奎宁的抗癌作用起到使得癌细胞坏死的药理作用。
由此，在人体的温度以下结晶的低浓度的奎宁盐悬浊液注射剂也能得到使用。
因此，解决了如下问题：因现有的羟化氯喹注射剂的水溶性，不仅患部，也向人体的全体正常细胞扩散，从而能够解决甚至使得正常细胞坏死的问题。
本发明的奎宁盐悬浊液注射剂组合物对皮肤癌等实体肿瘤而非全身癌有效。
本发明的抗癌剂组合物能够直接注射或注入至癌细胞等患部，并优选地是额外包括类似于利多卡因(lidocaine)的局部麻醉剂及/或类似于核黄素(riboflavin)的抗氧化剂。
此外，可包括造影剂或荧光剂，以便能够在本发明的注射剂组合物的体内用药后，因血行组织代谢的切断，在药物使用后追踪吸收代谢分布，并且可额外包括粘着剂，以便在患部内奎宁盐被结晶化的同时粘着于其。
所述造影剂或荧光剂使用通常用作医药制剂的一般成分，并且优选地，包括整体组合物对比0.01至0.2％(w/w)。
在本发明中，将含有奎宁盐悬浊液的局部用药组合物直接用药至恶性肿瘤或异常细胞增殖组织(癌细胞或良性肿瘤)等患部，从而切断癌细胞等的血行代谢及生理代谢，进而使得患部组织固化，由此被坏死。
癌细胞等因为相比正常细胞代谢迅速，所以通过奎宁盐悬浊液降低癌细胞的活性并切断细胞代谢，则组织变为非活性化，从而癌细胞增殖得到抑制及营养供给得到切断，从而最终使得癌组织坏死。
在本发明的组合物中，奎宁盐悬浊液通过本物质抗癌力效力试验得到确认，与浓度无关地表现出相同的性状、物理生化学、效力效果的悬浊液的通常特性。(参照图6、7、8)
由此，根据需要抗癌治疗的患者状态的缓急，可以通过浓度调节来用药。
换句话说，如果是急性，则为了迅速的治疗效果而以高浓度用药，较为轻且缓的治疗优选地反复数次以低浓度用药。
因此，在本发明的组合物中，奎宁盐的含量并非受到特别的限定，但是从注射剂的用途及药效的侧面来看，优选地在4至60％(w/w)范围内进行使用，并且更为优选地为10～50％(w/w)。
当不满4％(w/w)时，为了药力活性，需要增加用药次数，从而较为繁琐，当60％(w/w)以上时，注射液的粘度升高，从而用药有难度。
溶剂使用通常用作注射液的杀菌生理盐水。
在根据本发明的局部用药注射剂组合物中，局部麻醉剂通过注射直接向癌细胞用药时，因为以溶液状态用药且与人体的温度相比为高温可能引发疼痛，因此为了缓解疼痛而使用，并且优选地，利多卡因以1～2％(w/w)的浓度使用。
此外，抗氧化剂为了制剂的稳定性而调配，优选地，以0.1～0.5％(w/w)的浓度使用核黄素。
优选地，造影剂或荧光剂以与整体组合物对比0.01至0.2％(w/w)的形式含有。
根据本发明的用于抗癌治疗的局部用药注射剂组合物可根据通常的注射剂制造方法制造而成。
本发明的用于抗癌治疗的局部用药注射剂组合物，优选地，向癌细胞直接注射或注入，根据患者的状态，可间隔1～4日反复用药数周，并且根据癌细胞的大小和进展状态间隔1～2日反复用药，由此抑制癌细胞的增殖，并抑制癌细胞代谢，从而能够早日使得癌细胞固化非活性化。
就根据本发明的含有奎宁盐的局部用药注射剂组合物而言，在体外(invitro)通过噻唑蓝比色法(mttassay)表现出mkn45的ic50值相比紫杉醇(paclitaxel)大约低10倍程度的值，因此判断具有优秀的细胞毒性效果。
此外，由于奎宁盐难溶于水，所以具有如下效果：防止患部之外的全身移行，从而能够防止出现全身毒性及正常细胞坏死的副作用，从而不会引起体重减少等。
通过造影剂或荧光剂的使用，能够确认患部的代谢分布，从而能够有效地用药，进而达到用药的准确性。
附图说明
图1是表示通过噻唑蓝比色法(mttassay)比较对照药物和本发明组合物对mkn45细胞株的生长影响的图表。
图2是表示针对balb/c裸(nude)小鼠的体重变化，比较本发明组合物和对照药物的图表。
图3是表示在balb/c裸小鼠中针对mkn45细胞株的实体肿瘤的体积变化，比较本发明组合物和对照药物的图表。
图4是表示在balb/c裸小鼠中针对mkn45细胞株的实体肿瘤的重量变化，比较本发明组合物和对照药物的图表。
图5是在赋形剂对照组g1的balb/c裸小鼠中mkn45细胞株致使实体肿瘤产生部位的照片。
图6是使用了本发明的悬浊液注射剂12.5mg/headg2两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤坏死并脱落的照片。
图7是使用了本发明的悬浊液注射剂25mg/headg3两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤坏死并脱落的照片。
图8是使用了本发明的悬浊液注射剂50mg/headg4两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤坏死并脱落的照片。
图9是对照物质用药组g5用药两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤增殖的照片。
具体实施方式
以下，通过实施例对本发明进行具体说明。但是，这些实施例只是本发明的示例，本发明的范围并非受其限定。
实验方法
(1)用药药物
用于实验的本发明的奎宁盐悬浊液组合物，作为奎宁盐使用奎宁盐酸盐，从而制造直接向癌细胞注射或注入的局部用药制剂奎宁盐酸盐(quininehydrochloride)50％(w/w)悬浊液。
具体而言，混合奎宁盐酸盐50g、利多卡因(lidocaine)1.5g、核黄素(riboflavin)0.15g及造影剂(东国制药tomoray320)0.1g后，添加注射用生理盐水(saline)48.25ml，从而制造100g注射剂悬浊液。
作为注射液使用时，在水浴上以60℃进行加温溶解后，将其注射至患部。
作为培养对照药使用的紫杉醇(paclitaxel)是从(株)vspharm购入。
(2)癌细胞株
本实施例中使用的癌细胞株为mkn45，是从韩国细胞株银行获得的。
mkn45细胞株的培养是由(株)chemon非临床研究所效能组来实施，并利用rpmi1640培养液(与左旋谷酰胺(l-glutamine)和10％fbs一起)在5％co2恒温箱(incubator)中进行48小时传代培养，从而用于实验。
为了动物实验，将mkn45细胞株向balb/c裸小鼠腹腔内以5×106cells/
(3)实验动物
购买出生五周的balb/c裸小鼠(生产者：中央实验动物)50只，使其适应一周后用于实验。动物在京畿生物中心动物饲养区2号室饲养，饲养条件为保持室温23±3℃、相对湿度55±15％、换气次数10-20次/hr，照明时间12小时(上午8时点灯-下午8时关灯)以及光照度150-300lux。
所述小鼠用药开始时体重范围为18.67至23.19g。
实施例1
测定mkn45细胞株中的细胞毒性
为了评价本发明的组合物对细胞毒性造成的影响而使用mtt比色法。
mtt比色法作为用于测定细胞的生存率的实验室实验法，可以称作标准比色分析法(standardcolorimetricassay)。
作为能够准确测定细胞的增殖和活着的细胞的技法，mtt比色法是生命科学领域、尤其是肿瘤生物学所必需的技法之一。
为了确认用于新抗癌剂开发的效能检索或现有开发的抗癌剂的敏感性，在进行动物试验等适用于活体之前，需要在先客观证明在活体外药物抑制肿瘤细胞的生长的过程。
将所述(2)中所制造的细胞株和本发明奎宁盐酸盐在乙醇(ethylalcohol)溶解的溶液浓度分布按照
之后，再次在37℃下5％co2恒温箱中培养24小时，加入
利用离心分离机去除上清液，并向每个孔分别加入dmso
50％抑制浓度(ic50)定义为生存率达到50％的药物的浓度，将ic50值用作抗癌效果的指标。
图1是表示通过mtt比色法比较对照药物和本发明奎宁盐酸盐的效果对mkn45细胞株的生长影响的图表。
如图1所示，在接种mkn45细胞株悬浮液后，与对照药物紫杉醇(paclitaxel)的抗癌力进行比较的结果为，紫杉醇的ic50值在
换句话说，本发明的奎宁盐酸盐悬浊液在体外(invitro)通过mtt比色法表现出mkn45的ic50值相比紫杉醇大约低10倍程度的值，因此判断具有优秀的细胞毒性效果。
实施例2
本发明的注射剂影响癌细胞生长变化的效果
为了在balb/c裸小鼠观察本发明组合物的抗癌力，在接种mkn45之后，评价对mkn45的分化造成的影响。
根据表1，将适应饲养设施的动物共分为五组(g1～g5)，从而以各个组分配八只动物的形式使用。
以下表2表示实验组设定及用药浓度。
表2
将mkn45细胞按照5×106cells/100ul/head向全部组的右侧胁腹(flank)进行移植，从而诱发实体肿瘤。
当移植的细胞株的肿块达到大约150至200mm3时，均匀地向各个组进行组分离，将本发明注射剂悬浊液组合物分别设定为低容量(12.5mg/head)、中间容量(25mg/head)、高容量(50mg/head)，从而以三日为间隔进行三次用药，并测定一般症状、体重变化、肿瘤体积及肿瘤重量，从而进行评价，对赋形剂对照组及对照组(紫杉醇)进行比较。
首次用药，与体重无关，用50ul/head计算出用药溶液量。
从二次用药开始，在高容量的情况下，直接使用调配的高容量，在中间容量的情况下使用25mg/head、在低容量的情况下使用12.5mg/head，计算出用药量。
中间容量将调配的悬浊液注射剂稀释为两倍来使用，低容量稀释为四倍来使用。
注射液以42至45℃在溶池进行加热溶解后，利用0.3ml胰岛素(insulin)注射器，在肿瘤顶点用药
一般症状观察结果，赋形剂对照组(g1)从第16天出现消瘦，本发明悬浊液注射剂12.5mg/head用药组(g2)第1天出现消瘦1例，第16天肿瘤脱落4例及部分坏死3例，第18天及第19天消瘦各1例，并且第24天肿块再形成2例。
本发明悬浊液注射剂25mg/head用药组(g3)的情况下观察到第16天肿瘤脱落2例及部分坏死5例，第18天消瘦1例，第24天肿块再形成2例。
本发明悬浊液注射剂50mg/head用药组(g4)的情况下观察到第1天活力下降1例，衰弱1例，第16天部分坏死4例，第24天肿块再形成1例。肿块再形成被判断为，在未受到本发明的悬浊液注射液的影响的其余的残留癌细胞的部位产生的。
图2是表示对balb/c裸小鼠中根据用药的不同而产生的体重变化，比较本发明组合物和赋形剂对照组(g1)及对照物质组(g5)的图表。
如图2所示，并未观察到因本发明的组合物用药而使得体重减少，但是赋形剂对照组(g1)及对照物质组(g5)中表现出显著的体重减少，从而表现出因癌细胞的繁殖导致的衰弱现象和(g1)、因药物的毒性(g5)而体重减少。
由此，本发明的组合物虽然确认了使得癌细胞坏死脱落的抗癌效果，但是因药物导致的全身毒性却微不足道。
对于本发明的悬浊液注射剂的抗癌指标根据日期按照各个组测定肿瘤的平均体积，实验结束日通过复检进行肉眼观察，并测定肿瘤的平均重量，肿瘤体积和肿瘤重量显著减少。
图3是表示在balb/c裸小鼠中对mkn45细胞株实体肿瘤的肿瘤体积造成影响的本发明组合物的效果的图表。在此，g1为无处置组，g2为本发明组合物15㎎/head用药，g3为本发明组合物25㎎/head用药，g4为本发明组合物50㎎/head用药，g5为对照物质(紫杉醇)用药组。
肿瘤体积测定结果，本发明的12.5mg/head及25mg/head用药组(g2及g3)与赋形剂对照组g1相比，第8天后开始观察到统计学上有意义的肿瘤体积减小。
本发明50mg/head用药组(g4)与赋形剂对照组(g1)相比，从第3天开始观察到统计学上有意义的肿瘤体积减小。
图4是表示在balb/c裸小鼠中对mkn45细胞株的实体肿瘤的肿瘤重量造成影响的本发明组合物效果的图表。
肿瘤重量测定结果，本发明的12.5mg/head、25mg/head及50mg/head用药组(g2、g3及g4)与赋形剂对照组(g1)相比，确认到统计学上有意义的肿瘤重量减少。
图5是在赋形剂对照组(g1)的balb/c裸小鼠中mkn45细胞株致使实体肿瘤产生部位的照片。
图6是使用了本发明的悬浊液注射剂12.5mg/head(g2)两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤坏死并脱落的照片。
图7是使用了本发明的悬浊液注射剂25mg/headg3两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤坏死并脱落的照片。
图8是使用了本发明的悬浊液注射剂50mg/head(g4)两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤坏死并脱落的照片。
图9是对照物质用药组(g5)用药两周后，在balb/c裸小鼠中mkn45细胞株的实体肿瘤增殖的照片。
如以上图5及图9所示，赋形剂对照组(g1)及对照物质用药组(g5)中，肿瘤细胞增殖为五倍以上，赋形剂对照组(g1)及对照物质用药组(g5)中癌细胞增殖抑制效果表现出微不足道，g2、g3、g4中本发明的注射剂组合物的初始用药容量有2倍、4倍的差异，但是两周后的结果表现出相似的肿瘤组织坏死剥离状态，本发明的悬浊液注射剂根据浓度(容量)变化的效力效果未表现出差异，其被确认为本发明的悬浊液注射剂的一般特异性，并且表现出奎宁盐悬浊液的物理生化学性状和效果效能根据浓度的不同不会产生根本的差异。
因此，就本发明的注射剂组合物而言，奎宁盐的浓度范围并非因形式化地记载于权利要求范围而其权利范围受到限制。
观察以上的结果，移植胃癌细胞株mkn45，将本发明的悬浊液注射剂组合物向实体肿瘤进行用药时，本发明的悬浊液注射剂组合物在肿瘤体积中，与赋形剂对照组(g1)相比，确认到有意义的体积减小，尤其，本发明的悬浊液注射剂组合物12.5mg/head、25mg/head及50mg/head用药组(g2、g3及g4)与赋形剂对照组(g1)相比，确认到有意义的肿瘤重量减少，通过本发明的悬浊液注射剂组合物用药使得肿瘤脱落，从而判断为因肿瘤坏死脱落而表现出抗肿瘤效果。
本发明的悬浊液注射剂组合物具有抗癌机制，在用药的肿瘤组织进行局部作用，并表现出迅速的抗肿瘤治疗效果(用药后1至2周)。
因此，本发明的悬浊液注射剂组合物作为一种组合物，预想其抗癌治疗效果超越现有抗癌剂效果。
以上说明的本发明并非限定于前面所述的构成及附图，在不脱离本发明的技术思想的范围内可进行各种置换、变形对于本发明所属技术领域内具有通常知识的人员来讲是不说自明的。
因此，本发明真正的技术保护范围应根据所附的权利要求范围的技术思想来决定。