本发明涉及生物和医药技术领域，尤其涉及特异性抑制剂在眼病治疗中的应用。
背景技术：
视网膜神经退行性疾病是一类以光感受器或视网膜色素上皮细胞变性、死亡为主要病理改变的难治性眼病，主要包括视网膜色素变性、老年性黄斑变性等，是典型的神经退行性变，最终导致不可逆视功能丧失，严重影响人类生活适量。
神经炎症是视网膜神经退行性疾病的重要病理基础。在视网膜色素变性、老年性黄斑变性等视网膜神经退行性疾病中，普遍存在异常活跃的视网膜炎症反应：免疫细胞功能紊乱引发异常免疫应答、炎症因子大量释放，促进神经元的损伤和变性，损害视功能。
目前视网膜神经退行性疾病的治疗尝试包括：基因治疗、干细胞移植等，但是临床上尚未有确切疗效的治疗方法，其中一个重要原因是这些治疗易诱发和加重组织炎症，导致神经细胞变性、死亡。调控神经炎症成为治疗视网膜神经退行性疾病的一个重要治疗策略，但神经炎症的来源和发生机制尚不明确。
程序性坏死是一种主动的按照一定程序发生的新型细胞死亡过程，与炎症密切相关。程序性坏死的发生依赖受体相关蛋白激酶-1(rip1)和rip3的激活，从而向细胞下达死亡指令，引起细胞胞膜溶解、释放炎性介质，如损伤相关模式分子(damps)、核转录因子(nf-κb)等，导致炎性损伤。调控程序性坏死介导的炎症反应成为治疗视网膜神经退行性疾病的一种新思路和新方向。
5-(1h-indol-3-ylmethyl)-3-methyl-2-thioxo-4-imidazolidinone，即necrostatin-1，是程序性坏死的特异性抑制剂，分子量为259.33，属于生物碱类物质。它主要是通过特异性阻断rip1的磷酸化从而抑制细胞程序性坏死。
necrostatin-1在心脑血管疾病动物模型中被证实具有良好的治疗或缓解作用。如necrostatin-1可减少小鼠脑中动脉栓塞所致的脑梗死面积；可有效减轻急性心肌缺血再灌注所致的心肌损伤。干预程序性坏死在心肌缺血、脑血管疾病动物模型中显现出强大的治疗潜能，成为心血管疾病患者的福音。机制上，主要认为necrostatin-1通过抑制组织实质细胞(如神经元、心肌细胞)的程序性坏死，保护其存活并发挥功能。目前研究尚未报道necrostatin-1在治疗神经退行性眼病中发挥积极的作用。我们首次发现necrostatin-1可有效治疗神经退行性眼病，其机理是通过necrostatin-1抑制免疫细胞(非实质细胞)的程序性坏死，从而减少免疫细胞因程序性坏死而产生和释放的炎症因子，减轻组织的炎症反应，从而发挥治疗效应。
技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种有效的治疗神经退行性疾病的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
necrostatin-1在制备治疗神经退行性眼病药物中的应用。
necrostatin-1的给药浓度为0.5-2.0毫摩尔/升。优选地，necrostatin-1的给药浓度为1.0毫摩尔/升，是将necrostatin-1溶于磷酸盐缓冲液而获得。
necrostatin-1的给药方式为玻璃体腔内给药。
本发明将necrostatin-1用于治疗视网膜色素变性，并通过模型建立进行以下效果评价：(1)视觉电生理检查；(2)视网膜病理切片观察；(3)免疫荧光染色、westernblot、qpcr等分子生物学技术检测。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗后，小鼠的视网膜电图(erg)波形振幅提高，视功能得到改善。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗后，小鼠的视网膜厚度增加。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗后，小鼠视网膜神经细胞的死亡数量明显减少，神经细胞的存活增加。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗，能有效减少rip1和rip3表达，抑制视网膜程序性坏死。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗，能有效减少视网膜小胶质细胞发生程序性坏死的数量。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗后，小鼠视网膜组织炎症因子tnf-α、ccl2的mrna水平下降。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗后，小鼠视网膜组织炎症因子tnf-α、il-17的蛋白表达减少，组织炎症减轻。
本发明通过实验证明：对视网膜色素变性小鼠进行玻璃体腔内注射necrostatin-1治疗后，视网膜小胶质细胞分泌的炎症因子tnf-α显著减少。
本发明通过实验证明：在体外给予necrostatin-1处理视网膜小胶质细胞(bv2细胞系)，能减少过氧化氢诱导的细胞程序性坏死数量和炎症因子的分泌。
总的来说，本发明将necrostatin-1作为药物进行玻璃体腔内注射，干预视网膜色素变性小鼠模型，实验证明，necrostatin-1具有抗炎和神经保护作用，能减轻视网膜退行性变过程中的慢性炎症反应、减轻视网膜损伤，改善视网膜功能，为临床治疗神经退行性疾病开辟新途径。
本发明提供了necrostatin-1在制备治疗神经退行性疾病药物中的应用。necrostatin-1具有抗炎以及神经保护作用，能减轻神经炎症，缓解神经损伤，保护神经细胞，从而改善神经功能，为临床治疗神经退行性疾病开辟新途径。所述药物主要是通过抑制神经炎症而发挥保护神经的作用：在体内能显著减少视网膜色素变性模型小鼠光感受器细胞的丢失，保护视功能；在体内能显著抑制视网膜色素变性模型小鼠视网膜小胶质细胞的程序性坏死，减少其分泌促炎因子；在体外能抑制病理刺激导致的小胶质细胞程序性坏死，减少炎症因子的释放。
附图说明
图1a是necrostatin-1治疗后小鼠的视网膜电图(erg)的a波振幅统计图，其中，pbs为溶剂对照组，nec-1为治疗组小鼠。暗适应12小时后，在3.0cds/m2光照强度下，治疗组与对照组相比，a波振幅改善：*p<0.05；
图1b是necrostatin-1治疗后小鼠的视网膜电图(erg)的b波振幅统计图，其中，pbs为溶剂对照组，nec-1为治疗组小鼠。暗适应12小时后，在3.0cds/m2光照强度下，治疗组与对照组相比，b波振幅改善：***p<0.001；
图1c是necrostatin-1治疗后小鼠的视网膜电图(erg)的a波振幅统计图，其中，pbs为溶剂对照组，nec-1为治疗组小鼠。暗适应12小时后，在10.0cds/m2光照强度下，治疗组与对照组相比，a波振幅改善：***p<0.001；
图1d是necrostatin-1治疗后小鼠的视网膜电图(erg)的b波振幅统计图，其中，pbs为溶剂对照组，nec-1为治疗组小鼠。暗适应12小时后，在10.0cds/m2光照强度下，治疗组与对照组相比，b波振幅改善：*p<0.05；
图2a是溶剂对照组的小鼠视网膜石蜡切片h&e染色图，其中，gcl表示视网膜神经节细胞层，inl表示内核层，onl表示外核层；
图2b是necrostatin-1治疗组的小鼠视网膜石蜡切片h&e染色图；其中，gcl表示视网膜神经节细胞层，inl表示内核层，onl表示外核层；
图2c是necrostatin-1治疗后小鼠视网膜的厚度统计图，可见治疗组的小鼠视网膜内核层及外核层厚度增加：*p<0.05；
图3a是necrostatin-1治疗后小鼠视网膜冰冻切片免疫荧光图，用dapi标记细胞核，tunel、caspase-3标记凋亡细胞，其中pbs为溶剂对照组，nec-1为治疗组，可见治疗后神经细胞死亡数量减少，存活增加；标尺：25μm；
图3b是necrostatin-1治疗后小鼠视网膜冰冻切片tunel染色阳性细胞数量统计图，可见治疗组tunel阳性细胞数量较对照组明显减少，***p<0.001；
图3c是necrostatin-1治疗后小鼠视网膜冰冻切片caspase-3染色阳性细胞数量统计图，可见治疗组caspase-3阳性细胞数量较对照组明显减少，**p<0.01；
图4a是反映necrostatin-1治疗后小鼠视网膜组织程序性坏死蛋白rip1和rip3表达情况的westernblot图，β-actin为内参蛋白；其中，wt为野生型小鼠，rd1为无处理的视网膜变性小鼠，nec-1为治疗组，pbs为溶剂对照组；
图4b是小鼠视网膜组织程序性坏死蛋白rip1和rip3表达量的统计图，可见治疗组与对照组相比显著下降，*p<0.05,**p<0.01
图5是反映necrostatin-1治疗后小鼠视网膜组织小胶质细胞程序性坏死情况的视网膜铺片免疫荧光染色图，分别用iba-1标记视网膜小胶质细胞、tunel标记死亡细胞、rip3标记程序性坏死。tunel、rip3双阳性细胞为发生程序性坏死的细胞，可见治疗组与对照组相比，发生程序性坏死的小胶质细胞显著减少；标尺：50μm；
图6a是反映necrostatin-1治疗后小鼠视网膜组织炎症因子tnf-α的mrna表达改变的q-pcr图，图中pbs代表对照组，nec-1代表治疗组，可见治疗组与对照组相比tnf-α表达量显著下降，**p<0.01，
图6b是反映necrostatin-1治疗后小鼠视网膜组织趋化因子ccl2的mrna表达改变的q-pcr图，图中pbs代表对照组，nec-1代表治疗组，可见治疗组与对照组相比ccl2表达量显著下降，***p<0.001；
图6c是反映necrostatin-1治疗后小鼠视网膜组织炎症因子tnf-α、ccl2、il-17蛋白表达的改变的westernblot图，β-actin为内参蛋白；图中pbs代表对照组，nec-1代表治疗组；
图6d是小鼠视网膜组织炎症因子tnf-α、ccl2、il-17蛋白表达量改变的统计图，可见治疗组与对照组相比炎症因子均显著下降，*p<0.05,**p<0.01；
图6e是小鼠视网膜铺片免疫荧光染色图，分别用iba-1标记视网膜小胶质细胞，rip3标记程序性坏死，tnf-α标记炎症因子。图中wt代表野生型小鼠，pbs代表视网膜变性小鼠的溶剂对照组，nec-1代表治疗组；可见necrostatin-1治疗后小鼠视网膜小胶质细胞分泌炎症因子对照组相比显著下降；标尺：50μm；
图7a是反映necrostatin-1在体外处理小胶质细胞(bv2细胞系)后程序性坏死蛋白rip1、rip3、mlkl表达的改变的westernblot图，β-actin为内参蛋白；其中h2o2代表过氧化氢，nec-120um和nec-140um分别代表不同浓度的nec-1；图7b是小胶质细胞(bv2细胞系)程序性坏死蛋白rip1、rip3、mlkl表达情况的统计图，可见治疗组与对照组相比显著下降，*p<0.05,**p<0.01，***p<0.001；
图8a是反映necrostatin-1在体外处理小胶质细胞(bv2细胞系)后炎症因子il-17、il-6、ccl2蛋白表达的情况的westernblot图，β-actin为内参蛋白；其中h2o2代表过氧化氢，nec-120um和nec-140um分别代表不同浓度的nec-1；
图8b是小胶质细胞(bv2细胞系)炎症因子il-17、il-6、ccl2蛋白表达的统计图，可见治疗组与对照组相比显著下降，*p<0.05,**p<0.01。
具体实施方式
以下结合实验进一步说明本发明的技术方案。
·1.实验前期准备
·1.1实验动物
野生型c57bl/6小鼠购自广东中医药大学实验动物中心。rd1小鼠购自北京维通利华公司。动物伦理及所有实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》。
·1.2实验试剂和抗体
necrostatin-1(sigma)；h2o2(sigma)；抗iba-1抗体(wako)；抗rip1抗体(bdbioscience)；抗rip3抗体(abcam)；抗mlkl抗体(abcam)；抗tnf-α抗体(abcam)；抗ccl2抗体(novus)；抗il-17抗体(abcam)；抗caspase-3抗体(bdbioscience)；optimalcuttingtemperaturecompound(oct)包埋液；抗actin抗体(abcam)；驴抗兔igg二抗(488)；驴抗小鼠igg二抗(555)；驴抗大鼠igg二抗(647)；dapi(lifetechnologies)；tunel试剂盒(roche)。
·1.3缓冲液
1)ripabuffer蛋白裂解液：0.5mnacl1ml；2mmedta0.04ml；pmsf100ul；50mmtris,ph7.40.5ml；1％np-401ml；0.1％sds0.2ml；加超纯水定容至10ml。
2)10xtae：17.4mglacialaceticacid11.4ml；edta3.7g；trisbase48.4g；双蒸水定容至总体积1.0l。
3)封闭液：50ultriton-x100；0.5g胎牛血清蛋白(bsa)；加入10.0mlpbst或tbst配置而成。
4)2xsds上样缓冲液：tris-hclph6.8；β-巯基乙醇(200mm)；甘油(20％)；sds(4％)；溴酚兰(0.2％)。
5)pbs/pbst缓冲液：nacl16.0g；nah2po40.46g；kcl0.40g；na2hpo40.24g，加双蒸水定容至总体积2.0l，按1‰加入tween-20配置成pbst溶液；
6)电泳缓冲液：1.25mglycine94g；0.125mtris15.1g；0.5％(w/v)sds5g；加入双蒸水定容至1l。
7)电转缓冲液：0.125mtris15.14g；1.25mglycine72.07g；双蒸水400ml；加水至500ml。
·1.4实验仪器和器材
视网膜电图仪(retiscansystem)；德国莱卡冰冻切片机(leica,cm1950,德国)；激光共聚焦显微镜(carlzeiss，lsm710，德国)；荧光显微镜(a1，axiovision，leica，dm4000，德国)；眼科显微器械；33g显微注射器(hamilton)
·1.5统计和分析软件
使用graphpadprism6和photoshop软件(adobecc，2015)进行实验数据整理和图片绘制；spss软件(版本18.0)进行统计分析；imagej软件进行形态学结果定量分析，采用studentt-test和onewayanova分析组间差异，结果*p<0.05为具有统计学意义。
●2.实验方法及结果
●2.1小鼠眼球玻璃体腔内注射necrostatin-1：
1)将necrostatin-1溶于磷酸盐缓冲液(pbs)配制成1毫摩尔/升的浓度。
2)将出生后第9天的rd1视网膜变性小鼠和野生型c57小鼠麻醉(4.3％水合氯醛腹腔注射，10ml/kg)后进行药物散瞳(复方托比卡胺滴眼液)；
3)手术显微镜下，调整小鼠头位。使用无菌纱布或其他无菌物垫于小鼠头部之下，使眼球保持角膜缘水平位；
4)切开眼球上方结膜少许，暴露巩膜，用显微铲针刺穿前房放出少许房水，在角膜缘后1-2mm处，针尖垂直进入。随后换成33g微量注射器缓慢推注necrostatin-1溶液，注射量为1.0ul。手术显微镜下看到药物于玻璃体腔内释放，则玻璃体腔内注射成功。对照组注射不加药物的pbs溶液。
5)将出现视网膜出血、视网膜脱离等并发症的实验动物进行剔除。
●2.2视网膜电图(erg)评价necrostatin-1治疗后小鼠的视网膜功能：
1)准备工作。采用视网膜电图仪(retiscansystem)对出生14天的rd1小鼠和c57小鼠进行erg检测。检查前对小鼠进行12小时的暗适应。腹腔内注射4.3％水合氯醛(10ml/kg)进行麻醉，复方托吡卡胺滴眼液散瞳。
2)erg检测。实验全过程在微弱红光照明条件下进行。将小鼠固定于实验板上，安装电极。在角膜上滴少许甲基纤维素，将记录电极(0.2mm铜丝制成的环状角膜电极)紧贴在角巩缘上，将参考电极(针形电极)放置在小鼠同侧颊部皮下，接地电极放置在小鼠尾部皮下。再次暗适应约5分钟后开始进行相关的检查。应国际临床视觉电生理标准化方案进行暗适应erg(scoterg)检测和记录。分别记录3.0cds/m2和10.0cds/m2光照强度下小鼠的erg波形，检测频闪反应时对其进行30hz的标准闪光刺激，并舍弃前三个反应波。应用软件对波形进行分析和统计。
3)实验结果如附图1a～图1d所示，可观察到对照组(注射pbs)的rd1小鼠呈现熄灭性erg，几乎探测不到波形；经过necrostatin-1治疗后，在暗适应两种不同的刺激强度(3.0及10.0cds/m2)下均发现erg的a波和b波均出现一个有统计学意义的波形振幅，提示视网膜神经功能有部分改善。
●2.3石蜡切片h&e染色观察necrostatin-1治疗小鼠视网膜结构的变化：
1)试剂及前期准备：
混合固定液：中性福尔马林(甲醛100ml、na2hpo46.5g、nah2po44g、蒸馏水900m1)；③苏木精染液：苏木精lg，无水乙醇10ml，蒸馏水200ml，硫酸铝钾20g，氧化汞0.5g，使用前每100ml加入冰醋酸3～4ml；④分化液：1％盐酸酒精；⑤1％醇溶性伊红液：伊红1g，80％乙醇10ml，用时加1滴的冰醋酸。
2)组织石蜡包埋与切片：
a.处死出生后14天的rd1小鼠，取得眼球，置于10％福尔马林固定18～24小时；
b.梯度乙醇中进行脱水12小时；
c.依次在二甲苯浸泡2小时、65℃石蜡浸泡3～4h进行透化和浸蜡；
d.自动包埋机将组织包制，切片机获得取3～4um切片贴附于载玻片上；
3)h&e染色：
a.二甲苯脱蜡，100％、95％、75％梯度酒精清洗至水化；
b.苏木精浸染10～15分钟进行染色，流动水清洗；
c.分化、返蓝：1％盐酸酒精分化1-2秒，饱和氨水蓝化数秒流水冲洗15～
d.30分钟；
e.伊红染色：以1％醇溶性伊红浸染5～15秒；
f.常规脱水、透明、封片。
4)实验结果如附图2a～图2c所示，经necrostatin-1治疗后，rd1视网膜变性小鼠视网膜内核层(inl)及外核层(onl)的厚度明显增加，提示视网膜病变减轻。
·2.4tunel/caspase-3免疫荧光检测视网膜细胞凋亡情况：
1)试剂准备：
a.dna酶的配置：将1mgdnase加入100mlpbs配置成15000u/l的dna酶液
b.阳性对照液：用50umtrishclph7.5配bsa1mg/ml，然后用其稀释dnase液工作浓度至dnase3000u/ml，配比为4：1。
c.阴性对照液：50ullabelsolution。
d.配置反应液：10ulenzymesolution加上90ullabelsolution配置而成，现配现用，全程冰上操作。
2)采用罗氏(roche)tunel试剂盒(insitucelldeathdetectionkit,fluorescein)，按照说明书要求进行操作。
a.制作6-8um视网膜冰冻切片；
b.用4％pfa室温下固定1小时，pbs清洗；
c.阳性对照组加dnase液处理10分钟，室温，pbs清洗；
d.阳性对照及实验组加50ul/10ul反应液，阴性对照加50ullabelsolution，37℃孵育1小时，注意保湿。
e.pbs清洗后染dapi3-5分钟，封片，在荧光显微镜下观察。
f.tunel与caspase-3免疫荧光共染：
先将视网膜切片在caspase-3一抗中孵育过夜，第二天取出后将荧光二抗与tunel工作液混合孵育1小时。
3)实验结果如附图3a～图3c所示，利用tunel和caspase3染色评估视网膜细胞外核层神经细胞(光感受器细胞)的凋亡情况，发现necrostatin-1可显著减少tunel+和cleavedcaspase3+细胞的数量，证实necrostatin-1减轻或延缓了视网膜光感受器细胞凋亡的进程。
·2.5westernblot检测小鼠视网膜组织程序性坏死蛋白以及炎症因子蛋白表达情况：
1)提取小鼠视网膜蛋白：
处死出生后14天的rd1和c57小鼠，立即于冰上分离视网膜，按每4个视网膜一组加入100ul含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上进行超声破碎(70hz，60s)；再置于4℃离心(13.2万转，10分钟)，提取上清液。
2)bca试剂盒法进行蛋白浓度的测定：
按说明书要求，以50体积试剂a加入1体积试剂b配制新鲜工作液，按每孔200ul计配制量，充分混匀。用超纯水完全溶解、混匀，配置0.5mg/ml的bca蛋白标准品。将标准品按0,2.5,5,10,15,20,25ul依次加入96酶标板标准品孔中，用超纯水加至终体积为25ul。以10倍稀释比(2.5ul样品：22.5μl超纯水)加入25ul蛋白液样品至96孔板样品孔中。所有标准品孔和样品孔中加入200ulbca工作液，混匀后放置于37℃恒温箱孵育30分钟后，利用酶标仪在562nm波长处测定吸光值，再根据标准曲线计算出样品蛋白浓度。
3)配制sds-page聚丙烯酰胺凝胶
a.配制10％、12％分离胶(15ml)，各成份配比如下表1：
表1
b.安装两块bio-rad玻璃板，依次加入上述组分并快速混匀，将配制好的分离胶溶液迅速灌注进玻璃板，留出一定的浓缩胶体积，轻轻沿玻璃体壁缓慢加入一层无水乙醇覆盖于分离胶上，压平并防止胶干燥浓缩。等待约30分钟，确定分离胶凝固后，将乙醇小心倒掉，并灌注5％浓缩胶。配制不同浓度分离胶所需各成份的配比如下表2：
表2
浓缩胶灌注后，立即插入1.5mm样品梳，注意拍出层间气体，等待30分钟浓缩胶凝固，可准备上样或将胶放置于湿盒中4℃保存。
4)进行蛋白电泳
a.蛋白样品准备：
按4：1加入5xsds上样缓冲液于样品中，混匀，沸水浴中加热10分钟，取出置于冰上，短暂离心保存。
b.蛋白电泳：
连接好电泳装置，在第一个泳道加入蛋白预染marker(bio-rad,170kd)作为蛋白分子量标准，按预设顺序依次加入等量样品蛋白液。调节电压80v，当样品从浓缩胶进入分离胶后，调至120v继续电泳，当染料指示剂达到分离胶底部时，取出凝胶进行转膜。
c.电转：
电转液提前预冷。准备2张滤纸和1块适当大小的pvdf膜，浸泡于电转缓冲液中，制作三明治转膜：将电极板黑色面朝下，按从下到上的顺序放置1张浸泡过的滤纸，sds-page凝胶，pvdf膜，注意排除气泡，避免损坏凝胶，对齐后夹紧固定电极板。设定电流强度250ma，根据目标蛋白分子量大小设置转膜时间60-100分钟。
d.封闭：
转膜结束后去除滤纸，小心将pvdf膜用tbst快速洗涤一次，根据需要进行丽春红燃料预染，观察膜上蛋白形态。然后放入封闭液(含5％胎牛血清蛋白的tbst溶液)中，置于缓慢摇动的摇床平台上，室温下孵育1-2小时。
e.抗体孵育：
将pvdf膜取出放入一抗稀释液中，稀释浓度为1:1000，4℃孵育过夜。所用的一抗包括：抗rip1抗体、抗rip3抗体、抗mlkl抗体、抗tnf-α抗体、抗ccl2抗体、抗il-17抗体。第二天取出复温30分钟，用pbst清洗pvdf膜3次，每次10分钟。将pvdf膜转移至二抗稀释液中，稀释度为1:3000，室温下孵育1-1.5小时。pbst溶液洗膜3次，每次10分钟。
f.曝光：
在暗室中操作，依照ecl发光试剂盒说明书进行，新鲜配制发光液(等体积的a液和b液混匀)，加到pvdf膜上，使之充分接触，室温孵育2分钟后，用干净透明的塑料薄膜包裹pvdf膜，覆盖一张胶片，压于暗盒中，大约20秒至1分钟适度曝光。
5)实验结果如附图4a～图4b、附图6c～图6d所示。图4a～图4b显示p14天rd1小鼠视网膜与野生型小鼠相比，程序性坏死相关蛋白rip1、rip3表达升高，给予necrostatin-1治疗后rip1、rip3表达明显下降，给予pbs则无明显变化；图6c～图6d显示p14天rd1小鼠视网膜与野生型小鼠相比，视网膜炎症因子：tnf-α、ccl2、il-17蛋白表达升高，给予necrostatin-1治疗后表达tnf-α、ccl2、il-17明显下降，而注射pbs组无明显变化。
●2.6视网膜铺片免疫荧光染色：
1)将生后14天的rd1及c57小鼠麻醉，脊椎脱臼法处死，小心取出眼球；
2)将眼球置于20倍以上体积的4％pfa中固定30-60min；
3)在解剖显微镜下用有齿镊固定眼球，先去除视神经，在视神经孔处夹住巩膜轻轻撕开，暴露视网膜组织，依次撕开至角膜缘，去除角膜、虹膜、晶状体等组织，获得完整视网膜；
4)将视网膜置于0.5％tritonx-100/pbs中打孔5min，pbs清洗2次；
5)用5％bsa室温封闭1小时或4℃封闭过夜；
6)新鲜配制免疫荧光一抗抗体(iba-1，tnf-α，rip3)：pbst或tbst以1：100比例进行稀释，将视网膜置于抗体中，4℃孵育过夜，期间每隔数小时将ep管轻轻摇晃以充分接触抗体。
7)将视网膜取出孵育二抗，室温1-2小时，注意避光；pbst清洗6次，每次10分钟；
8)将视网膜转移至载玻片上，解剖体视显微镜下用无齿镊去除杂质，并将玻璃体纤维慢慢剥除，以视盘为中心，放射状切开4刀，神经层向上，滴少许抗荧光淬灭封片剂封片，于荧光显微镜或共聚焦显微镜下观察并照相。
9)实验结果如附图5、附图6e所示。图5显示rd1视网膜变性小鼠视网膜小胶质细胞(iba-1标记)与野生型小鼠相比，tunel染色数量明显增加，且细胞高表达rip3，提示小胶质细胞发生了程序性坏死。给予necrostatin-1治疗后tunel细胞数量减少，rip3表达下调，提示necrostatin-1抑制了视网膜小胶质细胞的程序性坏死。图6e显示rd1视网膜变性小鼠视网膜小胶质细胞(iba-1标记)与野生型小鼠相比，高表达rip3和经典炎症因子tnf-α，提示小胶质细胞的程序性坏死释放了炎症介质导致炎症反应；给予necrostatin-1治疗后tnf-α的表达明显减少，证实necrostatin-1有效减轻了炎症因子的分泌释放。
●2.7qpcr检测小鼠视网膜组织中炎症/趋化因子的mrna表达
1)提取视网膜rna和cdna：
将出生后14天的小鼠处死，获取视网膜组织，将每组2-4个视网膜进行分离并放入1mltrizol，吹打至看不见组织碎片，加入200-300ul氯仿，剧烈晃动，室温下静置5-10分钟；4℃离心(13.2万转，15-20分钟)，小心将上层透明上清500-600ul液体转入ep管。加入等体积异丙醇，剧烈晃动后20℃放置1小时以上，离心，弃上清，加入1ml70％乙醇，再次离心后吸出酒精，在通风橱内自然风干。加入30-50uldepc水(根据沉淀的大小)，加depc水后置于冰测a260/280及浓度。使用cdna反转录试剂盒进行cdna反转录；使用sybergreen试剂盒测曲线，依照说明书进行结果分析。
2)qpcr反应体系和循环参数：
引物mixture1ul，基因组1ul，taqdna聚合酶0.5μl，10×buffer5μl，10mmol/ldntps3μl，超纯水补至50ul。预变性94℃5min，94℃30sec，52℃30sec，72℃60sec，共进行50个循环，在72℃延伸7min。取20ul反应产物，进行琼脂糖核酸电泳分析。
3)实验结果如附图6a～6b所示。图6a显示necrostatin-1治疗后rd1变性小鼠视网膜组织的炎症因子tnf-α的mrna表达明显下调。图6b显示necrostatin-1治疗后rd1变性小鼠视网膜组织的趋化因子ccl2的mrna表达明显下调。实验证实necrostatin-1能有效减轻视网膜炎症反应。
●2.8小鼠bv2细胞系培养、鉴定和处理
1)bv-2细胞培养于含10％胎牛血清dmem的高糖培养液中，置于5％co2，37℃培养箱中培养，显微镜下每日观察细胞形态变化。每3天换液一次，细胞铺满皿底时按合适密度传代。
2)将细胞接种于培养瓶中，可用于视网膜小胶质细胞的鉴定，iba-1阳性为小胶质细胞。
3)进行刺激实验时，将bv2细胞种至6孔板，以h2o2(200um)刺激细胞24小时，收集细胞进行进一步实验。
4)进行necrostatin-1治疗时，将bv2细胞预先以necrostatin-1(20um、40um)进行处理2小时，再以h2o2(200um)刺激细胞24小时，收集细胞进行进一步实验。
5)实验结果如附图7a～图7b、图8a～8b所示。westernblot检测发现经h2o2处理的bv2细胞表达程序性坏死蛋白rip1、rip3、mlkl水平增加，提示细胞发生了程序性坏死。预先给予necrostatin-1处理后，细胞表达rip1、rip3、mlkl减少，且40um组比20um组减少更明显(图7a～图7b)。westernblot检测发现经h2o2处理的bv2细胞表达炎症/趋化因子il-17、il-6、ccl2水平增加。预先给予necrostatin-1处理后，细胞表达il-17、il-6、ccl2减少，且40um组比20um组减少更明显(图7a～图8b)。
·2.9实验结果总结
本实验主要得到以下结论：
1)erg、h&e、tunel/caspase-3染色等实验证实，注射necrostatin-1能显著减少视网膜色素变性小鼠神经细胞(光感受器细胞)的丢失，保护视功能。
2)免疫荧光染色、westernblot、pcr等实验证实，注射necrostatin-1能显著抑制视网膜色素变性模型小鼠视网膜小胶质细胞的程序性坏死，减少其分泌促炎因子，减轻神经炎症。
3)westernblot实验证实，necrostatin-1在体外能抑制病理刺激导致的小胶质细胞程序性坏死，并减少炎症因子的释放。
本研究结果为necrotatin-1治疗神经退行性眼病以及necrotatin-1的抗神经验证的潜在临床应用提供实验依据和理论基础，necrostatin-1在制备治疗神经退行性疾病药物制剂中将有广阔的应用前景。