本发明具体涉及腊梅属植物及其提取物在制备预防/治疗由结核杆菌引起相关疾病的药物的应用，所述的腊梅属植物包括柳叶腊梅、浙江腊梅和山腊梅，属于医药技术领域。
背景技术：
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蜡梅属柳叶蜡梅(chimonanthussalicifoliuss.y.hu)、浙江蜡梅(chimonanthuszhejiangensism.c.liu)或山腊梅(chimonanthusnitensoliv.)等为畲族民间习用药,从北宋年间起其干燥叶就作为服用的食凉茶，近千年来用于治疗和预防感冒。现代研究又有进展，其中，山腊梅提取物制备的颗粒制剂，有良好治疗/预防感冒功效，已在市场销售；柳叶蜡梅和浙江腊梅已载入2005和2015年的《浙江省中药炮制规范》，主要成分为挥发油，含有1.8-桉叶素、β-蒎烯、α-萜品烯醇、芳樟烯、榄香醇等40多种成分。传统用途：性味微苦，辛，凉，归肺、脾、胃经，用于治疗感受风寒而引起肚胀、肚痛腹泻，因饮食不当引起的消化不良、腹部胀痛和小儿疳积等症状。
结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)引起的一种慢性致死性疾病，是危害人类健康和导致人类死亡的重大传染性疾病，其致死率仅次于艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome，aids)。由于抗结核药物的大量使用和抗结核作用位点的突变，导致耐多药结核病(multidrug-resistanttuberculosis，mdr-tb)不断出现。2011年全球有870万人罹患tb，并有140万人死亡(其中非艾滋病患者约100万)。我国是全球22个tb流行最严重的国家之一，据2010年全国第五次结核病流行病学调查估计年发病人数为130万，占全球新发病人数的14.3％，是全球第二大结核病高负担国家。
目前结核病的治疗周期较长，患者顺应性较差。一线抗结核药物和二线抗结核药物在临床上广泛使用，出现耐多药结核杆菌，不能达到有效控制结核病。中药的资源丰富、治疗时重视整体协同、毒副作用小以及不易产生耐药等特点和优势,使得抗结核中药在日益严峻的结核治疗方面展现出了越来越光明的应用前景。
检索药理研究信息，未见柳叶蜡梅、浙江腊梅和山腊梅抗结核菌的研究报道。在研究过程中发现腊梅的提取物对结核杆菌有很好的抗菌活性。腊梅提取物多为简单的水提、醇提和水蒸气蒸馏所得，仅见贺建云采用超临界co2不加夹带剂提取柳叶蜡梅中的物质，因其具有低温、快速、效率高、无污染、提取物纯度高、易分离等优点，适用于挥发油的提取。
本发明是研究腊梅提取物的制备方法和蜡梅提取物用于结核杆菌感染的治疗、预防，并且研究适合其提取物的喷雾剂、吸入剂、软胶囊、滴丸等制剂类型。
技术实现要素：
发明概述
本发明要解决的技术问题是提供一种新的抗结核杆菌的药物，具体而言，本发明提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备抗结核杆菌的药物中的应用。
所述的腊梅科腊梅属植物包括：柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅。
在本发明的具体实施方案中，所述的提取物为以下一种或多种：(1)水提物；(2)醇水混合提取物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳萃取。
本发明第二方面提供了上述腊梅属植物提取物的制备方法。
本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的口服制剂。
发明详述
本发明第一方面提供了一种腊梅属植物、腊梅属植物提取物在制备抗结核杆菌的药物中的应用。
本发明中所述的药材或原药材是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。本发明中所述的生药也是指腊梅属植物，具体包括柳叶腊梅、浙江腊梅、山腊梅。
本发明的腊梅属植物包括腊梅属植物的鲜品或干品；腊梅属植物的药用部位选自腊梅属植物的全株、地上部分、地下部分、茎、茎皮、花、叶、种子或任意组合；优选的药用部位选自腊梅属植物的地上部分、茎、茎皮、叶或任意组合；更优选的药用部位选自腊梅属植物的茎或叶；最优选的药用部位选自腊梅属植物的叶。
本发明的第二方面提供了腊梅属植物提取物的制备方法。
在本发明的具体实施方案中，所述的中药提取物为以下用水提、醇提、水蒸气蒸馏及超临界二氧化碳提取一种或多种：(1)水提物；(2)醇提物；(3)水蒸气蒸馏挥发油；(4)超临界二氧化碳提取物。
为了加快提取速度，提高提取收率，可以对腊梅属原药材进行粉碎，粉碎后的平均粒径优选10-80目，更优先是20-65目，最优选是30-50目。
本发明提供的提取物的第一种制备方法：
所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材腊梅属植物加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
所述的溶剂：本领域常用的溶剂均可以用于本发明。优选溶剂水和c1-c5的醇类。c1-c5的醇类选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或其混合物。选自水、无水乙醇、乙醇水溶液；更优选溶剂选自乙醇水溶液。乙醇或乙醇水溶液和其他溶剂相比，具有低毒，防腐，污染小，价格低等优点，更适合于本发明应于用医药工业化大生产。
乙醇水溶液的浓度(乙醇水溶液中含有的乙醇的体积百分比)：优选30％-100％的乙醇水溶液，更优选50％-95％的乙醇水溶液，最优选60％-80％的乙醇水溶液，，最优选75％的乙醇水溶液。
溶剂的量是指提取每公斤原药材所用的溶剂量，即提取每公斤药材计使用溶剂的重量(单位kg)或体积(单位l)。溶剂用量是原药材用量的2-30倍；更优选5-16倍；进一步优选6-15倍；最优选8-10倍。
提取的温度：优选是室温到溶剂回流的温度；更优选是40℃-溶剂回流的温度；进一步优选是50℃-溶剂回流的温度；最优选是溶剂回流的温度。
提取的次数：可以是1～5次；优选是2～3次。
提取的时间：每次0.5～5小时；优选每次0.5～3小时；更优选每次1～3小时。
浓缩的温度：可以是55～90：；优选62～80优；更优选65～75以。
浓缩后稠膏的相对密度为1.1～1.5，优选1.2～1.4。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-16倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-16倍的水提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经乙醇提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经3-30倍的65％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经5-15倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的30％-100％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的50％-95％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是柳叶腊梅或浙江腊梅或山腊梅经8-10倍的60％-80％的乙醇水溶液提取并获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并浓缩滤液，干燥获得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加入5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的水、无水乙醇、乙醇水溶液煎煮和/或回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，经浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。
在本发明的一个具体实施方案中，所述提取物是按照包括如下步骤制备：原药材加5～30倍(包括5～15倍，包括6～16倍)的30～99％的乙醇水溶液回流提取1～5次(包括2～3次)，每次0.5～5小时(包括0.5～3小时，包括1～3小时)，过滤并合并提取液，60～90℃(包括65～75))浓缩至相对密度为1.1～1.5(包括1.2～1.4)的稠膏，减压干燥，即得。
本发明提供的提取物的第二种制备方法：所述提取物是原药材腊梅属植物经水蒸气蒸馏并获得的水蒸气蒸馏挥发油。
本发明提供的提取物的第三种制备方法：所述提取物是原药材经超临界二氧化碳提取并获得。
本发明的超临界提取物，其特征在于，所述提取物是原药材腊梅属植物经二氧化碳超临界提取，在分离釜中获得提取物，提取的条件可以是一种或多种，例如：
(1)不加夹带剂的提取物；
(2)加夹带剂的提取物；
(3)不加夹带剂提取后再加夹带剂的提取物。
超临界二氧化碳提取的条件如下：
萃取釜:
萃取温度为30-70℃；优选为35-60℃；更优选为40-50℃；最优选43-47℃。萃取温度可以选自40℃，42℃，45℃，47℃，50℃。
萃取压力为10-40mpa；优选为13-35mpa；优选为16-24mpa；更优选为18-22mpa。萃取压力可以选自15mpa，20mpa，20.6mpa，29.6mpa，30mpa。
萃取釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个萃取釜的，可以是并联或串联。为了尽量节约原药材的加料和卸料时间，提高生产效率，优选是多个萃取釜并联。在一部分萃取釜加料或卸料的时候，另外的萃取釜同事进行萃取。
萃取剂流速：
萃取剂二氧化碳的流速会对本发明的生产效率产生重大的影响。如果二氧化碳的流速过快，二氧化碳和萃取溶质不能充分接触，会降低每体积二氧化碳的萃取效率；如果二氧化碳的流速过慢，会降低单位时间的生产效率。因此，萃取剂二氧化碳的流速需要一个合适的流速。
萃取剂二氧化碳的流速为每公斤药材每小时20-150升(以每公斤药材每小时计，单位为l/h·kg生药)，即20-150l/h·kg；优选的萃取剂二氧化碳的流速为23-125l/h·kg；更优选为33-80l/h·kg；进一步优选为50-70l/h·kg；最优选为55-65l/h·kg。
萃取剂二氧化碳的流速可以选自23.1l/h·kg；23.8l/h·kg；28.5l/h·kg；32.3l/h·kg；32.8l/h·kg；36.2l/h·kg；38.3l/h·kg；35.3l/h·kg；44.8l/h·kg；50.7l/h·kg；55.4l/h·kg；75.6l/h·kg；82.2l/h·kg。
萃取时间分钟(min)：30-400min，优选120-160min，更优选120-160min，最优选120-160min。萃取时间可以是60-70min，70-80min，80-100min，110-120min，120-130min，140-150min，155-165min。例如萃取时间可以是62min，70min，83min，100min，120min，132min，145min，160min。
夹带剂:
本发明的超临界提取方案中，可以选择性的使用夹带剂或不使用夹带剂；优先是使用夹带剂。
本领域常用的溶剂均可以作为本发明的夹带剂。例如本发明的夹带剂可以选自：0％-100％v/v的乙醇水溶液、甲醇，乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。本文中100％v/v的乙醇水溶液表示无水乙醇；本文中0％v/v的乙醇水溶液表示没有醇的水。例如本发明的夹带剂可以选自：水、无水乙醇、30％-100％v/v的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮。优选的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％v/v的乙醇水溶液。更优选的夹带剂选自75％-95％v/v的乙醇水溶液。最优选的夹带剂选自95％v/v的乙醇水溶液。
夹带剂的量(以每公斤药材计为l/kg，kg/kg；或以每克药材计为ml/g，g/g)：
夹带剂的量为0.10-2.5l/kg；；优选0.20-1.5l/kg；，更优选0.30-0.80l/kg；最优选0.40-0.60l/kg；
分离釜：
分离釜的温度为25-70℃，优选为30-60℃；更优选为35-55℃，最优选为40-50℃，。
分离釜的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃，41℃，42℃，43℃，44℃，45℃，46℃，47℃，48℃，49℃，50℃，51℃，52℃，53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。
分离釜的压力为2-17mpa；优选为3-15mpa；更优选为4-12mpa；最优选为4.5-10mpa。
分离釜的压力可以选自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa，5.6mpa，5.7mpa，5.8mpa，6mpa，7mpa，8mpa，8.5mpa，9mpa，9.5mpa，10mpa。
分离釜可以是1个或多个分离釜，例如1个，2个，3个，4个，5个或更多。如果是多个分离釜的，可以是并联或串联，为了尽量提高提取物的回收率，优选是多个分离釜串联。
分离釜i压力和温度：
分离釜i的温度为30-70℃，优选为50-60℃；更优选为53-57℃；最优选为55℃。分离釜i的温度可以选自53℃，54℃，55℃，56℃，57℃。
分离釜i的压力为4-17mpa；优选为5-15mpa；更优选为6-12mpa；最优选为8-10mpa。分离釜i的压力可以选自8mpa，8.5mpa，9mpa，9.5mpa，10mpa。
分离釜ii压力和温度：
分离釜ii的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜ii的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。
分离釜ii的压力为2-8mpa；优选为3-7mpa；更优选为4-6mpa；最优选为4.5-5.5mpa。分离釜ii的压力可以选自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa。
分离iii压力和温度：
分离釜iii的温度为25-50℃，优选为30-45℃；更优选为32-42℃；最优选为35-40℃。分离釜iii的温度可以选自35℃，36℃，37℃，38℃，39℃，40℃。
分离釜iii的压力为2-8mpa；优选为3-7mpa；更优选为4-6mpa；最优选为4.5-5.5mpa。分离釜iii的压力可以选自4.65mpa，4.9mpa，5.1mpa，5.2mpa，5.3mpa，5.4mpa，5.5mpa。
分离釜中的得到的提取物，就是本发明的腊梅属植物提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材不加夹带剂的进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15mpa-40mpa，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，分离釜i的温度为50℃-60℃，压力为7.5mpa-9mpa，分离釜ii的温度为35℃-45℃，压力为4.8mpa-6mpa，分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材加夹带剂进行超临界提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15mpa-40mpa,加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250kg/小时，萃取时间为90-300分钟，分离釜i的温度为50℃-60℃，压力为7.5mpa-9mpa，分离釜ii的温度为35℃-45℃，压力为4.8mpa-6mpa；分离釜中的得到的提取物即为本发明的提取物。
所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。
在本发明的一个具体实施方案中，是对原药材先不加夹带剂进行超临界提取后再加夹带剂的进行提取，原药材加入萃取釜，萃取釜温度为40℃-50℃，压力为15mpa-40mpa，分离釜i的温度为50℃-60℃，压力为7.5mpa-9mpa，分离釜ii的温度为35℃-45℃，压力为4.8mpa-6mpa；二氧化碳气体通过萃取釜的流量为100-250l/h·kg，萃取时间为90-300分钟；放出分离釜中的提取物；再加入夹带剂，二氧化碳气体通过萃取釜的保持流量为100-250l/h·kg，再萃取90-300分钟；分离釜中再次得到的提取物即为本发明的提取物。
所述的夹带剂选自水、无水乙醇、30％-99％的乙醇水溶液、乙酸乙酯、丙酮等中至少一种，即作为带剂的溶剂可以是单一溶剂，或其中任何一种溶剂与另一种、及多种溶剂间的彼此混合溶剂等。
本领域常用的干燥均可以用于本发明，例如：减压干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、热风干燥、远红外线干燥或微波干燥。或联合使用上述一种或多种干燥方式。
本发明提供的提取物的第四种制备方法：所述提取物是原药材经二氧化碳超临界提取后，其剩余的药材再加入溶剂提取，过滤并浓缩滤液，干燥获得。具体的提取方法可以第一种方式相同。
在本发明中，术语“提取”可以是常温下的浸渍，或者超临界状态下的提取，或者在升高的温度下的提取(例如煎煮和/或回流)，或者这些操作方式的结合。还可以进一步包括对提取物进行进一步处理，例如进一步纯化，例如除溶剂、沉淀除杂质、溶剂萃取、树脂吸附分离等。
如本文所述的，术语“提取物”将包括可用于实现本发明任何目的的任何纯度的提取物，提取物的提取纯度可以在较大的范围内变化。
本发明第三方面公开含有腊梅属植物提取物的制剂，所述的药物与药学上接受的辅料制成药剂学上接受的口服制剂。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂为柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅的提取物制剂。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述的制剂的组合物还包含一种或多种无毒生理学可接受的载体。所述的可接受的载体包括本领域公知的任何辅料及起控释作用的辅料。常用的辅料包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、致孔剂、增塑剂、填充剂、增溶剂和乳化剂。稀释剂可以是但不限于淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是但不限于水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是但不限于干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是但不限于滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇；增溶剂和乳化剂可以是但不限于乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。起缓控释作用的辅料可以选自亲水性凝胶材料、蜡脂类材料和不溶性材料的一种或多种。所述的亲水性凝胶材料可以选自羟丙基甲基纤维素、卡波普、羧甲基纤维素钠和海藻酸盐，所述的蜡脂类材料可以选自十六醇、十八醇、蜂蜡、山嵛酸甘油酯、硬脂酸和巴西棕榈蜡，所述的不溶性材料可以选自乙基纤维素、丙烯酸树脂、聚氧乙烯和聚乙烯。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，可向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂包含柳叶蜡梅或浙江腊梅或山腊梅的提取物和药学上可接受的载体制成的制剂。可通过将组合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。该制剂可根据本领域公知的方法制备。
本发明第三方面的制剂，其特征在于，所述制剂优选口服制剂、喷雾剂、吸入剂；更优选喷雾剂、吸入剂。
有益技术效果
柳叶蜡梅超临界加夹带剂萃取物(lylj)、柳叶蜡梅超临界不加夹带剂萃取物(lylw)、柳叶腊梅挥发油(lyy)、浙江腊梅挥发油(zyy)和山腊梅挥发油(syy)对结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)的最低抑菌浓度分别为0.312mg/ml、0.632mg/ml、1.169mg/ml、0.625mg/ml、0.625mg/ml,抑制效果显著。
本发明提取物抗结核杆菌抗效果强度顺序分别是：(1)超临界加夹带剂萃取物(lylj)>(2)超临界不加夹带剂萃取物(lylw)>(3)挥发油(lyy)>(4)醇提物>(5)水提物。
具体实施方式
提取物制备例
实施例1-11
水提：取粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加水回流提取。第一次加10-16倍水倍水，提取1小时后过滤，第二次加水8-12倍，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩或水浴锅上浓缩，水浴75℃、转速80rpm,浓缩至比重为1.18－1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。
醇提：取粉碎后药材，装入圆底烧瓶中，分两次加乙醇回流提取。第一次加10倍乙醇，提取1小时后过滤，第二次加乙醇8倍，提取1小时，合并两次滤液。旋转蒸发仪上浓缩，水浴65℃、转速80rpm,浓缩至比重为1.18－1.22时，倾倒入不锈钢盘中置减压干燥烘箱65℃，真空烘干后粉碎。
挥发油：水提时，装好挥发油提取器，待油产生后收集。柳叶蜡梅提取的挥发油编号lyy，浙江腊梅提取的挥发油编号zyy，山腊梅提取的挥发油编号syy。
详细参数及结果如下：
实施例12(超临界不加夹带剂)
称取6.4kgly，置于24l萃取釜中。称取3.2kg95％乙醇，放置于副泵的储箱中，开启副泵(r＝9.1r/min),60min内加夹带剂结束。萃取釜ii、分离釜i、分离釜ii、分离釜iii的压力分别为20.7mpa、8.5mpa、5mpa、5mpa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速r＝30.5r/min，二氧化碳流速为220-240l/h。萃取135min，后处理后，分离釜i收集到1.3g产品，分离釜ii收集到产物200.4g，编号lylj-2(2-6)，总收率3.15％。
实施例13(超临界不加夹带剂)
称取6.5kgly，置于24l萃取釜中。压力稳定后，萃取开始。萃取釜ii、分离釜i、分离釜ii、分离釜iii的压力分别为20mpa、8mpa、5mpa、5mpa，温度分别为45℃、55℃、40℃、40℃，主泵的转速r＝30.5r/min，二氧化碳流速为210-230l/h，萃取103min，后处理后，收集到红褐色油状物101g,收率2.05％，编号lylw(2-2)。
实施例14
在实施例13的基础上，开启副泵(r＝15.5r/min)，15min加入1.55kg95％乙醇，萃取110min，后处理后，分离釜i收集到产物113.6g，编号lylwj-1(2-3)，分离釜ii收集到产物25.1g，编号lylwj-2(2-3)，收率共2.29％。
药理实验
实验例1抗结核菌筛选
1材料
1.1药物
1.1.1受试样品
表1.各个药物配制浓度
样品用二甲基亚砜(dmso)配成母液并稀释成工作溶液备用。贮存温度：4℃。
1.1.2.阳性对照：利福平(简称：rif)。失效日期，2017.11；批号，r0808；amresco公司产品；纯度＞95％(hplc)；红色粉末状；贮存温度：-20℃。
1.1.3.阴性对照：溶剂二甲亚砜(dmso)。贮存温度：常温。
1.2菌种：本实验室制备的无毒力自主发光标准结核菌autoluminescenth37ra(简称alra)。
1.3核心仪器：glomax2020发光检测仪：美国promega公司；生化培养箱(lrh-70)：上海恒科；台式恒温振荡器(thz-d)：太仓市实验设备厂；电子天平(je3002)：上海浦春仪器公司。
2方法与结果
2.1方法：37℃培养alra菌液至对数期。用7h9培养基稀释菌液，使发光值在15000-25000rlu/ml之间。取稀释后的菌液195ul与稀释后的药液5ul混合，每药物每个浓度设2-3重复，并设置阳性对照(rif：终浓度1ug/ml)和阴性对照(dmso)。阴性空白对照的发光值作为第0天的发光值，之后每天检测样品发光值1次，共检测3天。
第3天平均发光值达到阴性空白对照组发光值一半以下的最低浓度为这个样品的ic50(ug/ml)；第3天抑制90％菌的生长的浓度为该样品的mic(ug/ml)。
2.2结果：如表2所示：
表2.各个药物的mic和ic50值