一种皱褶石墨烯微球在光热治疗中的应用的制作方法

本发明属于光热治疗的应用领域，特别涉及一种皱褶石墨烯微球在光热治疗中的应用。

背景技术：

长期食用有毒物质易导致癌症发病率提高。目前治疗手段主要有化学治疗、手术治疗和放射治疗。化疗是利用化学药物阻止癌细胞的增殖、浸润、转移，直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方式，但其选择性不强，在杀灭癌细胞的同时也会不可避免地损伤人体正常细胞，使患者出现不良反应；手术治疗只能针对早期癌细胞尚未扩散的患者，对于肿瘤细胞已经转移的病人手术治疗通常无法根治，且对病人造成二次伤害；放射治疗利用x射线、电子线等对发病部位照射，但对于已经转移的癌细胞作用有限。光热治疗(ptt)作为较安全的新型肿瘤治疗方法受到了广泛关注。其中，纳米材料的性能决定了光热治疗的效果。

石墨烯（graphene，rgo），是一种由碳原子以sp2杂化轨道组成的六角型呈蜂巢晶格的新型二维平面材料，特殊的单原子层结构决定了其丰富和新奇的物理性质。导热系数高达5300w/m•k，常温下其电子迁移率超过15000cm2/v•s，零载流子浓度极限下具有最小量子电导率，具有分数量子霍尔效应和铁磁性，石墨烯还是目前世界上已知材料中最薄的，厚度只有0.335nm。石墨烯与金纳米粒子和碳纳米管等碳材料相比，具有体积小、光热效率良好和成本低的优势。但是常规的片层石墨烯易团聚、使其不易进入细胞内部，并且氧化石墨烯是片层结构，其锋利的边缘部位可以刺破细胞，对正常细胞具有一定的副作用。另外，其光热转换效率也非常有限。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种皱褶石墨烯微球在光热治疗中的应用，本发明中载体材料具有很好的生物相容性和良好的光热转换能力，可以很好的结合光热治疗和化疗，在增大对肿瘤细胞杀伤力的同时，也可以较好的减少对正常细胞的毒副作用。

本发明的一种皱褶石墨烯微球在光热治疗中的应用，包括：

（1）不同浓度的材料光热转换能力：配制不同浓度的皱褶石墨烯微球的水溶液，用近红外激光照射一定时间，溶液的温度变化利用红外热成像仪进行温度记录，得到溶液在不同时间激光照射下的升温曲线；

（2）不同光照强度的材料光热转化能力：使用不同强度的激光进行照射一定浓度的皱褶石墨烯微球水溶液，得到溶液在不同时间激光照射下的升温曲线；

（3）材料的光热稳定性：测试一定浓度的皱褶石墨烯微球的水溶液在一定激光强度的照射下，照射一定时间，连续多次开关照射条件下的升温降温循环曲线；

（4）材料的生物毒性：通过mtt实验来检测培养不同浓度的皱褶石墨烯微球的细胞毒性；

（5）材料对肿瘤细胞的光热治疗效果：通过检测空白对照磷酸缓冲液、抗癌药物阿霉素、皱褶石墨烯球微球、激光照射的皱褶石墨烯微球对人宫颈癌细胞的存活率来评价材料的抗肿瘤治疗的光热效果。

所述步骤（1）中，配置的系列浓度为0~250μg/ml，激光近红外波长在800~900nm，激光强度为0~3瓦/平方厘米，照射时间0~8分钟。

所述步骤（2）中，材料的浓度为100~250μg/ml，激光近红外波长在800~900nm，激光强度为0~3瓦/平方厘米，照射时间0~8分钟。

所述步骤（3）中，材料的浓度为100~250μg/ml，激光近红外波长在800~900nm，激光强度为0~3瓦/平方厘米，照射时间0~8分钟。

所述步骤（3）中，连续开关次数为3-10次。

所述步骤（4）中，测试不同浓度的3-8个样品的生物毒性，浓度范围为0~40μg/ml。

所述步骤（5）中，磷酸缓冲溶液的ph酯为7.4，抗癌药物阿霉素的浓度为0~5um，皱褶石墨烯球的浓度为0~5um。

所述步骤（5）中，激光照射的激光近红外波长在800~900nm，激光强度为0~3瓦/平方厘米，照射时间0~8分钟。

有益效果

（1）本发明提供了皱褶石墨烯球的一种新用途，可应用于光热治疗制剂，克服了片层石墨烯的缺点，分散性好；

（2）本发明的皱褶石墨烯微球应用光热治疗，具有较低的生物毒性、光热稳定性和高的光热转换效率。

附图说明

图1为不同浓度的皱褶石墨烯微球的光热曲线；

图2为不同光照强度的皱褶石墨烯微球的光热曲线；

图3为皱褶石墨烯球材料的光热稳定性分析；

图4为皱褶石墨烯球材料的细胞毒性测试；

图5为皱褶石墨烯球材料对肿瘤细胞的光热治疗效果测试。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

皱褶石墨烯微球的制备，包括如下步骤：

首先配制质量浓度为6wt%的氧化石墨烯（go）溶液，在室温下搅拌10h，转速为1100r/min，使固态go充分分散；将所得溶液放入超声清洗机中，超声波振荡8小时后，得到棕色透明的go分散液。将上述溶液置于连接有石英管的超声雾化器内，所述石英管的一端连接超声雾化器，另一端连接真空抽滤装置的过滤器，所述的真空抽滤装置包括过滤器，过滤器中设有ptfe滤膜，过滤器连接抽滤真空泵。在超声波频率为2.0mhz的条件下使其超声雾化成气溶胶液滴，在雾化器气流和抽滤真空泵驱动下通过加热到400℃的石英管后，用孔径为0.22μmptfe滤膜收集，室温下干燥3h，然后放入真空干燥器中60℃干燥24h后，即得皱褶石墨烯微球，制备的微球粒径在750±20nm。

实施例2

不同浓度的材料的光热转换性能测试，包括如下步骤：

配制不同浓度的皱褶石墨烯球（crumpled-rgo）水溶液3ml，溶液的浓度分别为：200、100、50、25μg/ml，并以200μg/ml氧化石墨烯水溶液（go）和超纯水作为对照。将不同浓度的材料水溶液装入1.5ml离心管中，用功率密度为1瓦/平方厘米、波长为808nm的激光照射5min，溶液的温度变化利用红外热成像仪进行温度记录，最终可以得到溶液在激光照射下的升温曲线，见图1。从图1可以看出：溶液的升温程度与溶液浓度成正比，浓度越高，温度升的越高，浓度为200μg/ml的crumpled-rgo溶液温度达到了65℃以上；同样的照射条件下，25μg/ml的crumpled-rgo溶液温度高于对比溶液：200μg/ml的go溶液，主要原因是高温还原使得石墨烯结构发生改变，其在近红外区的吸光能力有所增强；同时，我们还发现超纯水在激光照射下温度变化不明显，主要原因是水中缺少光热试剂，水很难将激光能量转化成热能。以上数据显示了crumpled-rgo可以用作为一个新型的光热转换效率极高的光热材料。

实施例3

不同光照强度对材料的光热转换性能测试，包括如下步骤：

配制了200μg/ml浓度的皱褶石墨烯球（crumpled-rgo）水溶液10ml，使用不同强度的激光进行照射，激光强度分别为：0.5、1、1.5、2瓦/平方厘米。利用波长为808nm的激光照射5min，溶液的温度变化利用红外热成像仪进行温度记录，最终可以得到溶液在激光照射下的升温曲线，见图2。如图2所示，发现升温程度与激光强度成正比，所照射的激光强度越高，温度升的越高；对于200μg/ml的crumpled-rgo溶液，当光照强度为0.5瓦/平方厘米时，温度只达到40℃左右，当光照强度为2.0瓦/平方厘米时，温度立马升到80℃以上，暗示了该材料具有优越的光热效能。

实施例4

材料的光热稳定性测试，包括如下步骤：

配制浓度为200μg/ml的材料水溶液10ml，利用波长为808nm的激光照射5min，激光强度为1瓦/平方厘米，测得连续5次开关照射条件下的升温降温循环曲线，材料的光热稳定性曲线见图3。从图3可以看出，每次升温降温程度都基本相同，暗示了材料具有良好的光热稳定性。

实施例5

材料的生物毒性测试，包括如下步骤：

小心地从液氮罐中取出冻存的l929细胞，迅速放入37℃水浴锅快速溶解后移入离心管，加入1ml新鲜dmem（含1%双抗和10%胎牛血清）培养基，吹打均匀，1000rpm转速下离心5min。每个培养瓶添加1ml细胞液，并添加4ml新鲜培养液，酒精擦拭后放入培养箱（含5%二氧化碳，温度在37℃）培养。当在显微镜下观察到贴壁细胞长满培养瓶底部面积90%左右就应该对细胞进行分瓶，用移液管小心吸去上部发黄的培养液，注意不要碰到底部，用2-3mlpbs轻轻冲洗细胞瓶2次并倒掉，去掉残余血清和死细胞，吸取1.0ml胰酶加入培养瓶，对细胞静置消化1min，快速吸取2ml新鲜培养液加入细胞培养瓶终止消化，使用移液枪进行吹打，是贴附在瓶壁上的细胞全部脱离。在每个新的培养瓶添加1ml细胞液，并添加4ml新鲜培养液，新培养瓶做好标记，酒精擦拭后放入培养箱培养，直到细胞量够下步实验所用。

为了检测皱褶石墨烯球（crumpled-rgo）材料本身的细胞毒性，进行mtt实验。当细胞生长到对数期时，利用血球计数板对细胞进行计数，将细胞添加到96孔细胞培养板，使每孔体积200μl，细胞个数为10000个，于co2培养箱中培养24h。当细胞贴壁完全后吸除培养液，加入含有不同浓度的crumpled-rgo的20μl的无菌pbs溶液（分别为5μg/ml，10μg/ml，20μg/ml，40μg/ml），对照组添加20μlpbs溶液作对照，并补足180μl新鲜培养基，使每孔培养液的总体积仍为200μl，放入培养箱中孵育。分别在培养24h、48h和72h时，移去孔板中的培养液，每孔添加20μlw=0.5%的mtt溶液，在培养箱中避光中培养4h后吸去溶液，每孔添加200μldmso溶液，在转速90rpm摇床上避光振荡30min，使结晶物充分溶解，使用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔溶液的紫外吸收值。对照试验用同体积培养基作为参比。细胞毒性实验结果见图4。

从图4可以发现，当培养细胞24h培养液时，添加材料的细胞相对数略高于以pbs缓冲液对照处理的细胞数，主要原因是材料基质为碳，补充了细胞生长所需要的碳元素，有利于细胞生长。随着培养时间的延长和材料浓度的增加，细胞数量逐渐减少，但与对照组的细胞数目基本相同，没有显示出对细胞的杀伤作用，细胞数目的减少可能与培养液中营养的消耗有关。以上实验结果表明，制备的crumpled-rgo对细胞无明显毒性。

实施例6

材料对肿瘤细胞的光热治疗效果，包括如下步骤：

为了检测crumpled-rgo材料的光热效能，使用生长到对数期的人宫颈癌细胞（hela）细胞，利用血球计数板对细胞进行计数，将细胞添加到96孔细胞培养板，使每孔体积200μl，细胞个数为10000个，于co2培养箱中培养24h。当细胞贴壁完全后吸除培养液，每孔分别加入200µl含不同浓度的dox（分别为0.5µm，1µm，2µm，4µm）和crumpled-rgo（0.5µm，1µm，2µm，4µm）的新鲜培养液，培养箱中孵育。培养24h后，每孔用功率密度为1w/cm2、波长为808nm的激光照射5min，并设置添加crumpled-rgo而不经光照的对照组。照射完毕后移去孔板中的培养液，每孔添加20μlw=0.5%的mtt溶液，在培养箱中避光中培养4h后吸去溶液，每孔添加200μldmso溶液，在转速90rpm摇床上避光振荡30min，使结晶物充分溶解，使用酶联免疫检测仪在570nm处测定各孔溶液的紫外吸收值。实验均以pbs处理的细胞作对照组，每组设置3个平行样。通过检测hela细胞的存活率，来进行判断crumpled-rgo材料光热治疗效果，结果见图5。

从图5可以发现，与对照组相比，crumpled-rgo材料对细胞有一定的杀伤作用，并且随着crumpled-rgo浓度的增大而增大。在未进行近红外光nir照射时，crumpled-rgo材料几乎对癌细胞增殖没有任何影响。当进行光照近红外光(nir)照5分钟后，含crumpled-rgo材料的细胞数目迅速减少，并且随着材料浓度的增大而增大，当材料添加量为4µm时，细胞的存活率只有60%，与纯的抗癌药物阿霉素(dox)几乎具有相同的治疗效果，以上实验结果表明，皱褶石墨烯球对肿瘤细胞具有良好的杀伤作用，是一种良好的光热治疗试剂。