大蒜提取物的应用和应用其的产品的制作方法

本发明涉及医药技术领域，尤其是涉及一种大蒜提取物的应用和应用其的产品。

背景技术：

癌症是一大类恶性肿瘤的统称。癌细胞的特点是无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗。并且，癌细胞通过释放出多种毒素，会使人体产生一系列症状。同时，癌细胞还可转移到全身各处生长增殖，导致人体消瘦、无力、贫血、食欲不振、发热以及严重的脏器功能受损等等。

其中，肝细胞癌(hcc)是最常见的原发性肝癌肿瘤，是全球癌症死亡的主要原因。它的发展与多种因素和条件有关，包括慢性乙型肝炎、丙型肝炎、病毒感染，慢性摄入酒精、食物中的致癌物质或者肝硬化。目前，治疗肝癌最常用的方法是综合治疗，即中西医结合治疗手术、放疗、化疗及中医药化疗。

顺铂(ddp)是一种最广泛抗肿瘤药物，免疫印迹分析显示，顺铂可下调抗凋亡蛋白bcl-2并且上调促凋亡蛋白bax。然而，因为其耐药性和毒副作用，如肾毒性、外周神经毒性和耳毒性等副作用，给病人带来极大痛苦，且对病人机体的免疫系统损伤也较大，致使顺铂的使用受到严重限制，导致其在非特异性全身器官和肿瘤内的浓度与分布均不足，达不到治疗疾病的最优药物浓度。

多糖是大分子碳水化合物，不仅在生物体的生长发育中发挥了重要作用，也是重要的生物反应调节剂。近年来，许多多糖已从自然资源中分离出来，他们在抗击癌症中起着重要作用，具有广泛的生物学特性。大蒜提取物中的大蒜多糖(gps)是liliaceae家族的大蒜的主要活性成分。作为一种杂多糖，大蒜多糖由果聚糖和少量的葡萄糖组成。研究表明大蒜多糖具有多种活性，如强抗氧化，抗病毒，保护角质层抗紫外线，保护肝脏和增强免疫活性等。

因此，开发一种毒副作用小，抑制肿瘤生长同时能够诱导早期肿瘤细胞凋亡的有效的抗肝癌药物尤为重要。目前，利用大蒜提取物作为低毒高效的辅助抗肿瘤候选药物尚未见报道。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供大蒜提取物在制备降低化疗药物毒副作用的产品中的应用；

本发明的第二个目的在于提供一种用于降低化疗药物毒副作用的药物；

本发明的第三个目的在于提供一种大蒜提取物在制备抗肿瘤的产品中的应用；以缓解现有技术中存在的化疗药物毒副作用大，尚未发现低毒高效的辅助抗肿瘤的候选药物的技术问题。

本发明提供了一种大蒜提取物的应用，所述应用包括所述大蒜提取物在制备降低化疗药物毒副作用的产品中的应用和在制备抗肿瘤的产品中的应用。

进一步地，所述大蒜提取物为大蒜多糖。

进一步地，所述毒副作用包括肾毒性、耳毒性和神经毒性中的一种或多种。

进一步地，所述产品为药物。

进一步地，所述肿瘤为肝癌。

进一步地，所述肝癌包括单纯型、硬化型和炎症型中的一种或多种。

本发明还提供了一种用于降低化疗药物毒副作用的药物，所述药物包括上述的大蒜提取物。

另外，本发明还提供了一种用于抗肿瘤的药物，所述药物包括上述的大蒜提取物。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

进一步地，所述化疗药物为顺铂。

本发明提供的大蒜提取物，通过实验发现能够表现一定的抗肿瘤活性，通过应用由大蒜提取物制备的产品，能够起到抗肿瘤的作用；同时，将大蒜提取物联合化疗药物共同作用于肿瘤细胞，能够通过缩短作用时间，降低化疗药物使用量，降低其毒副作用；并且，大蒜为食药两用植物，应用大蒜作为辅助抗肿瘤的药物，在能够降低化疗药物毒副作用的同时，不产生其他不良反应，用药更安全。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的应用q-sepharose阴离子交换层析柱测得的洗脱曲线结果图；

图2为本发明实施例2提供的应用sephadexg-50凝胶渗透色谱柱测得的洗脱曲线结果图；

图3为本发明实施例5提供的大蒜多糖和顺铂对hepg2细胞增殖的抑制作用的结果图；

图4a为本发明实施例6提供的空白对照组细胞用hoechst33342染色后倒置荧光显微镜观察结果图；

图4b为本发明实施例6提供的1mg/ml大蒜多糖组细胞用hoechst33342染色后倒置荧光显微镜观察结果图；

图4c为本发明实施例6提供的1mg/ml大蒜多糖与5μg/ml顺铂共同作用组细胞用hoechst33342染色后倒置荧光显微镜观察结果图；

图5a为本发明实施例7提供的空白对照组hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5b为本发明实施例7提供的单独应用0.5μg/ml顺铂作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5c为本发明实施例7提供的单独应用0.25mg/ml大蒜多糖作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5d为本发明实施例7提供的联合应用0.25mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5e为本发明实施例7提供的单独应用0.5mg/ml大蒜多糖作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5f为本发明实施例7提供的联合应用0.5mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5g为本发明实施例7提供的单独应用1.0mg/ml大蒜多糖作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图5h为本发明实施例7提供的联合应用1.0mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂作用48小时hepg2细胞株细胞周期相分布结果图；

图6a为本发明实施例8提供的空白对照组hepg2细胞株细胞凋亡情况结果图；

图6b为本发明实施例8提供的单独应用0.5μg/ml顺铂作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6c为本发明实施例8提供的单独应用5μg/ml顺铂作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6d为本发明实施例8提供的单独应用0.25mg/ml大蒜多糖作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6e为本发明实施例8提供的单独应用0.5mg/ml大蒜多糖作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6f为本发明实施例8提供的单独应用1.0mg/ml大蒜多糖作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6g为本发明实施例8提供的联合应用0.25mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6h为本发明实施例8提供的联合应用0.5mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图6i为本发明实施例8提供的联合应用1.0mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡的影响结果图；

图7为本发明实施例8提供的单独应用大蒜多糖和大蒜多糖与顺铂联合应用作用48小时对hepg2细胞株细胞凋亡率的影响结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在肿瘤治疗过程中，通常会使用广谱抗肿瘤药物，例如顺铂。但此类药物的使用往往伴有严重的毒副反应，包括肾毒性、外周神经毒性和耳毒性等副作用，给病人带来极大痛苦，对病人机体的免疫系统损伤也较大，致使其使用受到严重限制，在非特异性全身器官和肿瘤内的浓度与分布均不足，达不到治疗疾病的最优药物浓度。

因此，针对上述问题，本发明提供了大蒜提取物的应用，包括大蒜提取物在制备降低化疗药物毒副作用的产品中的应用和在制备抗肿瘤的产品中的应用。

在本发明中，大蒜提取物为大蒜多糖。

在本发明中，毒副作用包括肾毒性、耳毒性和神经毒性中的一种或多种。

在本发明中，产品为药物。

在本发明中，肿瘤为肝癌。

在本发明中，肝癌包括单纯型、硬化型和炎症型中的一种或多种。

本发明还提供了一种用于降低化疗药物毒副作用的药物，包括上述的大蒜提取物。

另外，本发明还提供了一种用于抗肿瘤的药物，包括上述的大蒜提取物。

在本发明中，药物还包括药学上可接受的载剂或辅料。

其中，载剂例如可以为，但不限于壳聚糖、胆固醇、脂质体和纳米颗粒中的一种或多种；辅料例如可以为，但不限于糊精、淀粉或蔗糖。

在本发明中，药物的剂型例如可以为，但不限于片剂、胶囊或冲剂。

在本发明中，化疗药物为顺铂。

本发明提供的大蒜提取物，通过实验发现能够表现一定的抗肿瘤活性，通过应用由大蒜提取物制备的产品，能够起到抗肿瘤的作用；同时，将大蒜提取物联合化疗药物共同作用于肿瘤细胞，能够通过缩短作用时间，降低化疗药物使用量，降低其毒副作用；并且，大蒜为食药两用植物，应用大蒜作为辅助抗肿瘤的药物，在能够降低化疗药物毒副作用的同时，不产生其他不良反应，用药更安全。

为了有助于更清楚的理解本发明的内容，现结合具体的实施例详细介绍如下。如未明确指出，以下实施例中采用的白大蒜为市售200克；hepg2细胞购自中国协和医科大学细胞资源中心；mtt购自sigma；顺铂购自豪森药业有限公司；培养基(mem)和胎牛血清均购自gibco；非必需氨基酸溶液100×，胰蛋白酶-edta溶液1×(胰蛋白酶)购自gibco；碘化丙啶(pi)试剂盒、annexinv-fitc和hoechst33342染色试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯级别。

实施例1大蒜多糖的提取、分离与纯化

大蒜去皮磨碎。磨碎后的大蒜匀浆加4倍体积水80℃浸提3小时，然后用200目纱布过滤。滤渣再经4倍体积的水在80℃提取2小时，之后再次过滤取上清，合并上清液。上清液用旋转蒸发仪浓缩，浓缩液冷却后加入3倍体积的95％(v/v)的预冷乙醇进行沉淀，将沉淀物用95％(v/v)的乙醇洗涤三次并冻干。利用sevage法去除多糖中的蛋白质，之后再次干燥，获得粗多糖。

取5g粗多糖，重新溶解在100ml蒸馏水中，并利用q-sepharosefastflow层析柱(20mmid×350mm，法玛西亚公司)，用蒸馏水和0.1-0.5m浓度梯度的nacl在1ml/min的流速下进行洗脱。采用苯酚-硫酸法检测洗脱糖含量高的馏分(峰值1)并收集、透析、冻干，得大蒜多糖纯品。利用sephadexg-50(26mmid×1000mm)凝胶渗透色谱，用0.1m的nacl在0.5ml/min的流速下对上一步骤中获得的大蒜多糖进行纯度验证，获得洗脱峰为单一对称峰，说明上一步骤制备的大蒜多糖为纯品。

在本实验中，白蒜分离大蒜粗多糖得率26.06克，收率为13.08％。粗多糖经q-sepharosefastflow层析纯化。主要组分通过凝胶过滤层析纯度验证，洗脱曲线如图1所示。

实施例2大蒜多糖重均分子量

采用高效凝胶渗透色谱法(hpgpc)，并利用液相色谱仪器(安捷伦，美国)测定大蒜多糖的重均分子量。其中，plaquagel-oh30柱(7.5mmid×300mm，8μm)维持在25℃，流动相为0.02m的硝酸钠(nano3)和0.01m的磷酸二氢钠(naoh，ph7.0)，流量为0.6ml/min，并通过rid-10a检测器检测。将2mg样品溶解在流动相中，过0.45μm滤膜。大蒜多糖的重均分子量以dextrant-系列葡聚糖标准品(t-10、t-40、t-70、t-500和t-2000)绘制的标准曲线为参考进行评估。

通过在sephadexg-50中观察到单一对称峰，说明大蒜多糖是均一多糖，如图2所示。利用高效凝胶色谱法检测大蒜多糖的重均分子量，根据校准曲线与标准葡聚糖，得到大蒜多糖的重均分子量约为2714.94da。

实施例3大蒜多糖单糖组成分析

大蒜多糖中单糖的鉴定与定量采用pmp柱前衍生法和高性能液相色谱分析。大蒜多糖用2mtfa在100℃下水解2小时，并转化为所述的糖醇乙酸酯。由此产生的糖醇乙酸酯通过紫外检测器(245nm)和色谱毛细管柱(4.6mm内径×250mm，5μm)，利用agilent1280高效液相色谱分析仪进行分析。其中，色谱毛细管柱的温度保持在25℃，样品折射量为10μl。流动相为经磷酸二氢钾：乙腈(83:17，v/v)稀释的0.05m的kh2po4-naoh缓冲液，流速为1ml/min。以甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖为标准进行分析。

气相色谱分析表明，大蒜多糖是由相对摩尔质量比为4.6：0.8：0.9：0.5的葡萄糖(glc)、半乳糖(gal)、木糖(xyl)和阿拉伯糖(ara)组成。

实施例4细胞培养

人肝癌细胞系hepg2细胞利用mem培养基(含10％的胎牛血清、100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素)，在37℃，5％co2/95％空气的细胞培养箱中进行培养。

实施例5抗增殖活性

采用mtt法检测大蒜多糖对hepg2细胞生长抑制作用。将hepg2细胞接种于96孔板，当细胞融合度达到80％时，分别加入100μg/ml、250μg/ml和500μg/ml的大蒜多糖，5μg/ml的顺铂以及大蒜多糖与顺铂联合用药，用药方案为大蒜多糖100μg/ml、250μg/ml、500μg/ml分别与5μg/ml顺铂共同作用于人肝癌细胞系hepg2，在37℃条件下分别孵育24小时和48小时。孵育完成后，每孔加入20μlmtt(5mg/ml)，37℃孵育4小时。之后，弃掉细胞培养液并每孔加入150μldmso。紫色结晶溶解充分后，设定波长为490nm的酶标仪(perkinelmer，美国)检测。

本实验中，如图3所示，大蒜多糖可在一定浓度范围内抑制人肝癌细胞系hepg2的增殖，并呈剂量依赖性。系列浓度大蒜多糖作用肿瘤细胞24小时，当大蒜多糖浓度为100μg/ml时，抑制率为7.85％；当大蒜多糖浓度为250μg/ml时，抑制率为13.37％；当大蒜多糖浓度为500μg/ml时，抑制率为19.52％；作用48小时，当大蒜多糖浓度为100μg/ml时，抑制率为14.47％；当大蒜多糖浓度为250μg/ml时，抑制率为22.38％；当大蒜多糖浓度为500μg/ml时，抑制率为26.18％。5μg/ml顺铂作用肿瘤细胞24小时抑制率为13.68％，48小时抑制率为52.93％。对于大蒜多糖与顺铂联合用药，对肿瘤细胞的抑制率明显高于单独用药。100μg/ml大蒜多糖+5μg/ml顺铂作用24小时，其增殖抑制率为52.04％；500μg/ml大蒜多糖+5μg/ml顺铂作用24小时，增殖抑制率高达64.47％。联合用药对肿瘤细胞的抑制率均远高于顺铂单药作用48小时42.93％的抑制率。可见大蒜多糖可帮助增加顺铂的抗肿瘤活性，并可通过减少用药时间间接降低化疗药物使用量，减少其毒副作用。

实施例6大蒜多糖和顺铂诱导后的hepg2细胞凋亡形态学分析

将hepg2细胞接种于6孔板，当细胞融合度达到80％时，分别加入1.0mg/ml的大蒜多糖以及大蒜多糖与顺铂的联合用药，用药方案为1mg/ml大蒜多糖与0.5μg/ml顺铂共同作用，在37℃条件下孵育48小时。并设只加mem培养基的hepg2细胞为空白对照组。之后，收集细胞并通过hoechst33342在37℃条件下孵育15分钟。荧光显微镜(尼康ts100，日本)下观察细胞并拍照(400×)。

凋亡细胞的染色体dna结构发生改变，使染料与dna结合更为高效，增强了凋亡细胞的蓝色荧光。在本实验中，如图4a所示，空白对照组可见均匀蓝色椭圆形细胞核，未见明显凋亡。然而，通过结合hoechst33342，1mg/ml大蒜多糖的实验组可见较重蓝色荧光，如图4b所示；1mg/ml大蒜多糖联合0.5μg/ml顺铂的实验组与1mg/ml大蒜多糖的实验组相比，显示出更重的蓝色荧光，如图4c所示。hoechst33342染色结果显示，是由大蒜多糖诱导凋亡途径实现诱导hepg2细胞的凋亡。顺铂是一种烷化剂抗肿瘤药物，通过使dna不完整产生细胞毒性，作为一种非特异性的细胞周期药物，主要干扰dna的复制。通过诱导细胞凋亡途径，其抗肿瘤作用也得到了证实，并且，通过实施例1提供的大蒜多糖可以协同顺铂诱导hepg2细胞凋亡。

实施例7细胞周期分布测定

将hepg2接种于6孔板，接种密度为1×10⁵个/孔，利用mem培养基，在37℃，5％co2/95％空气的细胞培养箱中进行培养，至细胞融合度达到80％。之后，分别加入0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的大蒜多糖，0.5μg/ml的顺铂以及大蒜多糖与顺铂的联合用药，用药方案为大蒜多糖0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml分别与0.5μg/ml顺铂共同作用于人肝癌细胞系hepg2，其中，单独应用0.5μg/ml顺铂的为阳性对照组，并设只加mem培养基的hepg2细胞为空白对照组，在37℃条件下孵育48小时。胰蛋白酶消化后离心法收集细胞，pbs清洗两次后，用70％的酒精进行固定，并于4℃储存过夜。固定后的细胞经pbs清洗后加入含有0.05％核糖核酸酶的pi溶液，37℃孵育30分钟。之后，于室温在黑暗条件下加入5μl浓度为5mg/ml的pi溶液。30分钟后，细胞通过流式细胞仪(贝克曼库尔特公司，美国)进行分析。每组设置三个重复。流式细胞术测定dna含量。通过与空白对照组细胞的细胞周期进行比较，对用药实验组的细胞周期进行评价。

用pi染色评价大蒜多糖和顺铂单独或联合作用48小时后，肿瘤细胞的细胞周期分布。结果如表1所示。

表1大蒜多糖和顺铂对hepg2细胞周期的影响

每种药物单独作用48小时均减少g1期细胞数，如图5b，5c，5e和5g所示，大蒜多糖处理能够增加g2或m期细胞比例，顺铂能够显著增加细胞周期中s期的细胞比例。而联合用药组s期和g2期细胞比例增加，如图5d，5f和5h所示。空白对照组如图5a所示。因此，说明联合用药显著抑制肿瘤细胞生长是通过延长并阻止细胞在s和g2期的增殖来实现的。

实施例8凋亡检测

确定药物对细胞凋亡的影响，利用annexinv-fitc试剂盒及pi染色检测细胞凋亡。annexinv-fitc及pi染色剂能够进入细胞膜不完整的细胞，并通过检测细胞膜上的磷脂酰丝氨酸，检测凋亡或坏死的细胞。将hepg2接种于6孔板，接种密度为1×10⁵个/孔，利用mem培养基，在37℃，5％co2/95％空气的细胞培养箱中进行培养。当细胞融合度达到80％时，分别加入0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的大蒜多糖，0.5μg/ml的顺铂以及大蒜多糖与顺铂的联合用药，用药方案为大蒜多糖0.25mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml分别与0.5μg/ml顺铂共同作用于人肝癌细胞系hepg2，其中，单独应用0.5μg/ml顺铂的为阳性对照组，并设只加mem培养基的hepg2细胞为空白对照组，在37℃条件下孵育48小时。之后，细胞与5μlannexinv-fitc及5μlpi共孵育，并通过流式细胞仪(加利福尼亚，贝克曼库尔特公司)进行分析。每组设置三个重复。细胞凋亡率(％)＝凋亡细胞数/总细胞×100％。

根据染色，正常细胞为annexinv(-)/pi(-)；早期凋亡细胞为annexinv(+)/pi(-)；晚期凋亡细胞annexinv(+)/pi(+)，坏死细胞为annexinv(-)/pi(+)。流式细胞仪分析表明，每组药物单独处理48小时均可诱导hepg2细胞凋亡，如图6b、6c、6d、6e和6f所示。联合用药也增加肿瘤细胞早期和晚期凋亡率，如图6g、6h和6i所示。空白对照组如图6a所示。通过大蒜多糖联合顺铂诱导的细胞凋亡率(74.1％、76.7％和79.3％)均显著高于单独应用0.5μg/ml顺铂(50.3％)或单独应用大蒜多糖(49％，56.8％，63.8％)的凋亡率，如图7所示(p＜0.05)。其中，大蒜多糖联合0.5μg/ml顺铂用药对细胞凋亡率的影响均接近5μg/ml顺铂单独的作用。提示大蒜多糖能够降低化疗药物90％的用量，并达到相同的抗肿瘤效果。由于顺铂能够干扰dna的复制，并且具有多种细胞毒性，能够产生严重的毒副作用，因此，与其他药物联合用药是一种增加疗效但不增加不良反应的好方法。本实验的结果证实，作为低毒的天然大分子果聚糖成分的大蒜多糖，能显著增加顺铂对hepg2细胞的抗增殖能力，且呈时间和剂量依赖性。

由本发明提供的实施例1至8的实验结果中可以看出，本发明提供的大蒜提取物大蒜多糖，能够表现一定的抗肿瘤活性，将大蒜多糖联合化疗药物顺铂共同作用于肿瘤细胞，能够通过缩短作用时间，降低顺铂使用量，从而降低其毒副作用；并且，大蒜为食药两用植物，应用大蒜作为辅助抗肿瘤的药物，在能够降低化疗药物毒副作用的同时，不产生其他不良反应，用药更安全。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。