一种海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶及其制备和应用的制作方法

本发明属于水凝胶材料及其制备和应用领域，特别涉及一种海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶及其制备和应用。

背景技术：

组织、器官的损伤、功能障碍或丧失是人类面临的主要健康危害之一，也是引起人类疾病和死亡的最主要原因，组织工程的出现为这一世界性难题带来了新的解决方案。作为一门新兴的跨学科领域，组织工程涉及细胞生物学、分子生物学、材料科学、临床医学、生物工程等诸多学科，通过将细胞生物学和材料学相结合，在体外或体内构建组织或器官，最终从根本上解决组织和器官的缺失等问题。

水凝胶是一种依靠物理或化学交联作用形成的高度含水的高分子网络，自从1960年由wichterle等人首次利用水凝胶作为隐形眼镜后，水凝胶被广泛研究应用于生物医学领域。特别是近十年来随着组织工程的研究受到越来越多的关注，水凝胶由于其高度含水、物理性质类似于细胞外基质(ecm)的特性,被作为支持细胞生长的三维组织工程支架而广泛研究。

随着人们生活水平的提高，对医疗手段的无痛、无疤、操作简易的要求越来越高，因此可注射水凝胶作为一种新型的快速治疗手段，能实现无痛无创手术，更是受到越来越多的重视并逐渐为人们青睐，成为未来生物医用材料应用发展的重要方向之一。

光聚合作为一种新型的聚合方式在组织工程中也有广泛应用，和传统的聚合方法相比优点很多：可在室温或生理条件下进行，固化速度快(从不到一秒钟到几分钟)；反应放出的热量少；反应条件温和，不会对细胞和组织造成损伤；通过光聚合可使聚合物前体水溶液原位形成水凝胶，故而可用来制备可注射水凝胶。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶及其制备和应用，本发明的海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶可用于组织工程，该水凝胶的原材料选用海藻酸钠和明胶，价格低廉，生物相容性好，可被生物体吸收降解；制备方法简单，实施条件温和，该水凝胶生物相容性好，机械性能优。

本发明的一种海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶，所述水凝胶原料包括：酯化的醛基海藻酸钠和氨基化明胶，其中酯化的醛基海藻酸钠和氨基化明胶的质量比为0.75～1.5:1。

本发明的一种海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶的制备方法，包括：

将酯化醛基海藻酸钠水溶液与氨基化明胶的水溶液混合，在37℃下交联5-15min后，再进行紫外照射交联，即得海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶。

所述酯化醛基海藻酸钠水溶液与氨基化明胶的水溶液按体积比为1:1混合。

所述酯化醛基海藻酸钠水溶液与氨基化明胶的水溶液混合为：两种溶液由两个注射器同时注射到同一针头中混合。

所述酯化醛基海藻酸钠水溶液的质量体积百分比浓度为20％-30％；氨基化明胶水溶液的质量体积百分比浓度为20％。

所述酯化醛基海藻酸钠的制备具体为：(1)室温避光条件下，将高碘酸钠水溶液加入到海藻酸钠的水溶液中，反应4～6h，透析，冷冻干燥，得到醛基化海藻酸钠；其中高碘酸钠与海藻酸钠的摩尔比例为0.88～1：1；(2)在醛基化海藻酸钠的乙磺酸mes缓冲液中，加入碳化二亚胺和羟基琥珀酰亚胺，室温下避光活化30-45min，随后加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐，室温避光条件下反应过夜，透析，冷冻干燥，得到酯化醛基海藻酸钠；其中醛基化海藻酸钠上的羧基、碳化二亚胺、羟基琥珀酰亚胺和甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯的摩尔比为3：3：1：1.5。

所述步骤(1)中海藻酸钠为中粘度580mpa.s海藻酸钠，重均分子量约为144万，g嵌段比例为40％。

所述步骤(2)中透析：透析袋截留分子量为14000da，透析的时间为2～3天。

所述步骤(2)中冷冻干燥为先在-80℃冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冻干。

所述氨基化明胶的制备方法包括：将乙二胺加入到明胶水溶液中，调节ph至5.0，加入水溶性碳二亚胺edc，37℃反应4～6h，透析，冷冻干燥，得到氨基化明胶；其中明胶与乙二胺的摩尔比为1：1；明胶与水溶性碳化二亚胺摩尔比为1：2。

所述明胶为牛明胶，冻力强度为150～180g，黏度3.5～4.3，重均分子量约为3.7万。

上述氨基化明胶的制备方法中的透析为：透析袋截留分子量为3500da，透析的时间为2～3天；冷冻干燥为先在-80℃冷冻6h，然后放入真空冷冻干燥机中进行冻干。

紫外照射交联中采用的紫外发生器为波长365nm，功率5mw/cm²的紫外灯，紫外照射交联10～15min。

紫外照射交联中采用光引发剂，采用的光引发剂在体系中的最终质量体积百分浓度为0.1％，优选光引发剂为2-羟基-2-甲基-1-[4-(2-羟基乙氧基)苯基]-1-丙酮(i2959，sigma公司，上海，中国)。

本发明的一种海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶的应用，其特征在于：海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶应用于组织工程中的光交联可注射水凝胶支架。

本发明提供的可用于组织工程的海藻酸钠/明胶可注射双网络水凝胶的制备方法中，海藻酸钠由naio4氧化相邻羟基形成醛基，随后甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯中的氨基与醛基化海藻酸中的羧基通过酰胺化反应形成酯化醛基海藻酸钠。明胶在碳化二亚胺的存在下与乙二胺缩合形成氨基化明胶。当改性海藻酸钠溶液与改性明胶溶液混合时，首先，改性海藻酸钠中的醛基与改性明胶中氨基发生席夫碱反应形成水凝胶的第一层网络。然后，改性海藻酸钠中的甲基丙烯酸基团在光引发剂i2959的存在下利用365nm紫外引发交联，形成水凝胶的第二层网络。

本发明的双组份形成双交联网络水凝胶的设计可以使得实际操作中，两种溶液由两个注射器同时注射到同一针头中混合使之发生席夫碱反应，在室温下自发交联形成凝胶。注射到所需组织部位，形成原位注射交联。

本发明的双组份形成双交联网络水凝胶的设计可以使得最终得到的水凝胶具有较强的力学性能，实际测试中，溶胀平衡后的水凝胶具有2.5mpa的压缩模量值。

本发明的双组份形成双交联网络水凝胶的设计使得水凝胶支架可以通过调节交联密度达到可控的降解性能。

有益效果

(1)本发明中所选用的海藻酸钠和明胶均是天然生物材料，无毒、无味、有很好的生物相容性，价格低廉、安全可靠，实际操作中，两种溶液由两个注射器同时注射到同一针头中混合，通过光照形成双网络结构，操作简单；

(2)本发明制备的双网络水凝胶易降解，机械性能好，有望应用于组织工程中的可注射水凝胶支架。

附图说明

图1是酯化醛基海藻酸钠的制备原理图；其中n≈7272；

图2是氨基化明胶的制备原理图；

图3是双交联水凝胶的制备原理图(a)和示意图(b)；

图4是双交联水凝胶的降解示意图；

图5是成纤维细胞在双交联水凝胶表面的细胞增殖情况；

图6是测试双网络水凝胶对纤维膜的粘结强度的示意图；

其中，附图中的asa表示醛基海藻酸钠，amsa表示酯化醛基海藻酸钠，ag表示氨基化明胶。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

精确称取3.96g海藻酸钠溶解于400ml去离子水中形成均一溶液。将4.28g高碘酸钠避光溶于适量的去离子水中，再将高碘酸钠溶液避光逐滴加入均一的海藻酸钠溶液中，并于常温下避光反应4h。将产物装入透析袋(截留分子量为14000)中透析3天，每4h换次水。将产物倒入平皿中于-80℃冰箱中预冻6h，随后放入冻干机，冷冻干燥得到醛基化海藻酸钠。

实施例2

精确称取1.2g醛基化海藻酸钠溶解于120mlmes缓冲液中形成均一的溶液。将1.1736g碳化二亚胺和0.23064g羟基琥珀酰亚胺溶于适量的mes缓冲液中，37℃条件下活化30～45min，再称量0.4995甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯的mes溶液避光逐滴加入，并于常温下避光反应过夜。将产物装入透析袋(截留分子量为3500)中避光透析3天，每4h换次水。将产物倒入平皿中于-80℃冰箱中预冻6h，随后放入冻干机，冷冻干燥得到酯化醛基化海藻酸钠。

实施例3

精确称取5g牛明胶溶于100ml的水溶液中，加入16ml乙二胺，调ph至5.0，加入0.66g水溶性碳二亚胺edc，37℃反应过夜。待冷却至室温后，将产物装入透析袋(截留分子量为3500)透析3天，每4h换次水。将产物倒入平皿并在-80℃冰箱中预冻6h，随后放入冻干机，获得得到氨基化明胶。

实施例4

将酯化醛基海藻酸钠(实施例2)配成浓度为30％的溶液。准确称量氨基化明胶(实施例3)，用去离子水配成浓度为20％溶液。用2ml的针管取1ml胺基化明胶溶液，用2ml针管取1ml酯化醛基海藻酸钠溶液，然后加入i2959光引发交联剂，使其在体系中的最终质量体积百分浓度为0.1％。经一y型连接，将胺基化明胶溶液和酯化醛基海藻酸钠溶液同时由一个针头注射到48孔板中形成柱状单网络水凝胶。10min后，在365nm波长，5mw/cm²功率的紫外灯下照射10～15min，即得双交联网络水凝胶。

实施例5

根据实施例4所示方法，制备圆柱形双交联水凝胶块，室温下在磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中浸泡24h后，使用万能材料试验机(dejiedxll-20000)对水凝胶进行压缩试验，得出水凝胶的压缩模量为2.5mpa。

实施例6

根据实施例4所示方法，制备圆柱形双交联水凝胶块，室温下浸泡在去离子中，定期取出冷冻干燥，称重，计算得出降解曲线。如图4所示，双交联水凝胶在最初一周降解掉40％的质量，第30天仍保持大约50％的质量。

实施例7

将酯化醛基海藻酸钠(实施例2)和氨基化明胶(实施例3)在284nm紫外灯下辐照灭菌，根据是实施例4所示方法制备圆柱形双交联水凝胶。将成纤维细胞种植在水凝胶表面，细胞密度设定为10,000个/ml。培养预定时间后，通过mtt测试法来测试细胞活性。种植在孔板(tcp)的作为对照。如图5所示，水凝胶中的天然材料能够促进细胞的生长，证明了双交联水凝胶具有很好的生物相容性。

实施例8

将酯化醛基海藻酸(实施例2)配成浓度为30％的溶液。准确称量氨基化明胶(实施例3)，用去离子水配成浓度为20％溶液。用2ml的针管取1ml胺基化明胶溶液，用2ml针管取1ml酯化醛基海藻酸钠溶液，然后加入i2959光引发交联剂使其在体系中的最终质量体积百分浓度为0.1％。经一y型连接，将胺基化明胶溶液和酯化醛基海藻酸钠溶液同时由一个针头注射到两片1厘米长3厘米的pcl纤维膜中的1厘米×1厘米区域，静置10min形成柱状单网络水凝胶，然后在365nm波长，5mw/cm2功率的紫外灯下照射10～15min，以确保该双交联网络水凝胶粘结两片纤维膜完成。经过拉伸测试(如图6)可知，该双网络水凝胶对纤维膜的粘结强度可达到23.4kpa以上。以上结果表明该双网络水凝胶有潜力用于粘结脑膜等膜类组织。