AZ31镁合金表面Na‑MMT涂层的制备与测定方法与流程

本发明属于医学材料技术制备领域，尤其涉及一种az31镁合金表面na-mmt涂层的制备与测定方法。

背景技术：

镁合金材料在工业用途中出现的化学性质活泼，易腐蚀降解等缺点，恰恰可以用来作为医用可降解植入材料，但仍然存在降解过快的问题，怎样使其在完成植入材料的支撑功能后再逐渐降解是医用材料及临床医生关心的重点；另外，在镁合金医用植入材料中，能否使制备的涂层既能延缓降解又能促进骨的与生长愈合呢？本发明在az31镁合金表面制备na-mmt涂层，提高镁合金耐蚀性基础上，研发具有促进骨生长愈合的医用镁合金植入材料，减轻病人二次手术的痛苦及经济负担，具有现实性重要意义。蒙脱石由于其资源丰富，廉价易得，除了在医药领域的应用，在多个行业也应用广泛。

探讨在az31镁合金表面制备na-mmt涂层的方法。目前尚无该种矿物应用到镁合金表面的报道，根据文献中有关水滑石等矿物涂层的制备，经过多次试验，反复研究，确定制备工艺为水热法，温度160℃，ph10.5，36h。制备出的涂层与基体结合紧密，较均匀，膜层性能相对较好，具有广阔的研究潜力。

na-mmt涂层在az31合金表面形成的机理研究。na-mmt在酸性环境中的研究较多，在碱性条件的变化研究的较少，仅仅在放射性物质深埋后对mmt的影像中涉及到，碱性环境下，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层涂层机理较复杂，缺少相应的研究。

改进模拟体液，增加动态元素，用于研究na-mmt涂层的耐蚀性。在生物医用材料做生物降解研究中，大多研究人员选用生理盐水、pbs，hanks等作为模拟体液，上述液体能在一定程度上反映体液的无机盐成分，但均不含氨基酸等有机成分，不能完全反应机体的状况；另外浸泡实验多采用静置的方式，也与机体流动的体液，差距较大，数据很难反映出机体真实情况，

探讨na-mmt涂层提高az31镁合金血液相容性的机理。目前，大多数研究停留在血液相容性研究层面上，对机理研究的较少。

探讨na-mmt涂层促进骨细胞贴壁生长，促进骨的生长。

目前用于人体的骨固定金属材料为不锈钢、钛及钛合金钴基合金等，这些金属材料在应用过程中仍然存在问题：1、金属离子释放造成的机体反应；2、强度及弹性模量高；3、需要二次手术。

在不断探索过程中，镁合金走进研究人员的视野----生物医用降解材料。在镁合金最初研究中，人们发现还是降解太快。存在问题：性质活跃、易腐蚀，降解快，其在体内未完成支撑使命后降解，从而导致植入失败。此阶段，镁合金医用材料的研究大多是围绕提高其耐蚀性及生物相容性进行，例如增加微量元素制成合金、表面改性制备涂层。随着医用镁合金的研究不断推进，体内植入及临床应用试验表明，如果在延缓镁合金降解的基础上，能促进骨的再生，不失为两全其美。

因此，在提高镁合金耐蚀性基础上，研发具有促进骨生长愈合的医用镁合金植入材料，具有现实性重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种az31镁合金表面na-mmt涂层的制备与测定方法，旨在解决背景技术提及的现有技术的缺陷问题。本发明主要目标就是将自备的具有抗菌功能的na-mmt，通过水热法负载到az31镁合金表面，提高耐蚀性、血液相容性的同时具有促进骨的生长功能，拓展蒙脱石的应用领域，为镁合金医用植入材料的临床应用奠定基础。应用于人体的镁合金骨植入材料主要是减缓降解速度，控制腐蚀，在骨骼修复后，逐渐降解，技术上采用水热法制备na-mmt涂层，表面发生一定反应，结合力不强，后期在体内环境下会逐渐脱落，有利于控制镁合金的降解。

本发明是这样实现的，一种az31镁合金表面na-mmt涂层的制备方法，所述az31镁合金表面na-mmt涂层的制备方法包括以下步骤：

以钙基蒙脱石(ca-mmt)为原料，采用离子交换法制备na-mmt，首先进行单因素实验，分析氟化钠用量、温度、时间对na-mmt阳离子交换容的影响；然后，在单因素基础上，利用响应面法优化工艺条件，建立响应面模型；

利用水热法，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层。

进一步，建立响应面模型中选用二次多项式模型建立与检验回归方程；回归方程为：

y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²。

在单因素实验的基础上，使用design-expert8.0用中的box-behnken设计模式进行实验设计，以影响钠含量的3个因素：氟化钠用量a、温度b、时间c为自变量，各因素设计三因素三水平实验。

进一步，na-mmt涂层的制备方法为：称取5gna-mmt溶于200ml去离子水中，置于250ml锥形瓶中，在室温下磁力搅拌0.5h，使na-mmt分散均匀；调节悬浮液ph值至10.5，80℃搅拌5h；将预处理的az31镁合金放入水热釜中，需保持镁合金直立，将搅拌后悬浮液装入水热釜中，置于恒温干燥箱中130℃，36h后取出，去离子水清洗，吹干；得到na-mmt涂层。

进一步，na-mmt涂层的制备方法中，在碱性环境下发生以下化学反应包括：

(1)蒙脱石发生水化反应：

al2[si4o10](oh)2+10h2o→2al(oh)3+4si(oh)4

(2)蒙脱石与naoh的反应:

al2[si4o10](oh)2+2na⁺+2oh^-→2naalsi2o6·h2o

(3)镁合金发生水化反应：

mg+2h2o→mg(oh)2+h2↑

(4)蒙脱石与mg(oh)2的反应：

2al2[si4o10](oh)2+mg²⁺+2oh^-→mg(al2si4o12)·h2o

最后，蒙脱石硅氧四面体表面有活性的oh^-与镁合金水化反应产生的oh^-，在水热条件下，脱去h2o，在镁合金表面形成氧桥，使蒙脱石与镁合金az31紧密结合，形成na-mmt涂层。

进一步，

氟化钠用量对na-mmt阳离子交换容的影响中随着氟化钠用量的增加na-mmt阳离子交换容也逐渐增加；当氟化钠用量达到4mmol时，na-mmt阳离子交换容达到最大；当氟化钠用量继续增加，阳离子交换容不再继续升高；

反应温度对na-mmt阳离子交换容的影响中随着温度的升高，ca-mmt的阳离子交换容开始增加，当到达80℃时，na-mmt阳离子交换容达到最大，此后，当温度继续升高，阳离子交换容不再增加；

反应时间对na-mmt阳离子交换容的影响，随着反应时间的延长，na-mmt阳离子交换容逐渐增加，当反应时间达到4h，na-mmt阳离子交换容达到最大，此后，继续延长反应时间，阳离子交换容基本保持不变。

本发明另一目的在于提供一种az31镁合金表面na-mmt涂层的测定方法，所述az31镁合金表面na-mmt涂层的测定方法包括：利用电镜、eds、xrd、ftir进行表征，分析形成机理；以dmem+10％fbs为模拟体液，利用浸泡后电镜观察、析氢实验，ph测定、eis曲线及极化曲线分析na-mmt涂层耐蚀性机理；

通过溶血率、动态凝血时间、血细胞计数及血小板黏附实验分析na-mmt涂层的体外血液相容性；采用接触角计算表面张力，分析na-mmt涂层降低溶血率，提高镁合金血液相容性的机理。

进一步，依据young方程由液体接触角估算固体的表面张力；固体总表面张力近似等于固体表面张力的非极性值和极性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且与接触角的关系见式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液体的表面张力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分别是液体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分别是固体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)；测定两个已知γ^dl和γ^pl的探测液体在固体表面的接触角，代入式(1)，联立方程求解可得固体γ^ds、γ^ps和固体的表面张力γs..

界面张力的计算依据owen-wendit方程,计算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)。

进一步，所述az31镁合金表面na-mmt涂层的测定方法包括：选择小鼠成骨细胞mc3t3进行细胞培养，采用细胞毒性试验，评价涂层的细胞相容性及促进骨细胞生长的作用。

本发明的na-mmt涂层提高了az31镁合金的耐蚀性，生物相容性，又促进了骨的生长，有望成为一种理想的医用镁合金植入材料。

本发明采用dmem+10％fbs为模拟体液，每24h更换，既能使各种离子更接近人体，又增加动态元素，更能真实地模拟体内环境，得出的数据及结论能客观地反映体液、涂层两者之间的相互作用。

本发明通过测定na-mmt涂层对极性、非极性溶液的接触角，计算表面张力，分析提高了涂层对血液相容性的机理。采用体外骨细胞培养方法，分析na-mmt涂层的细胞相容性及涂层促进骨生长的机理。

本发明利用水热法，以az31为基体，温度160℃，ph10.5，时间36h，将na-mmt成功负载到az31镁合金表面。na-mmt涂层电镜下呈现mmt典型的片层状结构；与基体结合紧密；纵切面显示厚度约42μm；eds显示az31镁合金表面出现了al、si、o、mg等硅酸盐的成分；xrd呈现mmt的特征峰。通过析氢及电化学试验发现，na-mmt涂层耐蚀能力较好，延缓了az31镁合金在模拟体液中的降解。

本发明对az31镁合金表面的na-mmt涂层进行血液相容性探讨。结果发现na-mmt涂层溶血率均低于5％，基体的溶血率为41.62％，大于5％；na-mmt涂层均对红细胞、白细胞、血小板数量无明显影响；对机体凝血无明显影响。总之，体外实验证明，az31镁合金表面的na-mmt涂层均提高了az31镁合金的血液相容性；分析其机理可能与涂层降低了az31镁合金表面的接触角，使其表面张力下降有关。

本发明对az31镁合金表面的na-mmt涂层的细胞相容性进行探讨。结果发现na-mmt涂层对小鼠成骨细胞mc3t3无细胞毒性作用，能促进骨细胞生长的作用。

本发明以na-mmt、氟化钠为原料，采用液相离子交换法制备na-mmt；应用响应面法设计优化条件；采用扫描电镜观察na-mmt形貌；eds、xrd等分析组成及插层机理；利用水热法，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层；研究了涂层在dmem+10％fbs溶液中的降解行为和耐腐蚀机理；采用测定溶血率、动态凝血时间，血小板粘附实验、接触角计算等研究涂层的血液相容性；通过细胞培养，研究na-mmt涂层的细胞相容性及促进骨生长的性能，得出以下结果

(1)以ca-mmt为原料，采用离子交换法成功制备na-mmt。

(2)采用响应面法，对na-mmt制备工艺进行优化，最佳优化条件：氟化钠为4mmol，温度为80℃，时间为4.5h，此时得到的na-mmt中的阳离子交换容达到112mg/g。

(3)利用水热法，以az31为基体，温度160℃，ph10.5，时间36h，将na-mmt成功负载到az31镁合金表面。na-mmt涂层电镜下呈现mmt典型的片层状结构

(4)电化学实验、析氢实验、浸泡实验中ph测定，均显示na-mmt涂层提高了az31镁合金的耐蚀能力，起到较好的延缓降解的效果。

(5)az31镁合金表面的na-mmt涂层溶血率均低于5％，基体的溶血率为41.62％，大于5％；两种涂层均对红细胞、白细胞、血小板数量无明显影响；对机体凝血无明显影响。其机理可能与两种涂层降低了az31镁合金表面的接触角，使其表面张力下降有关。

(6)对az31镁合金表面的na-mmt涂层的细胞相容性研究发现na-mmt涂层对小鼠成骨细胞mc3t3无细胞毒性作用，能促进骨细胞生长的作用。

附图说明

图1是本发明实施例提供的az31镁合金表面na-mmt涂层的制备方法流程图。

图2是本发明实施例提供的电镜下na-mmt涂层(a)(b),纵切面(c)(d)图；

图3是本发明实施例提供的na-mmt涂层的eds元素组成图；

图4是本发明实施例提供的az31、na-mmt涂层与na-mmt的xrd分析图；

图5是本发明实施例提供的为az31镁合金及na-mmt涂层在dmem+10％fbs溶液中浸泡后的宏观形貌图；

图6是本发明实施例提供的az31镁合金在dmem+10％fbs培养液中浸泡1d和3d后的

电镜形貌图；图中：az31(a)(b)为1d，(c)(d)为3d；na-mmtcoating(e)(f)为1d，(g)(h)

为3d)。

图7是本发明实施例提供的na-mmt涂层腐蚀后3d的eds谱图分析图；

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的az31镁合金表面na-mmt涂层的制备方法，包括以下步骤：

s101：以钙基蒙脱石(ca-mmt)为原料，以阳离子交换容为检测指标，采用离子交换法制备na-mmt，首先进行单因素实验，分析氟化钠用量、温度、时间对na-mmt阳离子交换容的影响；然后，在单因素基础上，利用响应面法优化工艺条件，建立响应面模型。

s102：利用水热法，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

1.1实验试剂、材料与设备

1.1.1实验试剂

实验中所用到主要试剂见表1.1

表1.1化学试剂

1.1.2实验材料

实验所用基材为挤压态az31合金，化学组成见表1.2。

表1.2实验用的材料组成(wt％)

1.1.3实验条件

实验中析氢和浸泡实验温度通过恒温水浴控制在36.5±1℃，电化学试验温度为室温。析氢和浸泡实验中，模拟体液为dmem溶液+10％小牛血清(fbs)，其配方见表1.3。

表1.3dmem的组成成分

1.1.4实验设备

主要实验设备见表1.4。

表1.4主要仪器设备

1.2材料的制备

1.2.1na-mmt的制备

1.2.1.1制备工艺

称取ca-mmt5g，加入95ml去离子水，搅拌分散得到悬浮液；加入一定量的氟化钠；恒温搅拌5h；1500r/min，10min，得到白色沉淀物；反复洗涤、过滤，用0.1mol/l的na2s检验，直至滤液中无na⁺检出，65℃干燥，研磨，过200目筛，即得na-mmt。

1.2.1.2阳离子交换容的测定

采用氯化铵-50％乙醇法，对蒙脱石阳离子交换容量进行测定：准确称取烘干试样1.0000g放于100ml烧杯中，加入20ml的50％乙醇溶液，不断搅拌3～5min，使可溶盐溶解。离心，弃上清，取出残渣，放入100ml烧杯中，加入50ml的0.5mol·l^-1氯化铵-50％乙醇交换液，磁力搅拌30min；再离心，清液放入100ml容量瓶中；95％乙醇洗涤残渣并离心两次，每次约25ml。第一次洗液搅拌离心后，倒入已收集交换液的100ml容量瓶，以蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用作交换性阳离子的测试。第二次洗液搅拌离心后弃去，残渣作阳离子交换容量的测试。将交换后的残渣全部移入100ml锥形瓶中，加入25ml氯化钙-甲醛混合溶液，约加入相当阳离子交换容量80％的0.1mol·l^-1的氢氧化钠标准溶液，再加酚酞指示剂4滴，塞上橡皮塞，在振荡器上激烈振荡1min，继续用0.1mol·l^-1的氢氧化钠标准溶液滴定至稳定的粉红色，如果3min不消失即终点。

阳离子交换容量计算公式：

cec＝c×v×100

式中：cec—阳离子交换容量，mmol/100g^-1蒙脱石；c—氢氧化钠标准溶液浓度，mmol·l^-1；v—消耗氢氧化钠标准溶液的体积，ml。

1.2.1.3单因素分析

将5gca-mmt通过搅拌分散在95ml去离子水中得到悬浮液，分别分析氟化钠的量、反应时间、温度对na-mmt阳离子交换容的影响。

1.2.1.4响应面法优化工艺条件

在单因素实验的基础上，使用design-expert8.0用中的box-behnken设计模式进行实验设计，以影响钠含量的3个因素：氟化钠的量(a)、温度(b)、时间(c)为自变量，各因素设计三因素三水平实验。实验因素水平设计见表1.5，响应面实验设计方案见表1.6。

表1.5响应面因素水平设计

表1.6响应面实验设计方案

1.2.2az31镁合金样品的预处理

实验用az31采用线切割加工成20×20×4mm和15×15×4mm的方块。分别用360^#，600^#，800^#，1000^#，1200^#，1500^#水磨砂纸依次对样品进行打磨，丙酮浸泡去除合金表面油污和氧化皮，然后，用无水乙醇冲洗并用吹风机吹干，备用。

1.2.3na-mmt涂层的制备

na-mmt涂层制备，称取4gna-mmt溶于200ml去离子水中，置于250ml锥形瓶中，在室温下磁力搅拌0.5h，使na-mmt分散均匀。调节悬浮液ph值至10.5，80℃搅拌5h。将预处理的az31镁合金(20×20×4mm)放入水热釜中，需保持镁合金直立(可放入一块聚四氟乙烯支撑)，将搅拌后悬浮液装入水热釜中，置于恒温干燥箱中130℃，36h后取出，去离子水清洗，吹干，备用。

1.3涂层组织结构及成分分析

1.3.1扫描电子显微镜形貌观察及能谱分析

样品、涂层及腐蚀前后微观形貌及截面形貌采用扫描电子显微镜观察(novananosem450，usa)，实验参数为加速电压15kv。样品上样前喷金。利用扫描电镜中附带的能谱仪(eds)对上述样品进行点扫描、线扫描及面扫描，分析各样品的组成元素和含量变化。

1.3.2x射线衍射分析(xrd)

采用d/max-2500/pcx-衍射仪分析样品及其腐蚀产物的物相组成，实验参数为：管电流i＝40ma，管电压u＝40kv，扫描角度范围2θ为2-80°，扫描速度为8°/min，靶材为cu-kα(λ＝0.154060nm)靶。

1.3.3傅立叶红外光谱分析

采用nicolet380傅立叶红外光谱仪，测定na-mmt、na-mmt涂层及na-mmt涂层在dmem++10％fbs中腐蚀后产物的官能团。实验参数为：波数范围：4000-400cm^-1,分辨率：4cm^-1，背景采集：kbr压片，采集点数：32个。

1.4涂层耐蚀性能测试

1.4.1电化学实验

az31合金、na-mmt涂层的耐腐蚀性能主要采用电化学测量的方法电化学测试，通过由美国parstat2273电化学工作站完成。测试采用三电极体系：参比电极为饱和甘汞电极(sce)，辅助电极为铂电极，工作电极为被测样品。腐蚀介质为ph7.4的dmem+10％fbs溶液，实验温度为室温，测试样品面积与测试溶液体积比为1cm²/400ml。动态极化测试时，电位扫描范围为自腐蚀电位(ec)±300mv起，扫描速度为1mv/s。电化学测试前，样品在dmem+10％fbs溶液中浸泡5min以使开路电位尽可能稳定。电化学阻抗谱(eis)采用powersuite-powersine作为测试软件，测试后采用zview软件进行阻抗谱的拟合与分析。

1.4.2浸泡实验

为进一步评价镁合金及涂层的耐腐蚀性能和降解性能，进行体外浸泡试验。浸泡试验按照astm-

g31-72标准在dmem+10％fbs溶液中进行，测试过程中溶液温度保持在36.5±1℃。浸泡一定时间后进行形貌观察，成分分析等。

1.4.3析氢实验

腐蚀析氢实验采用排水集氢气法，由酸式滴定管、玻璃漏斗和烧杯组成。浸泡样品表面积约为12cm²，dmem+10％fbs溶液的体积约为300ml，面积/溶液比为1:25cm²/ml。由反应方程式可知，每溶解一个镁原子就会产生一个氢气分子，因此通过测量试样在腐蚀过程中产生氢气的体积就可以计算样品的析氢腐蚀速率。

1.4.4ph值的变化

将az31合金、na-mmt涂层的az31合金浸泡在dmem+10％fbs溶液中，每24h更新液体，起初浸泡24h内每隔1h测一次，后期每24h测定一次，溶液温度保持在36.5±1℃，以时间为横坐标，ph为纵坐标，绘制ph变化图。

1.5体外血液相容性及机理

1.5.1溶血实验

1.5.1.1溶血率的测定

(1)材料浸提液的制备

取2cm×2cm×0.4cm的az31合金、及na-mmt涂层各4块，分别以0.9％nacl作为浸提液，按照iso10993-1标准(试样表面积/浸提介质)3cm²/ml的比例，静置于36.5±1℃恒温培养箱中浸提90min。用细菌过滤器过滤除菌后，4℃冰箱保存备用。

(2)2％红细胞悬液的制备

取新鲜人血4ml(本实验室人员志愿捐献，不存在医学伦理争议)，1500r/min离心10min，用胶头滴管吸出上清液，沉淀在底部的红细胞用0.9％nacl按上述方法洗涤3次，至上清液不显红色为止。将所得红细胞用0.9％nacl配成2％的混悬液(红细胞1ml，加0.9％nacl至50ml)。

(3)溶血率计算

分别取上述三种样品的材料浸提液7ml、与0.9％nacl(阴性对照组)和蒸馏水(阳性对照组)为对照，分别做三组平行样。每组浸提液中加2％红细胞悬液1ml，混匀后置36.5±1℃恒温培养箱孵育1h，1000r/min离心10min，吸取上清，在545nm处测od值，取平均值计算溶血率。

溶血率(％)＝(实验组od值－阴性对照组od值)/(阳性对照组od值－阴性对照组od值)×100％

1.5.1.2材料浸提液ph的变化

用ph计测量上述各浸提液浸提不同时间时的ph值。

1.5.1.3材料浸提液中镁离子的变化

采用原子吸收光谱仪测定材料浸提液浸提不同时间的镁离子、锌离子的变化，方法同1.4.4。

1.5.2血细胞计数实验

将az31合金、na-mmt涂层的az31合金分别置于10ml人抗凝血中(柠檬酸钠抗凝)，静置，30min后进行血细胞计数，与未接触材料的血细胞数量进行比较。

1.5.3动态凝血时间实验

体外动态凝血时间实验可检测内源性凝血因子被激活的程度,使镁合金实验样品与血液接触,测定游离血红蛋白的光密度值,动态地观察不同样品对凝血时间的影响。

分别取30μl人抗凝血，滴在az31合金、na-mmt涂层表面。每组试验设有6个间隔时间(5、20、35、50、90、130min)，每个时间3平行样。到达预定时间后，样品立即放入盛有15ml去离子水的烧杯中，静置10min待未凝固的红细胞充分溶于水中，在540nm处测溶液od值，绘制动态凝血曲线，人为定义od值0.1为出现凝血。

1.5.4血小板黏附实验

将新鲜抗凝人血(实验室人员捐献)以1000r/min离心10min，即可得到富血小板血浆。分别移取20μl富血小板血浆滴于az31合金及na-mmt涂层的表面，36.5℃恒温箱中保温30min，然后用pbs(ph＝7.4)清洗除去样品表面未黏附的血小板。2.5％戊二醛固定液中固定，乙醇系列梯度脱水，取出在空气中自然干燥，喷金，扫描电镜观察黏附的血小板形貌。

1.5.5接触角测定

在室温、空气条件下，利用躺滴法，采用德国的easy-drop型接触角测量仪测定去离子水在样品表面的接触角，将2种样品置于接触角测量仪的样品室，利用微量进样器将0.6μl极性液体去离子水滴于样品表面，接触很短时间，立即采集液滴的图像，利用量角法测得接触角。每个样品取3个平行样品，每个平行样测试4个不同的点，取其平均值。

1.5.6表面张力计算

依据young方程可由液体接触角估算固体的表面张力。根据owens-wendt-kaelble观点，固体总表面张力近似等于固体表面张力的非极性值和极性值的和，即γs＝γs^d+γs^p，并且与接触角的关系见式

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

式(1)中γl是液体的表面张力(mn/m)；γ^dl、γ^pl分别是液体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)；γ^ds、γ^ps分别是固体表面张力的非极性部分和极性部分(mn/m)。因此，测定两个已知γ^dl和γ^pl的探测液体在固体表面的接触角，代入式(1)，联立方程求解可得固体γ^ds、γ^ps和固体的表面张力γs..

界面张力的计算依据owen-wendit方程,计算如下：

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

如表1.7实验用液体表面张力及各分项值。

表1.7实验用液体表面张力及各分项值

1.6细胞相容性实验

试验用细胞系是小鼠成骨细胞mc3t3。使用添加10％胎牛血清、10u/ml氨苄青霉素和100μg/ml硫链霉素的dmem培养液进行细胞。

将制备na-mmt涂层的试样紫外照射消毒至少2h后，置于无菌培养皿中，按浸提液与试样表面积之比为1cm2/ml的比例加入不含血清的dmem培养液，置于37℃、95％相对湿度、5％co2的培养箱中72h，1000rpm离心两次去除合金沉淀物等，得到材料浸提液原液。使用ph计测量浸提液ph值，密封后置于4℃冰箱中保存备用。

将细胞于生长旺盛期用胰酶消化，离心后重悬完全培养液中在计数板上细胞于生长旺盛期用胰酶消化，离心后重悬完全培养液中在计数板上计数，调整细胞浓度至5×10⁴/ml，均匀接种于96孔板中，每组5个复孔，每100μl的细胞悬浮液。置于37℃、95％相对湿度、5％co2的培养箱内24h，待细胞贴壁后，弃掉培养液。阴性对照组中，加入不含浸提液的单纯培养液，试验组加入浸提液，阳性对照组，加入含10％dmso培养液，进行细胞培养。分别在1d、3d、5d三个时间点取出培养板，每孔加入10μlmc3t3，孵育3h后，使用酶标仪(bio-rad680)于450nm下测定每孔吸光度值od值，并计算细胞相对增殖度值，并计算细胞相对增殖度rgr：

rgr(％)＝实验组值/阴性对照组值×100％(2-1)

1.7数据处理

采用spss16.0统计软件对所得数据进行分析，采用平均值x±标准差(sd)记录实验结果，对实验数据结果进行方差分析或t检验，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异非常显著。

2.钠化蒙脱石制备工艺优化及表征

蒙脱石(mmt)是一种片层状硅酸盐，由于其特殊的片层状结构，带电荷的不均匀性及较大的比表面积，在医药上广泛用作乳化剂、助悬剂、增稠剂、吸附剂、缓释载体等。天然蒙脱石层间阳离子通常是ca²⁺、na⁺、k⁺、mg²⁺，可以通过离子交换法制备h⁺、li⁺、nh⁴⁺、k⁺、cu²⁺、na+、al³⁺、fe³⁺等改性蒙脱石。我国天然蒙脱石以钙基蒙脱石为主，存在阳离子交换容低的缺点，为改善这一缺点，常常先进行钠化，即钠化蒙脱石(na-mmt)，然后再进行阳离子交换。本实验以ca-mmt为原料，将氟化钠中的na⁺引入na-mmt的层间，制备钠化蒙脱石(na-mmt)，并对其进行表征，以阳离子交换容为指标，采用响应面法优化工艺条件。本发明为蒙脱石作为载体制备抗菌材料的研究提供理论基础，同时拓宽其应用领域。

2.1响应面模型优化na-mmt制备工艺

2.1.1单因素分析

2.1.1.1氟化钠用量对na-mmt阳离子交换容的影响

氟化钠用量对na-mmt阳离子交换容的影响中随着氟化钠用量的增加na-mmt阳离子交换容也逐渐增加；当氟化钠用量达到4mmol时，na-mmt阳离子交换容达到最大；当氟化钠用量继续增加，阳离子交换容不再继续升高；

2.1.1.2反应温度对na-mmt阳离子交换容的影响

反应温度对na-mmt阳离子交换容的影响中随着温度的升高，ca-mmt的阳离子交换容开始增加，当到达80℃时，na-mmt阳离子交换容达到最大，此后，当温度继续升高，阳离子交换容不再增加。

2.1.1.3反应时间对na-mmt阳离子交换容的影响

反应时间对na-mmt阳离子交换容的影响，随着反应时间的延长，na-mmt阳离子交换容逐渐增加，当反应时间达到4h，na-mmt阳离子交换容达到最大，此后，继续延长反应时间，阳离子交换容基本保持不变。

2.1.2响应面模型设计与结果

线性及三次模型拟合不显著(p>0.05)，二次模型拟合极显著(p<0.01)，因此选用二次多项式模型。系统趋向于选择拥有最大预测决定系数和最小预测残差平方和的模型，即二次多项式模型。

2.1.3建立与检验回归方程

应用design-expert软件对表2.1的实验数据进行回归分析，得到回归模型为：y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²

对上述模型进行方差分析，结果见表2.1。

表2.1回归模型方差分析表

2.1.4回归方程的参数评估与因子效应分析

二次回归模型的参数评估见表2.2，a、b、c、ac、c²达到显著水平，a²、b²为极显著水平，由此可见，氟化钠的量、温度、时间对na-mmt中阳离子交换容有显著影响。综合考虑各因素的影响，3个因素对na-mmt的阳离子交换容的影响次序为：氟化钠用量＞反应温度＞反应时间。

表2.2回归模型系数显著性检验表

2.1.5响应面交互作用分析

2.1.5.1氟化钠的量与反应温度的交互作用

反应时间4.5h时，氟化钠用量、反应温度对na-mmt的阳离子交换容的影响显著，氟化钠用量与温度交互作用不显著。固定反应时间，随着氟化钠用量的增加，na-mmt的阳离子交换容也增大，氟化钠用量达4mmol左右时，阳离子交换容最高；氟化钠用量为4mmol时，随反应温度升高，na-mmt中的阳离子交换容逐渐增加，80℃左右阳离子交换容最高，温度再继续升高，阳离子交换容不再升高，反而有所下降。分析原因可能为在一定的温度范围内，升高温度加快离子交换的反应速度，通过离子交换进入到na-mmt中na⁺增加；但是，温度继续升高，na⁺从蒙脱石中的溶出也会相应增加；另外，na-mmt中na⁺除了离子交换的部分，还有以化学吸附的形式进入si-o四面体和al-o八面体的微孔中少量的na⁺，反应温度升高，这部分na⁺可能出现解吸附，在洗涤过程中去除，导致阳离子交换容下降。

2.1.5.2氟化钠用量与反应时间的交互作用

反应温度80℃时，氟化钠用量、时间显著影响na-mmt的阳离子交换容，二者存在显著的交互作用。固定反应温度，随反应时间增加，na-mmt的阳离子交换容逐渐增加，4.5h时阳离子交换容最高；反应时间为4.5h时，随着氟化钠用量的增加，na-mmt的阳离子交换容逐渐增加，4mmol左右达到最大。分析原因可能随着反应时间的增加，蒙脱石中阳离子交换不断增加，4.5h后ca²⁺、na⁺交换达到平衡，再增加时间，也不会使更多的na⁺进入na-mmt层间。

2.1.5.3.反应时间与温度的交互作用时间

氟化钠用量为4mmol时，反应时间、温度对na-mmt的阳离子交换容有显著影响，但二者无显著交互作用。固定氟化钠浓度，随反应温度的增加，na-mmt的阳离子交换容逐渐增加，80℃时阳离子交换容最高，当反应温度80℃时，na-mmt中的阳离子交换容随时间的增加而逐渐增加，4.5h时阳离子交换容最高，进一步增加反应时间，阳离子交换容不再增加，反而逐渐下降。这是因为随着反应时间的延长，离子交换反应增加，使交换进入na-mmt中na⁺增加，继续延长反应时间na⁺的溶出也会相应增加；另外，si-o四面体和al-o八面体的微孔中吸附少量na⁺可能出现解吸附，导致na-mmt的阳离子交换容下降。

2.2na-mmt的形貌观察

na-mmt电镜下形貌，离子交换前的ca-mmt，镜下可见颗粒较大，聚集成花絮状、团块状聚集体，边缘呈圆盾状、旋涡状、尖角状等形貌。na-mmt镜下形貌，颗粒较细小，很少聚集成团块，颗粒呈不规则形，有的边缘也存在片层状，旋涡状形貌。

本发明以ca-mmt为原料，采用液相离子交换法制备na-mmt抗菌中间体；应用响应面法设计优化条件；采用扫描电镜观察na-mmt形貌；eds、xrd等分析组成及插层机理，得出以下结果

(1)以ca-mmt为原料，采用离子交换法成功制备na-mmt。

(2)单因素试验分析表明，采用na-mmt5g，分别在氟化钠用量为4mmol、温度80℃、反应时间4h时，各自得到最高的阳离子交换容。

(3)采用响应面法，对na-mmt制备工艺进行优化，得到的回归方程为：y＝-1352.84+131.30a-29.12b+10.99c+0.19ab+5.10ac+0.08bc-20.08a²-0.19b²-4.34c²；最佳优化条件：氟化钠为4mmol，温度为80℃，时间为4.5h，此时得到的na-mmt的阳离子交换容达到112mg/g。

(4)na-mmt镜下呈现颗粒细小，很少聚集成团块，颗粒呈不规则形，有的边缘也存在片层状，旋涡状形貌。

3na-mmt涂层的耐蚀性能及降解机理

据统计，我国每年由于疾病、交通事故和运动创伤等造成的骨缺损和缺失患者人数近1000万人，在骨修复手术过程中，骨植入材料起到至关重要的作用。目前，在临床上常用的传统骨科内固定材料主要有不锈钢、钛合金、钴铬钼合金等，虽然，这些材料较广泛地应用于临床，但仍存在弹性模量高于人骨，多数需要二次手术等缺点。因此，发展可降解金属生物材料已成为当前骨植入材料发展的方向，镁合金以其具有可降解性能、良好的生物学特性及力学性能渐渐引起研究人员的关注，大量的基础研究、体外实验、体内植入实验，均取得可喜的成绩。但是，也要看到镁合金作为医用植入材料仍然存在许多问题：镁合金植入材料在人体内含有cl^-离子体液环境中会迅速降解，使之不能维持到骨骼愈合；另外腐蚀产生的物质刺激局部组织出现炎症反应等等。镁合金医用材料的这些缺点严重影响其应用，制约了它的发展。如何减慢镁合金的降解速度，特别是控制其植入初期的降解，使之在体内完成使命后再逐渐降解？目前这一问题成为研究的热点。对镁合金表面进行改性是提高镁合金耐腐蚀性行之有效的方法，不改变镁合金固有的特性，通过调整改性表面的成分和结构控制其腐蚀速率。

天然蒙脱石是由两层硅氧四面体夹一层铝氧八面体构成的层状硅酸盐粘土矿物，是非金属纳米矿物，其钠化后的蒙脱石具有分散能力好、吸附性能及离子交换能力强等优点，加之矿产资源丰富、价格低等，广泛应用于石油化工、冶金、污水处理、农业、医药等行业。

本发明通过水热法在镁合金表面制备na-mmt涂层；电镜观察形貌；eds、xrd分析其组成，探讨涂层形成机理；通过电化学实验、浸泡实验、电镜观察浸泡后形貌及xrd分析涂层的抗腐蚀性能及机理。本发明首次将蒙脱石应用于镁合金表面，为镁合金改性提供新的方法，同时拓宽了蒙脱石的应用领域。

3.1na-mmt涂层的形貌与成分分析

3.1.1na-mmt涂层的电镜形貌及eds分析

az31镁合金表面及截面的电镜形貌如图2所示。图2.1(a)表明az31镁合金表面完全覆盖一层较致密的na-mmt涂层，进一步放大10万倍，见图2.1(b)，涂层呈现典型的mmt特征性的片层状结构。2.1(c)(d)为az31镁合金表面na-mmt涂层的截面图，涂层比较致密，厚度约为42μm，与基体结合紧密，结构形态与表面一致。

图3na-mmt涂层的eds元素组成图，为na-mmt涂层的eds分析，表明涂层中有na、mg、si、o、al等蒙脱石的基本元素，进一步证实镁合金表面的涂层为na-mmt涂层。

3.1.2na-mmt涂层的xrd分析

图4为mmt粉末，镁合金az31基体及其表面na-mmt涂层的xrd图谱。图4(c)显示na-mmt粉末，在衍射角2θ为21.88°和22°处出现了属于蒙脱石的特征峰；图4(a)(b)显示，na-mmt经过水热处理的镁合金xrd图谱在衍射角2θ为21.88°和22°处也出现了属于蒙脱石的特征峰。结果表明，水热法成功地在az31镁合金表面制备了na-mmt涂层。

3.1.3na-mmt涂层的红外光谱分析

na-mmt粉末及na-mmt涂层的ftir表征，na-mmt粉末和na-mmt涂层红外光谱图相似，均有以下吸收带：在高频区na-mmt在3620cm^-1附近为羟基键al-o-h键的伸缩振动；3240cm^-1附近较宽的吸收带为mmt层间水分子及涂层表面的吸附水的h-o-h键的伸缩振动与1644cm^-1附近水分子h-o-h弯曲振动相对应；由于实验材料用的是na-mmt，1420cm^-1附近有较弱吸收峰；1089cm^-1及1038cm^-1附近为si-o-si及si-o的伸缩振动，是蒙脱石的主要吸收带；另外在915cm^-1，850cm^-1，694cm^-1处较弱的吸收带分别为al-oh，mg-oh，si-o-mg的弯曲振动。由此说明，经水热法在az31镁合金表面制备的na-mmt涂层与na-mmt粉末骨架一致，只是各个特征峰的强弱有所不同。以上结果表明，通过水热法可以成功地在az31镁合金表面制备na-mmt涂层，没有破坏蒙脱石的片层结构。

3.2na-mmt涂层形成机理

蒙脱石是2:1型矿物，化学式al2[si4o10](oh)2，基本结构单元就是硅氧四面体和铝氧八面体，单元结构中的层内al³⁺，si⁴⁺等阳离子被mg²⁺，na⁺等阳离子发生部分置换时，首先会引起单元结构层内正电荷减少，必须有吸附在晶体表面和层间的可交换的阳离子来中和；另外还会引起晶层内部和晶层间的电荷不均匀，使负电荷主要集中在铝氧八面体上，它居层间的阳离子较远，吸引力较弱，导致al³⁺，si⁴⁺等阳离子被mg²⁺，na⁺等阳离子发生置换。na-mmt涂层的制备是在碱性环境下，通过水热法制备，na-mmt及镁合金在碱性环境下可能发生以下化学反应：

(1)蒙脱石发生水化反应：

al2[si4o10](oh)2+10h2o→2al(oh)3+4si(oh)4

(2)蒙脱石与naoh的反应:

al2[si4o10](oh)2+2na⁺+2oh^-→2naalsi2o6·h2o

(3)镁合金发生水化反应：

mg+2h2o→mg(oh)2+h2↑

(4)蒙脱石与mg(oh)2的反应：

2al2[si4o10](oh)2+mg²⁺+2oh^-→mg(al2si4o12)·h2o

最终，蒙脱石硅氧四面体表面有活性的oh^-与镁合金水化反应产生的oh^-，在水热条件下，脱去h2o，在镁合金表面形成氧桥，使蒙脱石与镁合金az31紧密结合，形成na-mmt涂层。

3.3na-mmt涂层的耐蚀性能

选用模拟体液为dmem+10％fbs培养液，相对于当前研究所用较多的hank's液和sbf等，主要成分是无机盐离子和葡萄糖，而dmem在上述基础上增加了多种氨基酸，另外血清中含血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素等成分，更贴近人体内环境，以此作为腐蚀介质分析az31基体和na-mmt涂层的抗腐蚀性能，对今后镁合金的体内植入等应用性研究更有参考价值。

3.3.1na-mmt涂层的电化学分析

利用电化学分析技术对az31镁合金及na-mmt涂层在体外模拟腐蚀体系中腐蚀速率进行分析，评估其作为体内可吸收降解医用植入材料的可行性。

3.3.1.1极化曲线

极化曲线反应了电极电位与极化电流或电流密度之间的关系。腐蚀电位(ecoor)的大小反映了材料全面腐蚀反应发生的难易程度：电位越高，耐蚀性越好。腐蚀电流(icorr)大小反映了腐蚀进行的快慢以及腐蚀发生的程度。腐蚀电流越小，则腐蚀速率越小，耐蚀性越好。az31镁合金基体和na-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中36.5℃时的极化曲线图表明，az31镁合金基体的表现最差，腐蚀电位小于na-mmt涂层。表3.1为az31镁合金及na-mmt涂层的自腐蚀电位，腐蚀电流密度，由表可知，na-mmt涂层的az31镁合金基体腐蚀电流密度比az31基体提高了2个数量级，腐蚀速度下降明显。na-mmt涂层可以明显提高az31镁合金的耐蚀性。

表3.1az31基体及na-mmt涂层的自腐蚀电位，腐蚀电流密度

3.3.1.2交流阻抗谱测试

通过交流阻抗法(eis)对na-mmt涂层的性耐蚀进行了进一步分析，结果表明，na-mmt涂层在高频区的容抗弧直径远高于az31镁合金基体，因此其阻抗值na-mmt涂层＞az31，由此表明na-mmt涂层极大地提高了az31镁合金基体的耐蚀性，能更有效地防止各种离子向镁合金基体的扩散、渗透，从而降低az31镁合金基体的腐蚀速率。

3.3.2na-mmt涂层浸泡中的析氢变化

az31镁合金基体及na-mmt涂层在dmem+10％fbs液体中的析氢速率中可以发现，na-mmt涂层的腐蚀速度明显低于az31镁合金基体本身，前24haz31产生氢气的速度较快，平均析氢率约0.07ml·cm^-2·h^-1，而na-mmt涂层产生氢气很少，析氢率较为稳定，平均0.01ml·cm^-2·h^-1，可见na-mmt涂层的存在提高了az31镁合金的抗腐蚀能力。

3.3.3na-mmt涂层浸泡时ph变化

az31镁合金基体及na-mmt涂层在dmem+10％fbs液体浸泡时ph变化可知，同条件下，az31基体在dmem++10％fbs溶液浸泡前5h，ph升高速度快，然后缓慢升高，浸泡24h后ph升高至8.9左右；而na-mmt涂层在dmem+10％fbs溶液浸泡后ph缓慢增加，24h后ph升高至7.82。由此可以看出，na-mmt涂层对az31镁合金基体起到了较好的保护作用，减缓了腐蚀。由于体外模拟实验是不流动的环境，而体内体液及血液是不断更新的，因此在模拟体液不流动条件下中ph升高至7.82，推导至体内流动环境，机体是可以通过肾脏、呼吸等调节代偿体液的酸碱变化，对机体不会产生太大的影响。

3.4na-mmt涂层腐蚀后形貌及成分分析

3.4.1na-mmt涂层腐蚀后宏观形貌

图5为az31镁合金及na-mmt涂层在dmem+10％fbs溶液中浸泡后的宏观形貌。通过az31镁合金浸泡后宏观形貌可以发现，az31在dmem+10％fbs溶液中浸泡1d即出现明显腐蚀，3d出现较浅的腐蚀坑，浸泡20d腐蚀坑明显加深；na-mmt涂层在dmem+10％fbs溶液中浸泡不同时间后的宏观形貌，可以看出1d、3d、5d的na-mmt涂层完整，第10d开始出现涂层有小部分脱落，但脱落后露出的az31基体光滑，浸泡20d涂层脱落逐渐加重，涂层脱落后的az31表面粗糙，镁合金边缘出现少量腐蚀坑，较浅。

由此可见na-mmt涂层在dmem+10％fbs腐蚀介质中对az31镁合金起到一定的保护作用，在浸泡初期可以达到减缓腐蚀的目的，但随着时间的推移，涂层会逐渐脱落，使az31镁合金暴露在液体中，进而被逐渐腐蚀。分析原因可能与涂层的性能有关，na-mmt具有明显的溶胀性，随着在水溶液中浸泡时间的延长，涂层出现溶胀，与az31镁合金基体结合力下降，所以，在基体边缘涂层相对薄弱的地方首先开始脱落。

3.4.2na-mmt涂层腐蚀后电镜形貌及eds分析

图6为az31镁合金在dmem+10％fbs培养液中浸泡1d和3d后的电镜形貌，

图6(a)(b)为az31镁合金浸泡1d的形貌，由于镁合金在dmem+10％fbs溶液中主要发生析氢腐蚀，mg(oh)2等不溶性腐蚀产物生成，局部ph值升高，产物在az31镁合金表面的堆积，az31镁合金表面出现点蚀坑及较浅的腐蚀裂纹。由图6(c)(d)可以看出，随着浸泡时间增加，腐蚀坑及腐蚀裂纹的深度逐渐加深加大且分布不均匀，浸泡3d后镁合金表面变成干涸河床状，腐蚀产物结构疏松，在深坑区域出现部分腐蚀物的脱落。图6(e)(f)(g)(h)为na-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中腐蚀1d和3d后的形貌，浸泡1d后，表面均匀致密的na-mmt涂层变化不明显，但结构不再如以前致密；浸泡3d后，na-mmt涂层仍紧密结合在az31基体上，涂层无脱落。由此进一步证实，na-mmt涂层对az31镁合金基体起到了非常好的保护作用。

图7为na-mmt涂层腐蚀后3d的eds谱图分析，图中显示c、o元素含量较高，主要因为浸泡实验在dmem+10％fbs液体中进行，溶液中存在多种氨基酸及少量蛋白质，na-mmt涂层会吸附一部分氨基酸，使镁合金表面c、o元素含量增高，而na、mg、si、o、al元素的大量存在印证了na-mmt涂层的存在，说明3d后，na-mmt涂层仍然覆盖在镁合金表面。

3.4.3腐蚀后xrd

az31镁合金及na-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中浸泡3d的xrd分析结果中。很明显，在浸泡3d之后，na-mmt涂层xrd显示，mmt的特征峰仍然存在，两种试样浸泡3d后产生的腐蚀产物主要均为mg(oh)2，其中涂层产生的mg(oh)2量较少，无其它产物形成。由此说明，浸泡3d，na-mmt涂层比az31镁合金基体耐腐蚀。

3.4.4腐蚀后红外光谱分析

na-mmt涂层浸泡后ft-ir图谱中显示在3620cm^-1附近为羟基键al-o-h键的伸缩振动、1420cm^-1附近有较弱吸收峰；1089cm^-1及1038cm^-1附近为si-o-si及si-o的伸缩振动，915cm^-1，850cm^-1，694cm^-1处较弱的al-oh，mg-oh，si-o-mg弯曲振动均显示蒙脱石的特征峰均在，说明涂层仍存在；涂层浸泡后各组红外图谱均在1408cm^-1，1366cm^-1处出现弱的coo-的不对称和对称吸收带，可能为na-mmt吸附dmem中的少量氨基酸所致。

3.5na-mmt涂层耐腐蚀机理

通过对na-mmt涂层的性质分析，电化学测试，腐蚀前后形貌及eds分析、xrd、ft-ir等综合分析，总结na-mmt涂层的耐腐蚀机理如下：

第一，na-mmt涂层的屏障作用，电镜观察到na-mmt涂层比较致密，与az31镁合金表面结合较紧密，厚度达到42μm，能有效防止氯离子等腐蚀性离子的入侵，提高az31镁合金的耐蚀性。

第二，na-mmt的吸附作用及离子交换作用，氨基酸的活性基团可以通过静电吸引、疏水作用、共价键以及氢键等方式与na-mmt发生吸附，通过coo^-与蒙脱石端面正电基团间的静电作用力吸附氨基酸两性离子；通过nh³⁺与蒙脱石层间基面氧原子形成氢键吸附氨基酸正离子，减少了镁合金与dmem中的氯离子的吸附，提高az31镁合金的耐蚀性。

第三，腐蚀产物的保护作用，涂层在浸泡过程中也会有很慢的腐蚀，产生的mg(oh)2沉积在na-mmt涂层表面，成为保护膜的一部分。

本发明通过水热法成功地在az31镁合金表面制备了na-mmt涂层，该涂层的性质与na-mmt相同。

(1)na-mmt涂层结构致密，与基体结合紧密，高倍镜下呈现片层状结构，na-mmt涂层约42μm厚。形成机理如下：蒙脱石硅氧四面体表面有活性的oh^-与镁合金水化反应产生的oh^-，在水热条件下，脱去1分子h2o，在az31镁合金表面形成氧桥，使na-mmt与az31镁合金紧密结合，形成na-mmt涂层

(2)az31镁合金表面na-mmt涂层腐蚀电流密度比az31基体提高了2个数量级，eis图中半圆直径远大于基体，腐蚀速度明显下降。

(3)az31镁合金表面na-mmt涂层在dmem+10％fbs培养液中浸泡1d后，电镜观察表面均匀致密的na-mmt涂层变化不明显，但结构不再如以前致密。浸泡3d后，na-mmt涂层仍紧密结合在az31镁合金基体上，涂层无脱落。xrd、ft-ir也同时印证，由此可见na-mmt涂层延缓了az31镁合金基体的降解，提高了耐蚀性。

(4)由以上实验可得出na-mmt涂层的耐腐蚀机理可能为na-mmt涂层的屏障作用、吸附作用及离子交换作用、腐蚀产物的保护作用共同作用的结果。

4、na-mmt涂层的体外血液相容性

当今时代，现代医学和材料学的发展十分迅猛，生物医用材料己逐渐在骨外科、口腔科、心血管科等临床治疗中发挥着重要的作用。在各国生物医用材料分析中，生物学评价是最基本的环节，也是对人体安全性的重要保证。生物相容性是指生物医用材料应用于生物体内，所产生的宿主反应是可接受的，并能起到有效治疗作用，它反映了材料与活体组织或系统相互作用的生物学行为，包括血液相容性、组织相容性。生物医用材料与血液接触时，两者相互作用，血液中的各种成分及功能不可避免会受到影响。但是，具有良好血液相容性的生物医用材料对血液成分及功能影响较小，不会造成凝血、溶血等损害。本发明在az31镁合金表面制备了na-mmt涂层，提高了耐蚀性，比较适合骨科固定材料。下面对两种涂层进行体外溶血实验、血细胞计数实验、动态凝血时间实验、凝血酶原时间、血小板黏附实验，以考察na-mmt涂层的az31镁合金的血液相容性；同时，通过测定浸提液中镁离子浓度、ph、镁合金及涂层的接触角等，探讨涂层提高az31镁合金血液相容性的机理，为其在医学领域的应用提供理论依据。

4.1体外血液相容性

4.1.1溶血实验

溶血，即红细胞破裂，血红蛋白外逸，亦称为红细胞溶解。在临床上，引起溶血的因素很多，可分为内源性因素与外源性因素。其中，内源性因素包括溶血性细菌侵入抗原-抗体反应、各种机械损伤、红细胞内在(膜、酶)缺陷、药物作用等；外源性因素主要有低渗溶液、机械强力振荡、突然低温冷冻、过酸或过碱等。溶血率实验是一项常用的检验植入材料血液相容性的方法，由于其能敏感的反应材料对红细胞的影响，所以被公认为是评价长期植入骨、软组织及血液环境中的生物材料的安全性的指标之一。iso标准规定，如果材料与血液接触后的溶血率小于5％，则符合溶血率要求；如果材料与血液接触后溶血率大于5％，则预示着材料有溶血作用。本发明试验采用体外非直接接触法-利用和材料充分接触的浸提液来与新鲜血液接触，考察由材料释放出的离子对红细胞有无溶血作用。

az31镁合金、na-mmt涂层的血红蛋白吸光值及溶血率实验的结果表明；az31的溶血率为41.62％，大于5％，发生了明显溶血现象；na-mmt涂层的溶血率为4.81％，小于5％，无明显溶血现象，溶血率达到了生物材料要求的标准。显然，在az31镁合金表面制备了na-mmt涂层后明显提高了az31镁合金的血液相容性。

4.1.2血细胞计数实验

血液是由血浆和血细胞组成的流体组织，在心血管系统内循环流动,起着运输物质的作用，血细胞可分为红细胞、白细胞和血小板三类，各自执行着相应的功能。生物材料的血液相容性包括对血液成分及功能无明显影响，即：不会造成红细胞、白细胞及血小板的明显减少。本文对az31镁合金、na-mmt涂层进行体外血细胞计数实验。结果为三种样品在血液中浸泡30min后，血小板减少分别为(1.26±0.56×10¹⁰/l、1.71±0.53×10¹⁰/l、)，红细胞减少分别为(1.15±0.80×10¹¹/l、1.61±0.75×10¹¹/l、)及白细胞减少分别为(0.17±0.02×10⁹/l、0.21±0.08×10⁹/l、)，三种血细胞的数量稍有所下降，但均在正常范围内。经spss16.0软件进行方差分析，posthoctests结果为；az31镁合金、na-mmt涂层在血液中浸泡30min后，三种血细胞减少均无统计学意义(p>0.05)。

综合来看，az31镁合金比na-mmt涂层造成的血细胞的减少明显，但数据经过方差分析两两比较均无显著性意义(p>0.05)。说明三种样品对血液中红细胞、白细胞、血小板影响不大，即na-mmt涂层后的az31合金对血细胞无明显影响。

4.1.3动态凝血时间实验

体外动态凝血时间实验常用来检测内源性凝血因子被激活的程度，以观察材料对人体血液凝血时间的影响。体外动态凝血时间曲线反映血液在材料表面的凝固趋势和凝血时间的长短，可以比较各种材料对凝血因子的激活程度,凝血程度越小，材料的血液相容性越好。为了方便比较对不同材料的抗凝血性能，人为地把纵坐标吸光度值为0.100时的时间定义为材料的凝血时间。

从az31镁合金、na-mmt涂层的动态凝血时间曲线发现，2条曲线随着与血液接触时间的增长，材料的od值逐渐减小，最终趋于平缓。在达到0.10吸光值时，az31所用时间较短，时间较长的是na-mmt涂层。na-mmt涂层的曲线经历时间长，呈缓慢向下倾斜形状，抗凝血性能均优于az31。综合而言，na-mmt涂层提高了az31镁合金的抗凝血性能。

4.1.4血小板黏附实验

血小板是由红骨髓中巨核细胞破碎后形成的一种无色、体积小、形态不规则的小体，生物材料与血液接触后，表面吸附一定量的纤维蛋白原，同时结构发生变化，血小板会黏附在纤维蛋白原周围，聚集、释放大量的凝血活性因子，使凝血酶原转变为凝血酶，凝血酶会激活新的凝血因子，如此循环发生凝血反应，形成血栓。因此，生物材料表面血小板黏附的数量和激活状态是血液相容性中抗凝血性能最基本的评价指标之一。血小板黏附愈少，变形越少，则血液相容性愈好。

从eds点扫箭头所指部位，显示出有s、c、o等元素成分，结合形貌确定为血小板；从sem图中可以看到na-mmt涂层表面黏附有很少的血小板，血小板形状不规则，但都没有伪足，表明血小板没有被激活，表现出了良好的抗血小板黏附性能。

4.2血液相容性机理

4.2.1浸提液mg²⁺浓度及ph的影响

本实验对溶血实验中材料浸提液中的mg²⁺浓度及ph进行检测，结果见表4.1。由表4.1可以明显看出，az31镁合金在生理盐水中浸提30min后，mg²⁺浓度为38.23±2.96，是正常人血清mg²⁺浓度的35倍多，na-mmt涂层浸提液中mg²⁺浓度略高于人血清正常值；az31镁合金出现溶血，溶血率41.6％，而na-mmt涂层未发生溶血，溶血率分别为4.81％，均小于5％。另外，由表4.1可知，az31镁合金浸提液ph为8.25±0.77，明显碱化，高于机体可以代偿的水平，而na-mmt涂层浸提液中ph无明显改变，仍在正常人体体液的ph范围内。

表4.1各组浸提液mg²⁺浓度及ph值

4.2.2接触角测定

4.2.2.1材料与去离子的接触角测定

材料的亲水性与人体对这种材料的相容性呈正相关，亲水性越高，材料的生物相容性越高。由于血液及组织液中主要组成是水，因此材料的接触角测定采用材料与水的接触界面进行测定。材料的接触角测定一定程度上反映了材料亲水性，比较az31镁合金、na-mmt涂层后材料的接触角，去离子水滴滴到az31镁合金基体表面，球形水滴较快变成半球形，平均接触角为60.43±3.38；滴到na-mmt涂层时，球形水滴迅速浸润，na-mmt涂层后接触角比az31镁合金基体减小；接触角数据见表4.2，na-mmt涂层后接触角与az31镁合金进行比较p<0.05，有显著性意义；由此说明，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层后，提高了材料的亲水性能，两种涂层之间亲水性相似，无明显差别。由此可知，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层，材料的接触角减小，亲水性提高，故血液相容性提高。

表4.2材料的接触角测定

4.2.3表面张力及界面张力的计算

根据公式：

r＝2kη/2γlcos0°＝2kη/γl(1)

γl(1+cosθ)＝2(γ^ds×γ^dl)^1/2+2(γ^ps×γ^pl)^1/2(2)

γsl＝[(γ^pl)^1/2-(γ^ps)^1/2]²+[(γ^dl)^1/2-(γ^ds)^1/2]²(3)

γs＝γs^d+γs^p

可计算得az31、na-mmt涂层及na-mmt涂层的表面张力与界面张力,计算结果见表4.3：

表4.3不同样品表面张力、各分项值和界面张力

由表4.3可知，az31镁合金、na-mmt涂层的色散力分量γ^ds相差不明显，而两种涂层的极性分量γ^ps均明显大于az31镁合金，即na-mmt涂层表面张力高于az31镁合金。γ^ps是影响材料血液相容性的重要因素，γ^ps的增加提高了材料的润湿性，另一方面使材料优先吸附白蛋白，改善材料的血液相容性。由表4.3还可看出，na-mmt涂层的界面张力值小于az31基体。即材料的界面能较小，因而na-mmt涂层样品比az31镁合金基体具有更优的血液相容性。

如前面所述表面张力是分子色散力和极性力的共同作用的结果。提高样品表面色散力，能够提高表面吸附蛋白质层的稳定性，进而提高材料表面的血液相容性。

极性力分量γ^ps/γs是一项生物材料血液相容性的决定性因素，提高极性分量(γ^ps/γs)能够促进血浆白蛋白在表面的吸附，而色散力分量(γ^ds/γs)越高则会优先吸附纤维蛋白。白蛋白减少与血小板形成复合体，能够减少凝血现象的发生，而纤维蛋白原在材料表面蛋白吸附和血栓形成方面起着非常重要的作用，它与血小板形成复合体，加速凝血作用，纤维蛋白原转化为纤维蛋白包裹住血液中的某些成分，导致血栓形成。因此极性力分量越高，材料表面的血液相容性越优。材料与血液之间的界面能较小的时候，材料表面不易于吸附纤维蛋白，且吸附的蛋白层只会产生很少的构象变性，这样的材料有效抑制血小板的激活、团聚及变形，具有良好的血液相容性。

4.3细胞相容性实验

将az31和na-mmt涂层的az31合金制成浸提液，进行小鼠成骨细胞mc3t3细胞毒性实验。结果表明，az31浸提液与阴性对照组相比细胞毒性相对较高，严重抑制了mc3t3细胞的增殖活动；na-mmt涂层的az31合金对细胞没有毒性影响，并且在培养第一天时，na-mmt涂层的az31合金表现出对mc3t3细胞生长的促进作用。

本发明分析了az31镁合金及在其表面制备的na-mmt涂层对血液中红细胞、白细胞、血小板等的影响，通过溶血率、血细胞计数、体外动态凝血试验、血小板黏附试验评估了涂层的血液相容性，并通过测定材料浸提液中mg²⁺浓度、ph值及材料的接触角分析溶血及血小板黏附试验的机理，通过细胞培养实验评估涂层对细胞生长的影响，得出以下结论：

(1)az31镁合金表面制备了na-mmt涂层后溶血率明显下降，均低于5％，达到医用生物材料对血液溶血率的要求，生物相容性提高，即na-mmt涂层提高了镁合金植入体内的生物安全性。

(2)通过接触角测定表明在az31镁合金表面制备na-mmt涂层后材料的接触角明显减小，亲水性增加，是涂层提高了镁合金血液相容性的机理。

(3)细胞培养实验证明na-mmt涂层，对mc3t3细胞细胞无毒性作用，还能促进mc3t3细胞的增殖。

5、结论

本发明以ca-mmt为原料，采用离子交换法，制备na-mmt；然后，利用水热法，在az31镁合金表面制备na-mmt涂层；分析了涂层的结构、组成、形成机理及在dmem+10％fbs溶液中的降解行为和耐腐蚀机理；采用测定溶血率、动态凝血时间，血小板粘附实验、接触角计算等研究na-mmt涂层的血液相容性；通过细胞培养实验，分析na-mmt涂层的细胞相容性，得出以下结论：

(1)以阳离子交换容为指标，在单因素实验的基础上，采用响应面法优化na-mmt制备工艺条件。最终的优化工艺为：氟化钠为4mmol，温度为80℃，时间为4.5h，阳离子交换容达到112mg/g。由此工艺获得的na-mmt电镜下呈不规则状，很少聚集。

(2)利用水热法，将na-mmt成功负载到az31镁合金表面。na-mmt涂层耐蚀能力较好，延缓了az31镁合金在模拟体液中的降解。

(3)az31镁合金表面的na-mmt涂层具有较好的血液相容性，同时促进骨细胞增殖。分析其机理可能与涂层降低了az31镁合金表面的接触角，使其表面张力下降有关。

综上所述，利用ca-mmt制备na-mmt，将na-mmt成功负载到az31镁合金表面，na-mmt涂层延缓了镁合金基体的降解，提高了镁合金的血液相容性，同时促进骨细胞的增殖。由此推断，具有na-mmt涂层的az31镁合金有望成为较好的功能性医用植入材料。

本发明利用水热法，在az31镁合金表面制备了na-mmt涂层，系统地分析了涂层的形成机理、结构形貌、在模拟提液中的降解及耐蚀性机理，认为na-mmt涂层有效地控制了镁合金的降解，此方面研究尚未见报道。

本发明利用水热法，在az31镁合金表面制备了na-mmt涂层，在耐蚀性实验及血液相容性研究的基础上，首次对az31镁合金表面na-mmt涂层进行细胞相容性进行分析，认为制备的na-mmt涂层具有较好促进骨细胞生长的能力。

本发明首次系统地分析na-mmt的体外血液相容性及细胞相容性，分析了na-mmt涂层降低az31镁合金溶血率的机理，为mmt应用到镁合金表面后制备医用植入材料，评价其生物安全性提供依据。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。