一种复合胶原蛋白组织再生膜及其制备方法与流程

本发明属于医用材料技术领域，主要用于引导组织再生，防止组织粘连。是一种医用膜材料，可用于口腔科或神经外科等医学科室。

背景技术：

20世纪80年代兴起的引导组织再生技术(guidedtissueregeneration，gtr)是指：用外科手术的方法在创伤区放置生物膜，隔离周围的软组织向骨面生长，并形成一定空间诱导膜细胞冠向移动并生长分化，实现再生。

在成骨过程中具有成骨潜能的细胞会向缺损区生长、移行的速度慢于周围的结缔组织，导致伤口无法愈合。gbr(guidedboneregeneration)引导骨再生技术，采用生物膜阻挡周围软组织的成纤维细胞进入骨缺损区，保护缺损区具有成骨能力的血凝块的稳定，维护血块充填的间隙，最终实现缺损区的骨修复再生。这项技术所需的膜要求既能够生物降解可吸收，又能够抵抗酶降解作用，在体内维持6个月以上的隔离功能。

隔离膜材料是实现gtr或gbr技术的关键所在。由于同种异体组织这类材料来源有限，受到伦理道德的限制，且具有潜在感染病毒性疾病的可能，现已禁用。也有研究用生物材料制成人体脑膜的替代物人工硬脑膜(artificialduramater)。

成功的gtr/gbr技术有两个临床要点：①要保留独立的组织再生空间。②要保证充足的时间。这两个要点的实现都离不开可吸收生物修复膜。由此可见可吸收生物修复膜是gtr/gbr技术中的一个关键部分。应用于gtr/gbr的可吸收生物修复膜是一类具有选择性阻挡软组织进入骨缺损空间，同时又不妨碍创口自然愈合的具有生物相容性的膜材料。

隔离膜材料大致分为不能吸收与能吸收两类。

不能吸收的膜有金属或高分子化合物，如金箔、银箔、不锈钢片、橡皮膜(最早被应用)、塞路璐膜、尼龙、维尼龙、特氟龙(聚四氟乙烯)、涤纶硅橡胶膜。其缺点是不能被吸收，永久存在于体内，会产生不同程度的结缔组织增生包裹。

能吸收的隔离膜，包括自体移植物和异体移植物，如颞肌筋膜、颅骨骨膜、纤维蛋白膜、尿囊膜、羊肠膜、死人的硬脑膜、牛肌腱的炮制膜，牛心包膜及胎膜。其缺点是会引起不同程度的炎性反应和排斥反应，造成纤维性变和与脑粘连。且牛心包、猪腹膜在去除异种蛋白抗原性时运用的戊二醛会在材料中残留部分醛基，不易彻底清除，从而阻碍细胞侵入植入组织，具有一定毒性，存在异物反应可能。

中国专利cn201410671874公开了一种可吸收抗菌类骨结构的引导组织再生膜的制作方法，它是由从牛身上获取的新鲜牛心包膜与四肢管状骨处理得到单层膜，再由两种膜复合而来。反复冻融与表面活性处理获得的脱细胞牛心包胶原纤维膜以及edta脱钙与表面活性处理获得脱矿脱细胞牛层状骨胶原纤维膜，需完整保留两种膜的结构，两种膜经过电泳矿化获得具有一定的硬度的类骨结构矿化胶原纤维膜。浸入米诺环素溶液获得抗菌类骨结构的矿化胶原纤维膜。具有承载药物与隔离的功能。这类膜的强度很好，但抗免疫性能差。

cn104857561a公开了一种高强度仿生胶原膜，通过梯度透析方法似的胶原蛋白分子重新便成为有序排列结构，形成更一致、更广泛的胶原纤维取向，从而提高材料的力学性能。

去端肽胶原蛋白可吸收引导组织再生膜，从分子层面上去除免疫排斥的缘由。只要去除端肽就认为是去除了其免疫原性，被认为是安全的。采用酶切技术，可吸收生物修复膜在生产过程中，去除了c、n两端具有免疫原性的端肽，同时保留胶原蛋白的三螺旋结构，获得具有高度重复结构的无免疫原性胶原蛋白单体。中国专利申请cn200410101597.5公开了利用胶原蛋白的这一特性制备的膜，特别柔软，具有很好的贴服性，没有免疫性，可作为可吸收的医用隔离膜材料。使用牛肌腱组织为原料，经过酶处理以及化学交联，冷冻干燥得到一种具有孔隙、海绵状医用胶原蛋白材料，具有一定的强度，可以用作肌腱或是韧带缝合手术后防止肌腱与韧带粘结的可降解隔离膜。但是，这种材料的强度达不到支撑软组织并创建骨组织生长空间的程度，会塌陷。

中国专利申请cn201510725936.5公开了一种促进p15植骨材料成骨可吸收的引导组织再生膜，由高分子膜材料与所承载的药物组成。该膜的高分子膜材料是由制备的i型胶原蛋白乙酸溶液与硫酸软骨素以及药物按照一定的比例组成，并通过压片制成膜，两层薄膜中间喷涂胶原蛋白乙酸溶液与硫酸软骨素的混合溶液，干燥，交联经过化学灭菌得到产品。具有屏障与承载药物的功能。但是它的力学性能差，降解时间过短，吸水后的形变大。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种组织再生膜，同时具备优良的抗排斥免疫性能和优良的力学性能，吸水后膨胀很小，避免引起组织肿胀，且能够负载药物，降解速度与组织生长的速度匹配。

本发明的另一目的在于提供一种高强度的组织再生膜的制备方法，该方法简单、环保，适合工业生产。

针对上述问题，本发明采取了如下解决方案：

一种复合的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白或胶原蛋白复合材料作为基体，其特征在于，增强体为交联的胶原蛋白海绵或交联的胶原蛋白复合海绵。

一种双重交联胶原蛋白组织再生膜，是在上述的基体和增强体复合完成后，再经过一次物理或化学交联处理，所得的产品即为双重交联胶原蛋白组织再生膜。

本发明的膜的一个表面是光滑面，另一个表面为粗糙面，所述的粗糙面来自于交联的胶原蛋白海绵或交联的胶原蛋白复合海绵的多孔结构。

所述的复合的胶原蛋白组织再生膜，吸水后具有高的湿态抗张强度，能满足医用缝合的要求，湿态抗张强度为10mpa以上，进一步的可以达到30mpa以上，更优选40mpa以上。能满足神经外科脑部手术时的缝合要求，在膜被组织吸收之前不会破裂。

所述的胶原蛋白复合材料为胶原蛋白与壳聚糖、透明质酸钠、硫酸软骨素中的一种或多种复合后的材料。

本发明还提供了复合的胶原蛋白组织再生膜的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1：胶原蛋白凝胶的制备，哺乳动物的皮毛或是肌腱脱脂，酶解，离心，盐析、透析得到胶原蛋白凝胶；

步骤s1-1：取牛、马、猪、羊、鱼等哺乳动物皮的皮肤或是肌腱，去除毛发、筋膜，切片，加入脱脂酶或有机溶剂，然后在纯化水中漂洗1～24h，脱去油脂，灭活；所述的有机溶剂为甲氯、丙酮、乙醇、正丁醇中的一种，其中的甲氯为甲醇和氯仿按照体积比为1：3配制的溶剂。

步骤s1-2：将步骤s1-1所得脱脂溶液加入到ph值为1～5的酸溶液中，加入蛋白酶在0～25℃温度下酶解1～96h，去除胶原蛋白的免疫性；

所述的酸溶液为：盐酸、醋酸、柠檬酸、硫酸、磷酸中的一种或是多种制成的溶液。所述的蛋白酶为胃蛋白酶胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、无花果蛋白酶等的一种或是多种。

步骤s1-3：将步骤s1-2所得的酶解溶液使用离心机离心，取上清液，使用碱溶液调节ph值为5～8，使用盐溶液盐析出可溶性去端肽胶原蛋白；所述的盐溶液为以下盐的溶液：硫酸钾、氯化钾、硝酸钾、硫酸钠、氯化钠、硫酸钠的一种或多种；所述的碱溶液中的碱为naoh、koh中的一种或多种。

步骤s1-4：选择透析袋，将步骤s1-3所得去端肽胶原蛋白溶液装入透析袋中，将其密封进行三层梯度透析，透析时间都为2-7天，温度都为0～25℃，每天更换交换透析液的次数在1～10次，通过透析过程，分子重新变成有序排列的结构，具有更一致、更广泛的胶原纤维取向，透析得到去端肽胶原蛋白凝胶；所述的三层梯度透析的ph依次为ph1～4、ph4～6、中性溶液。

步骤s2：胶原蛋白海绵的制备，使用步骤s1-4所得去端肽胶原蛋白凝胶用酸溶液配制，平铺在模具中，冷冻干燥成海绵，物理或是化学交联成一重的海绵；

步骤s2-1：配液，使用盐酸或是稀盐酸为溶剂，配制胶原蛋白溶液，或是胶原蛋白与生物高分子复合溶液；其中的生物高分子可以是壳聚糖、透明质酸钠、硫酸软骨素中的一种或是多种。

步骤s2-2：灌装，并冷冻干燥。将步骤s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展开铺平，然后冷冻干燥成胶原蛋白海绵或是复合胶原蛋白海绵；

上述步骤中的冷冻条件为：冷冻温度为-80℃～-20℃，冻干时间为15～36h，模具底部可以带有一定的纹路。

步骤s2-3：交联，采用物理或是化学的方法对步骤s2-2所得的海绵进行交联，得到一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵；

上述步骤中的物理交联方法为：紫外辐射、热脱氢法、辐照灭菌等，化学交联方法为：采用碳化二亚胺、二胺、环氧化合物、羟基琥珀酰亚胺、二苯基磷酸盐(dppa)、戊二醛、甲醛、乙醛酸、京尼平进行交联。

步骤s3：双重交联胶原蛋白骨组织再生膜的制备，海绵浸入胶原蛋白凝胶，干燥，物理或是化学交联，得到双重交联胶原蛋白骨组织再生膜；

步骤s3-1：灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，干燥成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵；

上述步骤中的干燥条件为：温度为0～70℃，时间为8～96h。

步骤s3-2：交联，采用物理或是化学的方法进行交联，得到双重交联的胶原蛋白组织再生膜。

如果步骤s2-3与步骤s3-2中的任何一步使用了化学交联，那么还有步骤s3-3，使用溶液脱洗程序去除交联剂的残留，脱洗程序中使用脱洗液为纯化水、生理盐水、ph为中性的磷酸盐缓冲液、乙醇中的一种。

本发明的复合胶原蛋白组织再生膜具有粗糙面与光滑面，其中的粗糙面，用于诱导骨再生，是成骨细胞的粘附和骨的沉积附着的载体，使具有骨生成能力的细胞先长入缺损区，进而增值分化成骨细胞。光滑面用于阻隔结缔组织细胞迁移，阻止结缔组织进入骨缺损区，起到隔离作用。

复合胶原蛋白组织再生膜的机械强度佳，湿态抗张强度可达40mpa，可以对抗来自软组织的压力，将上皮细胞和成纤维细胞阻挡于缺损外，使病损区与周围组织隔离使膜下血凝块内的血小板及纤维蛋白得到保护，为生长因子释放、聚集与分布提供有力的环境，保证了骨组织的再生。

复合胶原蛋白组织再生膜的主要成分为ⅰ型胶原蛋白具有特殊的紧密三股螺旋结构，不能被一般蛋白酶水解，只有胶原蛋白酶作用于胶原蛋白分子的一定位点，才能使其断裂变性，胶原肽链的断裂，造成其螺旋结构的破坏。这样胶原就可以被蛋白酶彻底水解。胶原蛋白酶成为体内胶原降解的关键所在。脊椎动物体内的许多上皮组织如皮肤伤口、牙龋、角膜、以及中耳炎引起的胆脂瘤中都含有胶原酶，骨和子宫中也存在胶原酶。许多间充质细胞衍生的组织，如关节滑膜、粒细胞和成纤维细胞也都能产生胶原酶，当伤口愈合时，再生表皮组织及间充质组织都具有较强的胶原分解能力，为上皮再生创造了条件。

本发明的组织再生膜的吸收降解时间为四个月左右，与人体骨组织复建的时间基本一致，在骨组织生长完成前，能起到隔离软组织与骨组织的作用，等到骨组织生长完成后，组织再生膜被吸收完毕，隔离作用消失，骨组织和其周围组织的关系恢复到患病前的健康状态。

本发明的组织再生膜可以灵活使用其来承载药物，方便实惠。

本发明的组织再生膜具有不超过200％的膨胀率，用于人体后，可以有效避免组织肿胀，减少异物感，降低感染发生的几率。

本发明的组织再生膜通过高分子纤维与胶原蛋白进一步复合，可进一步提高强度。

纤维网复合组织再生膜，可以用作生物疝补片，修补腹腔沟疝，实现疝补片与人体组织的无缝结合，有效的减轻免疫作用。

纤维网复合组织再生膜，可以用作伤口敷料，引导组织愈合，吸取组织残液，保护伤口。纤维网复合组织再生膜，纤维网可以选择与胶原蛋白海绵的粗糙面复合，保留光滑面。反之选择与胶原蛋白海绵的光滑面复合，保留粗糙面。二者的功效是有区别的，保留的光滑面具有提供肌肉组织平滑运动时不会受阻，为肌肉组织细胞生长附着提供平台。粗糙面为骨细胞的生长提供生长的平台。

附图说明

图1为实施例5所得的双重交联的胶原蛋白组织再生膜的光滑面。

图2为实施例5所得的双重交联的胶原蛋白组织再生膜的粗糙面。

图3为实施例5所得的双重交联的胶原蛋白组织再生膜的断面sem图。

具体实施方式

实施例1：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白海绵为增强体。二者复合后，再进行一次交联。其制备方法为：

步骤s1：胶原蛋白凝胶的制备：

步骤s1-1：取猪皮，去除毛和筋膜，切片，加入脱脂酶，然后在纯化水中漂洗1h，脱去油脂，灭活；

步骤s1-2：将步骤s1-1所得脱脂溶液加入到ph值为4的柠檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃温度下酶解20h；

步骤s1-3：将步骤s1-2所得的酶解溶液使用离心机离心，取上清液，使用氢氧化钠溶液调节ph值为6，使用硫酸钾溶液盐析出可溶性去端肽胶原蛋白；

步骤s1-4：将步骤s1-3所得去端肽胶原蛋白溶液装入透析袋中，将其密封进行三层梯度透析，透析时间为2天，温度都为25℃，每天更换交换透析液的次数在3次，得到去端肽胶原蛋白凝胶；所述的三层梯度透析的ph依次为ph2、ph3、中性溶液。

步骤s2：胶原蛋白海绵的制备：

步骤s2-1：配液，使用盐酸为溶剂，步骤s1-4中的去端肽胶原蛋白为溶质，配制胶原蛋白溶液；

步骤s2-2：灌装，并冷冻干燥，将步骤s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展开铺平，然后冷冻干燥成胶原蛋白海绵或，冷冻温度为-80℃，冻干时间为15h；

步骤s2-3：交联，采用热脱氢法对步骤s2-2所得的海绵进行交联，得到一重交联的胶原蛋白海绵；

步骤s3：双重交联胶原蛋白骨组织再生膜的制备：

步骤s3-1：灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在70℃干燥8h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是一重交联的胶原蛋白海绵；

步骤s3-2：交联，采用紫外辐射法进行交联，得到双重交联的胶原蛋白组织再生膜。

对所得试样进行测试。

实施例2：

一种复合的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，增强体为交联的胶原蛋白海绵。其制备方法为：

步骤s1：胶原蛋白凝胶的制备：

步骤s1-1:取猪皮，去除毛和筋膜，切片，加入脱脂酶，然后在纯化水中漂洗24h，脱去油脂，灭活；

步骤s1-2：将步骤s1-1所得脱脂溶液加入到ph值为5的柠檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃温度下酶解20h；

步骤s1-3：将步骤s1-2所得的酶解溶液使用离心机离心，取上清液，使用氢氧化钠溶液调节ph值为6，使用硫酸钾溶液盐析出可溶性去端肽胶原蛋白；

步骤s1-4：将步骤s1-3所得去端肽胶原蛋白溶液装入透析袋中，将其密封进行三层梯度透析，透析时间为3天，温度都为25℃，每天更换交换透析液的次数在3次，得到去端肽胶原蛋白凝胶；所述的三层梯度透析的ph依次为ph1、ph4、中性溶液。

步骤s2：胶原蛋白海绵的制备：

步骤s2-1：配液，使用盐酸为溶剂，步骤s1-4中的去端肽胶原蛋白为溶质，配制胶原蛋白溶液；

步骤s2-2：灌装，并冷冻干燥，将步骤s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展开铺平，然后冷冻干燥成胶原蛋白海绵或，冷冻温度为-20℃，冻干时间为36h；

步骤s2-3：交联，采用辐照灭菌法对步骤s2-2所得的海绵进行交联，得到一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵；

步骤s3：复合胶原蛋白组织再生膜的制备：

灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在30℃干燥50h成膜，得到复合的胶原蛋白组织再生膜，其基体材料是非交联的胶原蛋白，增强体是一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵。

对所得试样进行测试。

实施例3：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白海绵为增强体。二者复合后，再进行一次交联。其制备方法为：。

步骤s1：胶原蛋白凝胶的制备：

步骤s1-1:取牛皮，去除毛和筋膜，切片，加入脱脂酶，然后在纯化水中漂洗12h，脱去油脂，灭活；

步骤s1-2：将步骤s1-1所得脱脂溶液加入到ph值为5的柠檬酸溶液中，加入枯草杆菌蛋白酶，然后在25℃温度下酶解96h；

步骤s1-3：将步骤s1-2所得的酶解溶液使用离心机离心，取上清液，使用氢氧化钠和氢氧化钾的混合溶液调节ph值为8，使用硫酸钾和硝酸钾的混合溶液盐析出可溶性去端肽胶原蛋白；

步骤s1-4：将步骤s1-3所得去端肽胶原蛋白溶液装入透析袋中，将其密封进行三层梯度透析，透析时间为7天，温度都为25℃，每天更换交换透析液的次数在3次，得到去端肽胶原蛋白凝胶；所述的三层梯度透析的ph依次为ph4、ph6、中性溶液。

步骤s2：胶原蛋白海绵的制备：

步骤s2-1：配液，使用盐酸为溶剂，步骤s1-4中的去端肽胶原蛋白为溶质，配制胶原蛋白溶液；

步骤s2-2：灌装，并冷冻干燥，将步骤s2-1所得的溶液注入模具，模具底面具有一定的纹路，展开铺平，然后冷冻干燥成胶原蛋白海绵或，冷冻温度为-60℃，冻干时间为20h；

步骤s2-3：交联，采用紫外辐射法对步骤s2-2所得的海绵进行交联，得到一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵；

步骤s3：胶原蛋白复合组织再生膜的制备：

步骤s3-1：灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在10℃干燥96h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵。

步骤s3-2：交联，采用紫外辐射法进行交联，得到双重交联的胶原蛋白膜。

对所得试样进行测试。

实施例4：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白海绵为增强体。二者复合后，再进行一次交联。其制备方法为：

步骤s1：胶原蛋白凝胶的制备：

步骤s1-1:取猪皮，去除毛和筋膜，切片，加入脱脂酶，然后在纯化水中漂洗1～24h，脱去油脂，灭活；

步骤s1-2：将步骤s1-1所得脱脂溶液加入到ph值为4的柠檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃温度下酶解20h；

步骤s1-3：将步骤s1-2所得的酶解溶液使用离心机离心，取上清液，使用氢氧化钠溶液调节ph值为6，使用硫酸钾溶液盐析出可溶性去端肽胶原蛋白；

步骤s1-4：将步骤s1-3所得去端肽胶原蛋白溶液装入透析袋中，将其密封进行三层梯度透析，透析时间为2天，温度都为25℃，每天更换交换透析液的次数在3次，得到去端肽胶原蛋白凝胶；所述的三层梯度透析的ph依次为ph2、ph3、中性溶液。

步骤s2：胶原蛋白海绵的制备：

步骤s2-1：配液，使用盐酸为溶剂，步骤s1-4中的去端肽胶原蛋白为溶质，配制胶原蛋白溶液；

步骤s2-2：灌装，并冷冻干燥，将步骤s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展开铺平，然后冷冻干燥成胶原蛋白海绵或，冷冻温度为-40℃，冻干时间为25h；

步骤s2-3：交联，采用紫外辐射法对步骤s2-2所得的海绵进行交联，得到一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵；

步骤s3：双重交联胶原蛋白骨组织再生膜的制备：

步骤s3-1：灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在70℃干燥20h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵；

步骤s3-2：交联，采用紫外辐射法进行交联，得到双重交联的胶原蛋白膜。

对所得试样进行测试。

实施例5：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白和壳聚糖复合海绵为增强体。二者复合后，再进行一次交联。其制备方法为：

步骤s1：胶原蛋白凝胶的制备：

步骤s1-1:取猪皮，去除毛和筋膜，切片，加入脱脂酶，然后在纯化水中漂洗1～24h，脱去油脂，灭活；

步骤s1-2：将步骤s1-1所得脱脂溶液加入到ph值为4的柠檬酸溶液中，加入胃蛋白酶和木瓜蛋白酶混合物，然后在25℃温度下酶解20h；

步骤s1-3：将步骤s1-2所得的酶解溶液使用离心机离心，取上清液，使用氢氧化钠溶液调节ph值为6，使用硫酸钾溶液盐析出可溶性去端肽胶原蛋白；

步骤s1-4：将步骤s1-3所得去端肽胶原蛋白溶液装入透析袋中，将其密封进行三层梯度透析，透析时间为2天，温度都为25℃，每天更换交换透析液的次数在3次，得到去端肽胶原蛋白凝胶；所述的三层梯度透析的ph依次为ph2、ph3、中性溶液。

步骤s2：胶原蛋白海绵的制备：

步骤s2-1：配液，使用盐酸为溶剂，步骤s1-4中的去端肽胶原蛋白和壳聚糖为溶质，配制胶原蛋白高分子复合溶液；

步骤s2-2：灌装，并冷冻干燥。将步骤s2-1所得的溶液注入模具，模具底面平整，展开铺平，然后冷冻干燥成胶原蛋白海绵或，冷冻温度为-80℃～-20℃，冻干时间为15～36h；

步骤s2-3：交联，采用二苯基磷酸盐对步骤s2-2所得的海绵进行交联，得到一重交联的胶原复合蛋白海绵；

步骤s2-4：使用溶液脱洗程序去除交联剂的残留，脱洗程序中使用脱洗液为中性的磷酸盐缓冲液。

步骤s3：双重交联胶原蛋白骨组织再生膜的制备：

步骤s3-1：灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原复合蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在70℃干燥30h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵；

步骤s3-2：交联，采用戊二醛进行交联，得到双重交联的胶原蛋白膜。

步骤s3-3，使用溶液脱洗程序去除交联剂的残留，脱洗程序中使用脱洗液为纯化水。

实施例6：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白海绵与蚕丝纤维网为增强体。三者复合后，再进行一次交联。其制备方法如所述的实施实例3，其特征在于所述的实施实例3中步骤s3-1胶原蛋白复合组织再生膜的制备：

步骤s3-1：灌模，将单层蚕丝纤维网平铺于模具底部，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵浸入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在10℃干燥96h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是蚕丝纤维网与一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵。

步骤s3-1中所述的蚕丝纤维网是厚度为0.06mm、长宽大小与胶原蛋白海绵一致的水刺布。

步骤s3-1中所述的蚕丝纤维网覆盖海绵的粗糙面。

实施例7：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白海绵与尼龙纤维网为增强体。其制备方法如所述的实施实例6。

步骤s3-1：灌模，将单层尼龙纤维网平铺于模具底部，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵的粗糙面向下浸入模具，在胶原蛋白海绵的光滑面再平铺单层尼龙纤维网，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在10℃干燥96h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是尼龙纤维网与一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵。

步骤s3-1中所述的尼龙纤维网是厚度为0.06mm的无纺布。

步骤s3-1中所述的尼龙纤维网是长宽大小与胶原蛋白海绵一致的。

实施例8：

一种双重交联的胶原蛋白组织再生膜，由胶原蛋白作为基体，交联的胶原蛋白海绵与聚丙烯纤维网为增强体。其制备方法如所述的实施实例6。

步骤s3-1：灌模，将步骤s2-1所得的胶原蛋白溶液注入模具中，将步骤s2-3所得的胶原蛋白海绵或是胶原复合蛋白海绵包覆上聚丙烯纤维网，放入模具，待吸满溶液之后，取出平铺在平板上，在10℃干燥96h成膜，基体材料是非交联的胶原蛋白溶液，增强体是尼龙纤维网与一重交联的胶原蛋白海绵或是胶原复合海绵。

步骤s3-1中所述的聚丙烯纤维网是厚度为0.08mm取向交叉编织纤维网。

步骤s3-1中所述的聚丙烯纤维网是长宽略大于胶原蛋白海绵。

对所得试样进行测试。

上述实施例1-8的产品进行测量的方法如下：

膜的厚度用游标卡尺测量，对同一张膜，测量5个不同位置的厚度，取平均值作为该膜的厚度值。

膜的膨胀率：采用干态膜用纯水或生理盐水浸泡10分钟后测量的厚度除以干态膜的厚度，所得的比值即为膨胀率。

膜的吸收降解时间，按照国家标准gb16886的测量方法进行测试。

膜的湿态抗张强度采用拉力测试机进行测试，对宽为1cm的试样用生理盐水浸泡10分钟，充分膨胀后，进行测试。记录断裂时的力与膜的断裂横截面积，二者的比值即为湿态抗张强度。

实施例1-8的产品的尺寸和性能数据见表1。

表1实施例1-5的产品尺寸和性能数据表