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技术领域：
]本发明属于生物学
技术领域：
，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法。
背景技术：
：]脂肪组织中含有一类具有多向分化潜力的细胞，即脂肪间充质干细胞，简称脂肪干细胞。其生物学性质与骨髓间充质干细胞相类似，并可向脂肪、骨、软骨、肝、肌肉、内皮、造血、胰岛和神经等多种细胞方向分化。脂肪间充质干细胞有一下优势：1、脂肪组织在体内分布广泛，储量丰富。且脂肪组织取材容易，吸脂手术属于技术成熟的常规手术，手术风险小，患者痛苦少，这一点尤其利于临床应用；2、脂肪干细胞的获取效率要优于骨髓间充质干细胞。细胞克隆形成实验表明，间充质干细胞只占到成人骨髓的(0.2-1)×10-5。而脂肪组织经胶原酶消化后，其中主要的细胞类型脂肪细胞，很容易通过浮力而去掉，所获得的细胞克隆形成率是骨髓间充质干细胞的100-500倍；3、从临床角度出发，在短时间内更容易获得大量的脂肪干细胞，对于急性疾病的快速治疗具有重要意义。一次吸脂手术可获得超过200ml的脂肪组织，且每100ml都能获得大约2×108个有核细胞，其中含有大约1.2×108的干细胞，相当于相同体积骨髓的2000倍。由于脂肪组织在人体内储量丰富，获取简便创伤小，在组织工程、器官修复、基因治疗等方面都有着广阔的应用前景，因此脂肪间充质干细胞已成为继骨髓间充质干细胞后干细胞领域另一个备受关注的热点。2012年1月，韩国fda批准的自体脂肪干细胞药物cuepistem成功上市，用于治疗复杂性克隆氏病并发肛瘘。同年10月，美国fda批准了cytoritherapeutics公司脂肪干细胞对心脏衰竭患者有效性的临床试验。肝纤维化(fibrosisofliver)是多种原因引起的慢性肝损害所致的病理改变，表现为肝内细胞外间质成分过度异常地沉积，并影响肝脏的功能，是慢性肝病发展到肝硬化必经之阶段。引起肝纤维化的病因很多，在国内以病毒性肝炎，尤其是慢性乙型和丙型肝炎所致的肝纤维化最为常见。在我国，乙型肝炎病毒表面抗原的检出率约为10％，其中慢性无症状乙型肝炎病毒感染者或慢性无症状hbv携带者就超过1.3亿，现慢性乙肝患者约3000万人。慢性感染患者中40％可能发生肝硬化或者肝癌，是正常人群的100-200倍。肝纤维化的治疗成为现今人们关注的焦点。现代医学并无治疗肝纤维化的特异性药物，多采用休息、加强营养、补充维生素等对症治疗方式，严重者需被迫停止用药，以免加重肝纤维化。尽管中医药对肝纤维化有一定的促再生和修复作用，但效果仍不是十分理想。目前也有利用干细胞移植的方法治疗肝纤维化，但多采用脐带间充质干细胞或者骨髓间充质干细胞，细胞来源有限。且输注前细胞处理过程比较简单，不能保证使用过程中细胞的稳定性，不能较长时间保持细胞活性，因此不适于远距离运输。且间充质干细胞表面表达多种黏附分子，主要参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程，影响细胞迁移。因此，在干细胞输注过程中极易促使细胞聚集成团，形成细胞栓，增加了间充质干细胞临床治疗的危险性。发明专利号201010551722.8的发明专利，公布了一种人脐带间充质干细胞抗肝纤维化注射液，由10%-50%人血白蛋白原液和49.5%-89.5%的勃脉力a液、0.5%肝素钙组成，24h后干细胞活率保存在90%以上。但对于更容易获取的人脂肪间充质干细胞，如何运用于抗肝纤维化治疗，是现阶段技术人员急需解决的问题。技术实现要素：]本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液及其制备方法，其具有稳定性高、疗效好、安全性高、便于储存和运输，适应临床大规模使用，应用前景广阔的特点，本发明可为肝纤维化患者带来福音，为临床上干细胞的使用开辟了新的道路。本发明提供的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液，由人脂肪间充质干细胞保存液和人脂肪间充质干细胞构成；所述的人脂肪间充质干细胞保存液由30%-45%的复方电解质注射液、30-45%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、2%-8%人血白蛋白注射液、2%-5%大株红景天注射液、2%-5%的香菇多糖注射液、2%-5%的黄芪注射液、2%-5%的香丹注射液、2%-5%胎盘多肽注射液、1%-3%维生素c注射液、0.5%-1.5%地塞米松磷酸钠注射液组成；每毫升人脂肪间充质干细胞保存液中含有人脂肪间充质干细胞1×105～5×106个。所述复方电解质注射液，主要成份醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖酸钠，为无色或几乎无色的澄明液体。可作为水、电解质的补充源和碱化剂。本品与血液和血液成分相容，可作为细胞的稀释液。在本发明注射液中用于维持晶体渗透压。所述羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液，主要成份聚（o-2-羟乙基）淀粉，为无色或微黄色澄明液体，临床上一般用于容量替代治疗。在本发明注射液中与人血白蛋白注射液一起用于维持胶体渗透压。所述人血白蛋白注射液，浓度为20%，用于维持胶体渗透压，保持干细胞活性。所述大株红景天注射液、香菇多糖注射液、黄芪注射液、香丹注射液均为纯中药制剂，发挥传统中医药优势，具有多种中药活性成分，可以抗氧化、抗衰老、提高免疫，同时，可以激活和保持注射液中干细胞活性。所述胎盘多肽注射液，含多种胎盘活性因子，可以激活干细胞活性。所述维生素c注射液可以抗氧化，激活和保持注射液中干细胞活性。所述地塞米松磷酸钠注射液具有抗炎、抗过敏、抑制免疫作用，可防止细胞应用带来的发烧、过敏等副反应，同时可以激活干细胞、保持注射液中干细胞活性。优选的，复方电解质注射液和羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液的体积比为1:1。优选的，所述人脂肪间充质干细胞保存液由36.5%的复方电解质注射液、36.5%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、4%人血白蛋白注射液、4%大株红景天注射液、4%的香菇多糖注射液、4%的黄芪注射液、4%的香丹注射液、4%胎盘多肽注射液、2%维生素c注射液、1%地塞米松磷酸钠注射液组成。本发明注射液中加入的人脂肪间充质干细胞的浓度为1×105-5×106个/ml。优选的，本发明注射液中加入的人脂肪间充质干细胞的浓度为1×106个/ml。本发明人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液，其使用方法如下：使用时采用静脉输注方式，注射用量：按照人脂肪间充质干细胞个数与患者体重比为(2-4)×106个/kg体重注入患者体内。本发明提供的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，如下：(1)制备人脂肪间充质干细胞保存液：由30%-45%的复方电解质注射液、30-45%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、2%-8%人血白蛋白注射液、2%-5%大株红景天注射液、2%-5%的香菇多糖注射液、2%-5%的黄芪注射液、2%-5%的香丹注射液、2%-5%胎盘多肽注射液、1%-3%维生素c注射液、0.5%-1.5%地塞米松磷酸钠注射液混匀组成，然后预冷、备用；(2)制备人脂肪间充质干细胞，将获得的人脂肪间充质干细胞加入到上述人脂肪间充质干细胞保存液中；通过细胞计数后重悬的方式，调整加入到人脂肪间充质干细胞保存液中的人脂肪间充质干细胞数量为1×105-5×106/ml。优选的，人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液的制备方法，上述第（1）步骤中，人脂肪间充质干细胞保存液的制备，由38.5%的复方电解质注射液、38.5%羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、4%人血白蛋白注射液、4%大株红景天注射液、4%的香菇多糖注射液、4%的黄芪注射液、4%的香丹注射液、4%胎盘多肽注射液、2%维生素c注射液、1%地塞米松磷酸钠注射液组成。所述的人脂肪间充质干细胞通过如下的方式制备：(1)从细胞库液氮中取出含有第3-4代临床级人脂肪间充质干细胞的冻存管；(2)将冻存管立即投入37℃温水中轻轻晃动，直至冻存液完全融解；(3)用75%酒精擦拭冻存管，将冻存管中细胞悬液转移至加含有9ml生理盐水的离心管，轻轻吹打均匀。可将多个同一批次的冻存管内细胞悬液及其洗涤液合并入1个50ml离心管内（注意：合并的细胞须为同一批次的，不同批次细胞禁止合并），同时吸出少许细胞用于细胞计数；(4)离心洗涤：1000rpm离心8min，弃上清液；(5)根据细胞计数结果，通过上述配置的人脂肪间充质干细胞保存液重悬细胞，调整每ml注射液中含有人脂肪间充质干细胞1×105-5×106/ml个。优选的，所述注射液中加入的人脂肪间充质干细胞的浓度为1×106/ml。所述人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液需要在0-8℃避光环境下保存和运输，自分装之时起有效期为48小时。本发明的注射液适用于静脉输注，按患者体重公斤数计算，推荐用量：人脂肪间充质干细胞(2-4)×106个/kg体重。本发明与现有技术相比，具有以下优点：本发明打破了肝纤维化的传统治疗方法，巧妙的运用人脂肪来源的间充质干细胞(简称：mscs，英文全称：mesenchymalstemcells)，并将其与其他成分组合制备成注射液形式，即人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液，该注射液所有成分均为临床上常用的药品，安全无副作用。形成的注射液渗透压稳定，且其中中药组合物具有抗氧化、激活和维持间充质干细胞活性的作用。解决了现有技术在干细胞输注过程中细胞活率低，保存时间短，长期保存细胞活性差的问题，并且延长了待使用细胞的保质时间，本发明注射液，24h内细胞活率维持在97%以上，36h后干细胞活率仍维持在95％以上，疗效好、使用更安全，适于较长时间的保存及运输，用后无任何毒副作用，为临床大规模使用奠定了基础。本发明注射液稳定性高，较好的解决了细胞运输时间短、活力低的问题，增加了注射液保存及运输过程稳定性、提高了临床使用安全性，进而更好的保持了注射液的疗效，为临床使用干细胞开辟了新的道路。本发明提供的注射液，发挥传统中医药优势，与现代科学有机结合，创造性添加了大株红景天注射液、香菇多糖注射液、黄芪注射液、香丹注射液四种传统中药成分，四种中药中有效成分如红景天苷等能提高机体免疫力和肌肉运动能力，增加体内sod活性，降低甘油三酯含量，并能调整体内camp和cgmp的比值，具有延缓衰老的作用。四种中药成分组合物可以发挥协同作用，抗氧化，激活和维持注射液中干细胞活性。中药成分与人脂肪间充质干细胞一起注射入人体后，其中香丹注射液能明显改善肝硬化患者的肝功能，辅助提高间充质干细胞修复能力。香菇多糖注射液经现代实验研究证实其具有提高机体免疫力，抗病毒，抗肿瘤的作用，可用治慢性乙型迁延性肝炎，辅助抑制病毒复制；黄芪注射液可益气养元，扶正祛邪；大株红景天注射液可活血化瘀；四种成分可以在体内发挥协同作用，提高效果。本发明提供的注射液，创造性添加了胎盘多肽注射液。胎盘多肽注射液含有多种生长因子，药理试验表明，可以：（1）增强细胞的免疫功能，恢复e-玫瑰花结形成的能力，对t淋巴细胞有激活作用；（2）抑制机体的过氧化反应，清除自由基；（3）抑制化学致突变作用，对遗传因子dna的损伤起修复作用，降低微核细胞率的增加，保证遗传物质的稳定和抗体的正常生理功能；（4）促进骨髓造血细胞的生存、增殖、分化及提高生物活性。本发明提供的注射液可分化成有功能的肝脏细胞；具有再生修复实质器官和发挥免疫调节的双向作用，提高免疫功能，改善肝脏的微环境以及降低炎性细胞因子分泌的能力，减轻炎症反应；抑制肝星状细胞活化、阻止细胞外基质的生成，逆转肝纤维化；激活肝脏细胞，促进肝脏细胞再生，修复实质器官和慢性肝损害，间接地提高了抗病毒治疗疗效。且本发明注射液中的人脂肪间充质干细胞由于来源广泛，不受伦理限制、免疫原性低使其成为肝纤维化治疗的新的有效手段，应用前景十分广阔。具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。实验所用器具仪器药品试剂皆可通过商业途径获得。本发明提供的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液，由人脂肪间充质干细胞保存液和人脂肪间充质干细胞构成；每毫升人脂肪间充质干细胞保存液中含有人脂肪间充质干细胞的数量为1×105-5×106个。实施例1一、制备本发明人脂肪间充质干细胞保存液a100ml无菌条件下，依次取36.5ml的复方电解质注射液（商品名称：勃脉力a，上海百特医疗用品有限公司，国药准字h20000475），36.5ml羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液（商品名称：贺斯，北京费森尤斯卡比医药有限公司，国药准字h20030494，规格型号500ml：15g羟乙基淀粉200/0.5与氯化钠4.5g），4ml人血白蛋白注射液(成都蓉生药业有限责任公司，国药s10940024,50ml:10g,20%)，4ml大株红景天注射液(通化玉圣药业有限公司,国药准字z20060361,5ml)，4ml香菇多糖注射液（金陵药业股份有限公司福州梅峰制药厂，国药准字h20030131，2ml:1mg），4ml黄芪注射液（正大青春宝药业有限公司，国药准字z33020178）、4ml香丹注射液（黑龙江乌苏里江制药有限公司，国药准字z20033282），4ml胎盘多肽注射液（贵州泰邦生物制品有限公司，国药准字h20046260，4ml），2ml维生素c注射液（瑞阳制药有限公司，国药准字h37022062，5ml:0.5g），1ml地塞米松磷酸钠注射液(辰欣药业股份有限公司,国药准h37021969,1ml:5mg)，混匀，置0-8℃冷藏存储。二、制备人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液a100ml(1)从细胞库液氮中取出含有第3-4代临床级人脂肪间充质干细胞的冻存管；(2)将冻存管立即投入37℃温水中轻轻晃动，直至冻存液完全融解；(3)用75%酒精擦拭冻存管，将冻存管中细胞悬液转移至加含有9ml生理盐水的15ml离心管，轻轻吹打均匀。可将多个同一批次的冻存管内细胞悬液及其洗涤液合并入1个50ml离心管内（注意：合并的细胞须为同一批次的，不同批次细胞禁止合并），同时吸出少许细胞用于细胞计数；(4)离心洗涤：1000rpm离心8min，弃上清液，获得的人脂肪间充质干细胞；(5)将获得的人脂肪间充质干细胞加入到人脂肪间充质干细胞保存液a中；根据细胞计数结果，通过细胞计数后重悬的方式，调整加入到每ml人脂肪间充质干细胞保存液a中的人脂肪间充质干细胞数量为1×105-5×106个，制备成本发明人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液a100ml；三、上述制备好的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液a，需要在0-8℃避光环境下保存和运输，自分装之时起有效期为48小时。本发明注射液适用于静脉输注，按患者体重公斤数计算，推荐用量：人脂肪间充质干细胞(2-4)×106个/kg体重。实施例2一、制备本发明人脂肪间充质干细胞保存液b100ml同实施例1，无菌条件下，依次取43.25ml的复方电解质注射液、43.25ml羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、2ml人血白蛋白注射液、2ml大株红景天注射液、2ml香菇多糖注射液、2ml黄芪注射液、2ml香丹注射液、2ml胎盘多肽注射液、1ml维生素c注射液、0.5ml地塞米松磷酸钠注射液组成，混匀，置0-8℃冷藏存储。二、制备本发明人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液b100ml同实施例1第二步操作,将获得的人脂肪间充质干细胞加入到人脂肪间充质干细胞保存液b中；，通过上述配置的人脂肪间充质干细胞保存液b重悬细胞，调整每ml人脂肪间充质干细胞保存液b中含有人脂肪间充质干细胞1×106个。实施例3一、制备本发明人脂肪间充质干细胞保存液c100ml同实施例1，无菌条件下，依次取31.25ml复方电解质注射液、31.25ml羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、8ml人血白蛋白注射液、5ml大株红景天注射液、5ml香菇多糖注射液、5ml黄芪注射液、5ml香丹注射液、5ml胎盘多肽注射液、3ml维生素c注射液、1.5ml地塞米松磷酸钠注射液，混匀，置0-8℃冷藏存储。二、制备本发明人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液c100ml同实施例1，将获得的人脂肪间充质干细胞加入到人脂肪间充质干细胞保存液c中；通过上述配置的人脂肪间充质干细胞保存液c重悬细胞，调整每ml人脂肪间充质干细胞保存液c中含有人脂肪间充质干细胞数量为1×106。实施例4一、制备人脂肪间充质干细胞保存液d100ml同实施例1，无菌条件下，依次取44.5ml复方电解质注射液、44.5ml羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、4%人血白蛋白注射液、4%胎盘多肽注射液、2%维生素c注射液、1%地塞米松磷酸钠注射液，混匀，置0-8℃冷藏存储。二、制备人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液d100ml同实施例1，将获得的人脂肪间充质干细胞加入到人脂肪间充质干细胞保存液d中；通过上述配置的人脂肪间充质干细胞保存液d重悬细胞，调整每ml人脂肪间充质干细胞保存液d中含有人脂肪间充质干细胞的数量1×106。实施例5一、制备人脂肪间充质干细胞保存液e100ml同实施例1，无菌条件下，依次取38.5ml复方电解质注射液、38.5ml羟乙基淀粉200/0.5氯化钠注射液、4ml人血白蛋白注射液、4ml大株红景天注射液、4ml香菇多糖注射液、4ml黄芪注射液、4ml香丹注射液、2ml维生素c注射液、1ml地塞米松磷酸钠注射液，混匀，置0-8℃冷藏存储。2）制备人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液e100ml同实施例1，将获得的人脂肪间充质干细胞加入到人脂肪间充质干细胞保存液e中，通过上述配置的人脂肪间充质干细胞保存液e重悬细胞，调整每ml注射液中含有人脂肪间充质干细胞数量1×106。实施例6将上述实施例中配置的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液a、b、c、d、e以及新鲜配置的每ml含有人脂肪间充质干细胞1×106的生理盐水悬液f，共6份样本，置于4℃的温度环境下保存，在保存4h、8h、12h、24h、36h、48h时取样，并测定细胞存活率。测定方法：将细胞悬液0.5ml加入试管中；加入0.5ml浓度为0.2％的台盼兰染液；将细胞悬液吸出10μl，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间；静置1分钟；随机选取几个视野，共计数300个细胞，并计数其中死细胞数目，计细胞活力，重复计数5次取平均值。结果如下表格1所示。表格1六种注射液中细胞活率对比表格1可以看出，本发明的优选的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液a，对干细胞保存效率明显高于其他。本发明中如果去除四种中药组合物成分，即实施例四制备的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液d，效率明显下降。本发明注射液中如果去除胎盘多肽注射液，即实施例五制备的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液e，效率也明显下降。本发明的优选的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液a，细胞存储36h后，细胞活率仍高达96%，而单纯生理盐水保存的注射液f，细胞活率仅40%。实施例7使用本发明提供的注射液的病人均选自住院病人，经伦理委员会批准，签署知情同意书，总共12例，其中乙肝肝硬化10例，自身免疫性肝硬化2例，均为失代偿期。经输入本发明的注射液后，病人精神好转，食欲增加，腹水消退，血清学生化指标明显改善，第一次治疗后，症状体征明显改善，达到出院要求。乙肝肝硬化患者，按常规服用抗病毒药物。下表格2为患者血清学指标(平均值)。alt(alanineaminotransferase)：丙氨酸转氨酶；ast(aspartateaminotransferase)：谷草转氨酶；alb(albumin)：血清白蛋白；tbil(totalbilirubin)：总胆红素；pt(prothrombintime)：凝血酶原时间；tt（thrombintime）:凝血酶时间；ptinr(prothrombintimeinternationalnormalizedratio)：凝血酶原时间国际标准化比率；afp(alpha-fetalprotein)：甲胎蛋白)表格2患者血清学指标对比altastalbtbilptttptinrafp治疗前82.41123.2126.9843.2616.2917.391.273.2治疗后36.2656.3336.2821.3912.3712.991.011.9所有病人用人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液治疗3次，每次相隔1个月时间，病人经治疗后，肝功能损害减轻，肝细胞再生活跃，白蛋白分泌增加，凝血功能恢复正常。为了明确人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液的治疗安全性，每例病人，都常规检查afp的水平。经治疗后，患者afp的水平在治疗前和治疗后无明显差异，甚至有轻微的减低。本发明采用人脂肪组织分离出来的间充质干细胞，其有别于骨髓和脐带间充质干细胞，且来源更加广泛，不受伦理限制、免疫原性低，使其成为肝纤维化治疗的新的有效手段，应用前景十分广阔。本发明注射液中创造性添加四种中药组分和胎盘多肽注射液，并制备成注射液形式，较好的解决了细胞长期存储活率低问题，增加了注射液保存及运输过程稳定性、临床使用安全性，进而更好的保持了注射液的疗效，便于临床大规模使用。本发明的人脂肪间充质干细胞抗肝纤维化注射液中脂肪间充质干细胞活性好，稳定性高，便于储存和运输，疗效显著、安全性高，用后无任何毒副作用，适于临床大规模使用。当前第1页12