一种灵芝孢子粉的破壁工艺的制作方法

本发明涉及一种灵芝孢子粉的破壁工艺，属于灵芝孢子的破壁方法技术领域。

背景技术：

灵芝(ganoderma)为多孔菌科真菌赤芝(ganodermalucidum)或紫芝(ganodermasinense)的干燥子实体，具有极高的药用价值和生物活性。而灵芝孢子是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来的极其细小的颗粒，属于卵型生殖细胞。能够将灵芝的遗传物质全部保留下来。灵芝孢子含有丰富的多糖、生物碱、有机锗及萜类等多种药理活性成分，具有抑制肿瘤、提高免疫力、降血糖和抗氧化等多重功效，且其药用价值远高于灵芝子实体和菌丝体。

灵芝孢子的细胞壁由葡聚糖、几丁质等不溶于水的多糖类高分子构成，具有耐酸抗碱，耐酶抗消化，耐压抗热等性质，阻碍了人体对灵芝孢子有效成分的消化吸收，因此，对灵芝孢子进行破壁处理会有利于其活性成分的提取。

现有的灵芝孢子的破壁方法有超声波处理法、生物酶法、超临界co2法、等，但这些方法普遍存在破壁率相对较低、效率较低等缺点，如超声波处理法一次破壁量有限；生物酶法作用时间较长；超临界co2法会导致灵芝孢子中部分有效成分的丧失。有研究报道，超低温物理破壁技术即在零下40-60度的超低温条件下，把收集起来的灵芝孢子粉用细胞破壁机粉碎。在低温高压的粉碎切割下，最大限度的保存或不破坏灵芝孢子粉的原生态活性有效成分，坚硬的灵芝孢子细胞壁很容易被打破，就得到了破壁灵芝孢子粉，再通过低温分层纯化方法，除去没有生物活性成分的残破灵芝孢子壁，这种技术具有效果较好且不破坏孢子有效成分的优点。

本发明以超低温物理破壁技术为基础，提出了一种新的灵芝孢子粉破壁工艺，并利用单因素及正交试验对工艺条件进行了优化，以提高灵芝孢子的破壁率、减少灵芝孢子中有效成分的流失。

技术实现要素：

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种灵芝孢子粉的破壁工艺，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)破壁前准确与处理：筛选质地完好的灵芝孢子；

(2)粉碎处理：将灵芝孢子采样粉碎机粉碎至过80目筛；

(3)将过筛的孢子粉以7％硫酸锌溶液与适量无水乙醇为溶剂制成悬浊液；

(4)超声预处理：采样超声预处理灵芝孢子粉；

(5)真空冷冻干燥；

(6)利用超低温物理破壁设备破壁孢子粉；

(7)得到破壁的灵芝孢子粉。

进一步，作为优选，所述步骤(3)中，7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比在1∶0.2至1∶0.1之间。

进一步，作为优选，所述步骤(4)中，超声时间为10或20min，超声温度在30～35℃范围内。

进一步，作为优选，在所述步骤(5)中，冷冻时间在6～8h内，冷冻温度在-25～-15℃范围内。

进一步，作为优选，7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比为1:0.1，超声温度为30℃，冷冻时间为8h。

进一步，作为优选，该工艺的破壁率检测方法为：对破壁灵芝孢子粉采用血球计数板计数，并绘制标准曲线y＝8069.2x+1.6944(y为孢子粉平均数，x为孢子粉质量，r²＝0.9995)，按照下列公式计算破壁率：

式中：x为破壁率/％；n1为从标准曲线查到的与待测样品相同质量的未破壁灵芝孢子数目；n2为计数得到的破壁灵芝孢子粉中未破壁的灵芝孢子数目。

本发明提出了一种新型的灵芝孢子粉破壁工艺，即在超低温物理破壁这种破壁效果较好的技术基础上，对灵芝孢子粉进行了粉碎机粗破壁、硫酸锌溶液与无水乙醇混合悬浮孢子粉、超声处理、真空冷冻干燥等一系列预处理，该工艺在提高孢子粉破壁率的同时，减少了破壁技术对灵芝孢子粉内有效成分的破坏，保存了灵芝孢子粉极高的药用价值，促进了机体对其有效活性成分的吸收利用，具有极高的应用价值。根据单因素及正交试验结果，得到最佳工艺条件为：悬浊液溶剂7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比为1:0.1、超声温度为30℃、冷冻时间为8h，得到灵芝孢子粉破壁率可达96.3％。

与现有破壁技术相比，本发明的优点是：

(1)在破壁之前，对灵芝孢子粉进行一系列预处理(粉碎机粗破壁、7％硫酸锌溶液与无水乙醇混合悬浮孢子粉、超声处理、真空冷冻干燥)，提高了孢子粉的破壁率。

(2)该破壁工艺采用的均为物理破壁方法，不会对孢子粉内的有效成分产生较大的影响，工艺流程较简单，可操作性强，破壁效率也高，可大量应用于破壁灵芝孢子粉产品的生产。

附图说明

图1是悬浊液溶剂体积比对孢子粉破壁率的影响；

图2是超声时间对孢子粉破壁率的影响；

图3超声温度对孢子粉破壁率的影响；

图4冷冻时间对孢子粉破壁率的影响；

图5冷冻温度对孢子粉破壁率的影响；

图6未破壁灵芝孢子粉(a)与破壁灵芝孢子粉(b、c、d)的sem图；

注：图中字母不同表示差异显著(p<0.05)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、；完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1材料与方法：

1.1试验材料

灵芝孢子粉由广浙江益圣菌物发展有限公司提供，为100％灵芝孢子粉。

1.2方法

1.2.1破壁工艺

破壁前孢子粉→粉碎机粉碎至过80目筛→以7％硫酸锌溶液与适量无水乙醇为溶剂制成悬浊液→预处理灵芝孢子粉(超声处理)→真空冷冻干燥→利用超低温物理破壁设备破壁孢子粉→破壁灵芝孢子粉

1.2.2破壁率检测

对破壁灵芝孢子粉采用血球计数板计数，并绘制标准曲线y＝8069.2x+1.6944(y为孢子粉平均数，x为孢子粉质量，r²＝0.9995)，按照下列公式计算破壁率：

式中：x为破壁率/％；n1为从标准曲线查到的与待测样品相同质量的未破壁灵芝孢子数目；n2为计数得到的破壁灵芝孢子粉中未破壁的灵芝孢子数目。

1.2.3单因素试验

根据“1.2.1”中的破壁工艺对灵芝孢子粉进行破壁处理，以灵芝孢子粉破壁率为试验指标，分析悬浊液溶剂中7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比、超声时间、超声温度、冷冻时间、冷冻温度对灵芝孢子粉破壁率的影响程度，单因素试验设计如表1。

表1单因素实验设计

注：固定条件：悬浊液溶剂体积比为1∶0.1；超声时间为20min；超声温度为25℃；冷冻时间为5h；冷冻温度为-20℃

1.2.4正交试验

根据“1.2.3”单因素试验结果中各因素与灵芝孢子粉破壁率的pearson系数，选出对灵芝孢子粉破壁率有显著影响的因素进行正交试验，并对正交试验结果进行验证，得到最优工艺条件。

1.2.5破壁灵芝孢子粉的表征

利用扫描电镜sem观察破壁灵芝孢子粉与未破壁灵芝孢子粉的表面形态。

1.2.6数据处理与分析

所有数据均以平均值(mean)±标准差(sd)表示，用spss22.0软件进行单因素方差分析(anova)，再进行tukey多重比较，当p<0.05则认为具有显著性差异；用pearson相关分析得出对灵芝孢子粉破壁率有显著性影响的因素。

2结果与讨论：

2.1单因素试验结果

2.1.1悬浊液溶剂体积比对灵芝孢子粉破壁率的影响

由图1可看出(注：图1中字母不同表示差异显著(p<0.05))，当两种悬浊液溶剂体积比为1∶0，即只用硫酸锌溶液作悬浊液溶剂时，灵芝孢子粉破壁率要显著高于悬浊液体积比为0∶1(即只用无水乙醇作溶剂)时得到的破壁率(p<0.05)，说明相较于无水乙醇，硫酸锌溶液能较好的悬浮灵芝孢子。此外，当两种溶剂以一定体积比(1∶0.4、1∶0.3、1∶0.2、1∶0.1)共同悬浮孢子粉时，得到的孢子粉破壁率均显著高于两种溶剂单独作用于孢子粉时得到的破壁率，说明将两者混合可以提高孢子粉破壁率，这可能是由于破壁孢子粉中含孢子油，使得镜检计数时孢子发生黏聚，影响计数，加入无水乙醇可使孢子油溶于其中，避免孢子发生黏聚，降低实验误差。由图1可知，当7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比在1∶0.2、1∶0.1左右时，得到的孢子粉破壁率较高。

2.1.2超声时间对灵芝孢子粉破壁率的影响

由图2可知，对孢子粉进行一定时间的超声处理时得到的破壁率显著高于未进行超声处理时的破壁率(p<0.05)，超声不仅有利于孢子粉的分散，其产生的能量还可使孢子粉做剧烈的受迫振动而破碎，在一定程度上提高了孢子粉的破壁率，但是超声时间过长，可能会破坏孢子粉内的有效成分，所以为了得到较高的孢子粉破壁率、减少孢子粉内有效成分的破坏，选择最佳的超声时间为10或20min。

2.1.3超声温度对灵芝孢子粉破壁率的影响

由图3可知，超声温度在20、25℃时，孢子粉破壁率无显著差异(p>0.05)，当温度升至30℃时，破壁率显著提高(p<0.05)，而温度升至40℃以后，破壁率又呈现缓慢降低的趋势，这可能是由于随着温度的升高，超声波的声速会逐渐下降，其产生的能量也逐渐减小，其对孢子粉的作用力也会有一定程度的降低。由图3可推测最佳的超声温度在30～35℃范围内。

2.1.4冷冻时间对灵芝孢子粉破壁率的影响

由图4可知，在3～6h的冷冻时间内，孢子粉的破壁率呈逐渐提高的趋势，6h以后，破壁率缓慢下降，说明冷冻时间的不同会对孢子粉破壁率的大小产生一定程度的影响。冷冻时间为6、7h时，破壁率显著高于其他组的破壁率(p<0.05)，分别为82.2％、82.1％，此外，冷冻时间为8h时的破壁率也高达80.0％，因此选择最佳冷冻时间在6～8h内。

2.1.5冷冻温度对灵芝孢子粉破壁率的影响

由图5可知，冷冻温度在-25～-15℃时，孢子粉破壁率无显著差异(p>0.05)，且显著大于其他温度组的破壁率(p<0.05)，由此推测最佳冷冻温度在-25～-15℃范围内。

2.1.6各因素与灵芝孢子粉破壁率的相关性

皮尔逊相关系数又称简单相关系数，一般用r值表示，是一种度量两个变量间相关程度的方法。它是一个介于1和-1之间的值，r值为正数表示两变量呈正相关，为负数即为负相关，其绝对值在0.00-0.19、0.20-0.39、0.40-0.69、0.70-0.89、0.90-1.00内分别表示两变量极低相关、低度相关、中度相关、高度相关、极高相关。在spss中，pearson相关系数不仅要看r值，r值表示两变量相关性的大小，还要看p值，p值是检验值，检验两变量在样本来自的总体中是否存在和样本一样的。

由表2可看出，悬浊液溶剂7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比、超声温度、冷冻时间分别与灵芝孢子粉破壁率之间存在显著相关(p<0.05)，而超声时间、冷冻温度与破壁率之间无显著相关性(p>0.05)，同时，根据r值可知，悬浊液溶剂体积比、超声温度均与灵芝孢子粉破壁率表现出高度相关，冷冻时间与破壁率表现出中度相关，综合考虑r值与p值，选择悬浊液溶剂体积比、超声温度、冷冻时间三个因素进行接下来的正交试验，得出灵芝孢子粉破壁工艺的最优条件。

表2各因素与灵芝孢子粉破壁率之间的pearson相关系数

注：p<0.05表示具有显著性差异

2.2正交试验

表3因素水平表

表4正交试验结果与极差分析

表5正交试验方差分析

注：f值为统计量值；p值为显著性概率，p<0.05表示具有显著差异

表6正交试验tukey法多重比较

注：各因素不同水平下的不同字母表示具有显著差异(p<0.05)

根据前面单因素试验的结果，进行三因素三水平的正交试验，选择的因素水平如表3所示。从表4的极差分析可知，影响灵芝孢子粉破壁率的各因素主次关系为：a(悬浊液溶剂体积比)>b(超声温度)>c(冷冻时间)。表5的方差分析表明这三个因素对破壁率的影响均存在显著差异(p<0.05)，以上结果与pearson分析的结果相吻合。

由表6可看出，三个因素各水平间均存在显著差异(p<0.05)，通过tukey法多重比较，理论上最优制备条件应该为a3b1c3。

2.3验证试验

对a3b1c3这一组合进行三次平行验证试验，结果表明，三次实验a3b1c3得到破壁率分别为95.7％、96.2％、96.9％，平均值为96.3％，与正交试验结果相吻合，进一步验证了该工艺的可行性。经过单因素及正交试验，得到最优工艺条件为a3b1c3，即悬浊液溶剂7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比为1:0.1、超声温度为30℃、冷冻时间为8h。

2.4破壁灵芝孢子粉的表面形貌

未破壁灵芝孢子粉与破壁灵芝孢子粉在sem观察下的表面形貌如图6所示，未破壁灵芝孢子粉(a)视野范围内孢子完整，而破壁灵芝孢子粉(b)视野范围内大部分孢子已被破壁，两者差别明显，从放大后的破壁灵芝孢子粉sem图(c、d)也可清晰的观察到孢子粉外壁已经出现破裂。

3总结：本实验提出了一种新型的灵芝孢子粉破壁工艺，即在超低温物理破壁这种破壁效果较好的技术基础上，对灵芝孢子粉进行了粉碎机粗破壁、硫酸锌溶液与无水乙醇混合悬浮孢子粉、超声处理、真空冷冻干燥等一系列预处理，该工艺在提高孢子粉破壁率的同时，减少了破壁技术对灵芝孢子粉内有效成分的破坏，保存了灵芝孢子粉极高的药用价值，促进了机体对其有效活性成分的吸收利用，具有极高的应用价值。

根据单因素及正交试验结果，得到最佳工艺条件为：悬浊液溶剂7％硫酸锌溶液与无水乙醇的体积比为1:0.1、超声温度为30℃、冷冻时间为8h，得到灵芝孢子粉破壁率可达96.3％。

本发明的优点是：

(1)在破壁之前，对灵芝孢子粉进行一系列预处理(粉碎机粗破壁、7％硫酸锌溶液与无水乙醇混合悬浮孢子粉、超声处理、真空冷冻干燥)，提高了孢子粉的破壁率。

(2)该破壁工艺采用的均为物理破壁方法，不会对孢子粉内的有效成分产生较大的影响，工艺流程较简单，可操作性强，破壁效率也高，可大量应用于破壁灵芝孢子粉产品的生产。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。