本发明天然产物提取技术领域，尤其是涉及一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法。
背景技术：
柴胡，别名地熏、山菜、菇草、柴草，为《中国药典》收录的草药，药用部位为伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根。柴胡性味苦、微寒，归肝、胆经，有和解表里，疏肝升阳之功效，用于感冒发热、寒热往来、疟疾、肝郁气滞、胸肋胀痛、脱肛、子宫脱垂、月经不调。
柴胡皂苷结构均为五环三萜类齐墩果烷型衍生物，其苷元分为7种不同类型：环氧醚(ⅰ)，异环双烯(ⅱ)，12-烯(ⅲ)，同环双烯(ⅳ)，12烯-28-羧酸(ⅴ)，异环双烯-30-羧酸(ⅵ)，18-烯型(ⅶ)。柴胡皂苷中一般只含葡萄糖、呋糖、鼠李糖和木糖，此外，除以上各种糖外还有戊糖醇(pentitol)。至今为止，共研究了该属20多种柴胡，从柴胡属植物已分离出90多种皂苷类成分，发现了30多种新化合物。近10年分离鉴定的皂苷为43个，文献报道较多的是柴胡皂苷a、b、c、d等,皂苷绝大部分是从柴胡根中分得，地上部分分得的皂苷极少。
各种不同类型的柴胡皂苷都具有重要的药理作用：柴胡皂苷a显著抑制三磷酸腺苷诱发的血小板聚集，与阿司匹林作用相当，且以剂量依赖抑制内源性花生四烯酸生成血栓素。柴胡皂苷a、d具有类甾环样结构，dobashi等研究发现:给小鼠口服柴胡皂苷0.2～2.0mg/kg后发现血清中的促肾上腺皮质激素(acth)明显增高，而且腺垂体中的acth前体、下丘脑中的促肾上腺皮质激素生成激素(crf)mrna的水平也明显增高，并呈剂量依赖性，而柴胡皂苷a却没有这种作用。chianglc等利用hbv转染的人类肝癌细胞观察柴胡皂苷a、c、d的作用发现,柴胡皂苷c可明显抑制培养基中hbeag的表达,hbv-dna的复制也得到了有效抑制，提示柴胡皂苷可阻止乙型肝炎向肝纤维化的转化。在抗肾小球基底膜型肾炎及heymann肾炎的大鼠模型中，柴胡皂苷d在疾病早期、晚期2个阶段给药，发现可减轻尿蛋白，降低血脂，减轻肾小球病理变化；肾小球内igg、c3的沉积较对照组显著减少；血清中促肾上腺皮质激素、皮质酮、肾组织中糖皮质激素受体(gr)均有所增高。提示柴胡皂苷d可能通过刺激hpa轴,增强糖皮质激素的功能，抑制花生四烯酸等代谢产物的生成,从而抑制了炎症的发生。柴胡皂苷a、d、f可增加小鼠t、b淋巴细胞的活性及白细胞介素-2(il-2)的分泌水平，柴胡皂苷a、d还可以使血浆中iga、igg、igm水平提高,以柴胡皂苷d活性最强。柴胡皂苷d作用下,巨噬细胞的扩展性、酸性磷酸酶活性,化学发光等呈剂量依赖性增加。motooy等研究了柴胡皂苷不同组分对肝、胰腺肿瘤细胞的作用,发现肝肿瘤细胞50%抑制时,柴胡皂苷d浓度为20mg/ml，柴胡皂苷a的浓度为50mg/ml，柴胡皂苷b2、c>1000mg/ml。柴胡皂苷a50mg/ml可抑制这2种肿瘤细胞的生长和dna的合成。chianglc等的研究还发现柴胡皂苷d通过活化caspase3，caspase7诱导hepg2人类肝肿瘤细胞凋亡,从而实现抗肿瘤的作用。tsaiyj等用柴胡皂苷a、b1、b2、c、d诱导小鼠c6胶质瘤细胞分化。柴胡皂苷a、d可抑制细胞增殖,改变细胞形态，而且柴胡皂苷a可显著抑制谷氨酰胺合成酶和环核苷酸磷酸水解酶的活性。
目前从柴胡中提取柴胡皂苷的方法都是不经过细胞破壁，直接采用渗漉提取或提取罐提取的方法。中国专利cn201210595558.x（申请号）公开了一种从大叶柴胡中制备柴胡皂苷的方法，该方法包括如下步骤：(1)将柴胡原料粉碎成粗粉后加入连续逆流提取罐用丙酮水溶液回流提取；(2)将经(1)处理的提取液过滤，得柴胡皂苷粗提液；(3)将所得柴胡皂苷粗提液浓缩，得柴胡皂苷粗浓缩液；(4)将所得柴胡皂苷粗浓缩液泵入连续萃取灌组物料罐，萃取溶剂为乙酸乙酯，经由萃取塔得柴胡皂苷乙酸乙酯萃取液；(5)将柴胡皂苷乙酸乙酯萃取液浓缩，得柴胡皂苷浓缩膏；(6)将柴胡皂苷浓缩膏拌硅胶，并将拌好的混合物至于硅胶柱上方，经乙酸乙酯和石油醚混合液洗脱，得洗脱液；(7)将洗脱液回收溶剂后浓缩干燥得柴胡皂苷半成品；(8)将柴胡皂苷半成品用丙酮水溶液溶解，过滤，回收丙酮，浓缩，放置析出晶体，抽滤得柴胡皂苷成品。该方法的柴胡没有经过细胞破壁，采用了丙酮水溶液回流提取，还需要进行浓缩、萃取等步骤，过程中多次使用到丙酮、乙酸乙酯、石油醚等有机溶剂，容易造成有机溶剂的污染和残留。中国专利cn201610570811.4（申请号）公开了一种柴胡皂苷的提取方法，包括：步骤1：将柴胡药材粉碎至40～60目；步骤2：将柴胡粉用ph值为7～13的碱性溶剂浸泡10～50h后，进行渗漉提取，得到渗漉液，将渗漉液在温度为25～100℃下浓缩；步骤3：将浓缩后的混合物在超声提取机中超声浸泡30～60min，再在微波反应器中加热25～40min；步骤4：将加热后的混合物冷却30～50min；步骤5：将冷却后的混合物用乙醇水溶液溶解，将溶解液上大孔树脂吸附柱，碱水洗脱除杂，再用水洗至中性后，收集洗脱液；步骤6：将洗脱液进行过滤、干燥后得到柴胡皂苷粉末。该方法由于柴胡没有经过细胞破壁，因此需要将柴胡粉用ph值为7～13的碱性溶剂浸泡10～50h后进行渗漉提取，提取效率低，生产周期比较长
因此，开发一种先将柴胡细胞破壁然后提取柴胡皂苷的方法，使用较温和的提取条件和无毒提取溶剂，不仅有利于提高柴胡皂苷的生产效率，而且可以保证柴胡皂苷作为天然提取物的安全性。
技术实现要素：
本发明目的是克服现有技术中需要高温蒸馏和使用较多的有毒有机溶剂提取柴胡皂苷的不足，提供一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜柴胡根洗净、切片，晒干至含水量为8%~12%，得到柴胡饮片；此含水量有利于提高破壁机的破壁效率；
（2）将柴胡饮片放入-196℃的液氮中冷冻1~3min，迅速取出放入破壁机，以20000~40000rpm的转速进行破壁处理1~3min，得到一次破壁的柴胡粉；此条件下破壁机的一次破壁效率最高，达42~48%；
（3）将一次破壁的柴胡粉调节含水量至3%~5%，冷冻至-60~-80℃，用高压纯化空气切割粉碎机进行二次破壁，空气压力为100~200mpa，空气流速为600~800m/s，进料速度为6~10g/s，进料周期为2-5s，进料压力为0.2~0.3mpa，得到二次破壁的柴胡粉；此条件下二次破壁效率最高，达97.1~99.4%；
（4）将二次破壁的柴胡粉、2-5mol/l的醋酸钠溶液和无水乙醇按照1:3~5:6~15的质量比混合，在40-60℃下搅拌15~45min，然后于0~4℃下静置30~60min，然后0~4℃下10000~15000rpm离心10~30min，取上层清液，得到柴胡皂苷粗提取液；此条件下柴胡皂苷的提取效率最高，蛋白质和核酸的除杂效果最好；
（5）以制备型高效液相色谱仪对柴胡皂苷粗提取液进行精制，色谱柱为c18反相硅胶色谱柱，填料粒径为5μm，内径为7.8mm，长度为300~350mm，洗脱条件为：0~10min为100%双蒸水，10-20min为体积比10%~20%：80%~90%的无水乙醇和双蒸水，20-30min为体积比30%~40%：60%~70%的无水乙醇和双蒸水，30-40min为体积比50%~60%：40%~50%的无水乙醇和双蒸水，40-50min为体积比70%~80%：20%~30%的无水乙醇和双蒸水，50-60min为100%的无水乙醇，洗脱液流速为0.6~1ml/min，将含有柴胡皂苷的洗脱成分回收，得到精制的柴胡皂苷洗脱液；此条件下柴胡皂苷的分离和制备效果最好；
（6）将精制的柴胡皂苷洗脱液在-10~-30℃、-0.08~-0.1mpa条件下进行真空冷冻干燥，得到柴胡皂苷粉末。
优选的，步骤（1）中，所述切片为将柴胡根切成厚度为0.5~2mm的薄片，此厚度的柴胡根薄片有利于破壁机破壁。
优选的，步骤（1）中，晒干至含水量为9%，此含水量条件下一次破壁效率最高，达48%。
优选的，步骤（2）中，将柴胡饮片放入-196℃的液氮中冷冻2min，迅速取出放入破壁机，以30000rpm的转速进行破壁处理2min，此含条件下一次破壁效率最高，达48%。
优选的，步骤（3）中，将一次破壁的柴胡粉调节含水量至3%，冷冻至-75℃，用高压纯化空气切割粉碎机进行二次破壁，空气压力为150mpa，空气流速为700m/s，进料速度为8g/s，进料周期为3s，进料压力为0.2mpa，此条件下二次破壁效率最高，达99.4%。
优选的，步骤（4）中，将二次破壁的柴胡粉、3mol/l的醋酸钠溶液和无水乙醇按照1:5:10的质量比混合，在55℃下搅拌40min，然后于4℃下静置40min，然后4℃下12000rpm离心20min，此条件下柴胡皂苷的提取效率最高，达92%以上，蛋白质和核酸的除杂效果最好，可以去除95%以上的蛋白质和90%以上的核酸。
优选的，步骤（5）中，所述的洗脱条件为：0~10min为100%双蒸水，10-20min为体积比15%：85%的无水乙醇和双蒸水，20-30min为体积比35%：65%的无水乙醇和双蒸水，30-40min为体积比55%：45%的无水乙醇和双蒸水，40-50min为体积比75%：25%的无水乙醇和双蒸水，50-60min为100%的无水乙醇，洗脱液流速为1.2ml/min，此条件下柴胡皂苷的分离和制备效果最好，各个柴胡皂苷的洗脱峰界限清晰，峰型高而尖。
优选的，步骤（6）中，将精制的柴胡皂苷洗脱液在-20℃、-0.1mpa条件下进行真空冷冻干燥。
本发明具备以下的优点和积极效果：
（1）本发明采用先将柴胡的细胞进行破壁再提取柴胡皂苷的工艺，细胞破壁率最高达99.4%，柴胡皂苷提取率最高达92%以上。
（2）本发明采用低温破壁和温和提取方法，能有效避免柴胡皂苷的化学结构发生变化，保证柴胡皂苷良好的药物活性。
（3）本发明采用梯度洗脱方式分离制备柴胡皂苷，分离效果好，制备纯度高。
（4）本发明全程不添加有毒有害化学试剂，提取的柴胡皂苷安全性高。
（5）本发明工艺简单，生产周期短，可操作性强，适合柴胡皂苷的大量提取和制备。
具体实施方式
以下结合实例描述本发明一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法，这些描述并不是对本发明内容的限定。
实施例1
一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜柴胡根洗净、切成厚度为1mm的薄片，晒干至含水量为9%，得到柴胡饮片；
（2）将柴胡饮片放入-196℃的液氮中冷冻2min，迅速取出放入破壁机，以30000rpm的转速进行破壁处理2min，得到一次破壁的柴胡粉，破壁率为48%；
（3）将一次破壁的柴胡粉调节含水量至3%，冷冻至-75℃，用高压纯化空气切割粉碎机进行二次破壁，空气压力为150mpa，空气流速为700m/s，进料速度为8g/s，进料周期为3s，进料压力为0.2mpa，得到二次破壁的柴胡粉，破壁率为99.4%；
（4）将二次破壁的柴胡粉、3mol/l的醋酸钠溶液和无水乙醇按照1:5:10的质量比混合，在55℃下搅拌40min，然后于4℃下静置40min，然后4℃下12000rpm离心20min，取上层清液，得到柴胡皂苷粗提取液；
（5）以制备型高效液相色谱仪对柴胡皂苷粗提取液进行精制，色谱柱为c18反相硅胶色谱柱，填料粒径为5μm，内径为7.8mm，长度为350mm，洗脱条件为：0~10min为100%双蒸水，10-20min为体积比15%：85%的无水乙醇和双蒸水，20-30min为体积比35%：65%的无水乙醇和双蒸水，30-40min为体积比55%：45%的无水乙醇和双蒸水，40-50min为体积比75%：25%的无水乙醇和双蒸水，50-60min为100%的无水乙醇，洗脱液流速为1.2ml/min，将含有柴胡皂苷的洗脱成分回收，得到精制的柴胡皂苷洗脱液；
（6）将精制的柴胡皂苷洗脱液在-20℃、-0.1mpa条件下进行真空冷冻干燥，得到柴胡皂苷粉末。
实施例2
一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜柴胡根洗净、切成厚度为0.5mm的薄片，晒干至含水量为12%，得到柴胡饮片；
（2）将柴胡饮片放入-196℃的液氮中冷冻1min，迅速取出放入破壁机，以20000rpm的转速进行破壁处理1min，得到一次破壁的柴胡粉，破壁率为45%；
（3）将一次破壁的柴胡粉调节含水量至5%，冷冻至-60℃，用高压纯化空气切割粉碎机进行二次破壁，空气压力为100mpa，空气流速为600m/s，进料速度为10g/s，进料周期为2s，进料压力为0.3mpa，得到二次破壁的柴胡粉，破壁率为98.6%；
（4）将二次破壁的柴胡粉、3.5mol/l的醋酸钠溶液和无水乙醇按照1:4:10的质量比混合，在40℃下搅拌45min，然后于4℃下静置30min，然后4℃下15000rpm离心30min，取上层清液，得到柴胡皂苷粗提取液；
（5）以制备型高效液相色谱仪对柴胡皂苷粗提取液进行精制，色谱柱为c18反相硅胶色谱柱，填料粒径为5μm，内径为7.8mm，长度为300mm，洗脱条件为：0~10min为100%双蒸水，10-20min为体积比10%：90%的无水乙醇和双蒸水，20-30min为体积比30%：70%的无水乙醇和双蒸水，30-40min为体积比50%：50%的无水乙醇和双蒸水，40-50min为体积比70%%：30%的无水乙醇和双蒸水，50-60min为100%的无水乙醇，洗脱液流速为1ml/min，将含有柴胡皂苷的洗脱成分回收，得到精制的柴胡皂苷洗脱液；
（6）将精制的柴胡皂苷洗脱液在-10℃、-0.1mpa条件下进行真空冷冻干燥，得到柴胡皂苷粉末。
实施例3
一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜柴胡根洗净、切成厚度为2mm的薄片，晒干至含水量为8%，得到柴胡饮片；
（2）将柴胡饮片放入-196℃的液氮中冷冻2min，迅速取出放入破壁机，以40000rpm的转速进行破壁处理2min，得到一次破壁的柴胡粉，破壁率为44%；
（3）将一次破壁的柴胡粉调节含水量至4%，冷冻至-80℃，用高压纯化空气切割粉碎机进行二次破壁，空气压力为180mpa，空气流速为800m/s，进料速度为6g/s，进料周期为2s，进料压力为0.3mpa，得到二次破壁的柴胡粉，破壁率为99.0%；
（4）将二次破壁的柴胡粉、4mol/l的醋酸钠溶液和无水乙醇按照1:3:10的质量比混合，在60℃下搅拌15min，然后于0℃下静置30min，然后0℃下15000rpm离心10min，取上层清液，得到柴胡皂苷粗提取液；
（5）以制备型高效液相色谱仪对柴胡皂苷粗提取液进行精制，色谱柱为c18反相硅胶色谱柱，填料粒径为5μm，内径为7.8mm，长度为350mm，洗脱条件为：0~10min为100%双蒸水，10-20min为体积比15%：85%的无水乙醇和双蒸水，20-30min为体积比35%：65%的无水乙醇和双蒸水，30-40min为体积比55%：45%的无水乙醇和双蒸水，40-50min为体积比75%：25%的无水乙醇和双蒸水，50-60min为100%的无水乙醇，洗脱液流速为0.8ml/min，将含有柴胡皂苷的洗脱成分回收，得到精制的柴胡皂苷洗脱液；
（6）将精制的柴胡皂苷洗脱液在-30℃、-0.08mpa条件下进行真空冷冻干燥，得到柴胡皂苷粉末。
实施例4
一种从柴胡中提取柴胡皂苷的方法，包括以下步骤：
（1）将新鲜柴胡根洗净、切成厚度为1.5mm的薄片，晒干至含水量为12%，得到柴胡饮片；
（2）将柴胡饮片放入-196℃的液氮中冷冻3min，迅速取出放入破壁机，以20000rpm的转速进行破壁处理3min，得到一次破壁的柴胡粉，破壁率为42%；
（3）将一次破壁的柴胡粉调节含水量至5%，冷冻至-75℃，用高压纯化空气切割粉碎机进行二次破壁，空气压力为150mpa，空气流速为650m/s，进料速度为9g/s，进料周期为4s，进料压力为0.3mpa，得到二次破壁的柴胡粉，破壁率为97.1%；
（4）将二次破壁的柴胡粉、2mol/l的醋酸钠溶液和无水乙醇按照1:4:8的质量比混合，在55℃下搅拌45min，然后于2℃下静置60min，然后2℃下12000rpm离心10min，取上层清液，得到柴胡皂苷粗提取液；
（5）以制备型高效液相色谱仪对柴胡皂苷粗提取液进行精制，色谱柱为c18反相硅胶色谱柱，填料粒径为5μm，内径为7.8mm，长度为350mm，洗脱条件为：0~10min为100%双蒸水，10-20min为体积比20%：80%的无水乙醇和双蒸水，20-30min为体积比40%：60%的无水乙醇和双蒸水，30-40min为体积比60%：40%的无水乙醇和双蒸水，40-50min为体积比80%：20%的无水乙醇和双蒸水，50-60min为100%的无水乙醇，洗脱液流速为0.6ml/min，将含有柴胡皂苷的洗脱成分回收，得到精制的柴胡皂苷洗脱液；
（6）将精制的柴胡皂苷洗脱液在-25℃、-0.09mpa条件下进行真空冷冻干燥，得到柴胡皂苷粉末。