一种X射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统及其制备方法与流程

本发明属于生物医学材料技术领域，具体而言，涉及一种用于x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒(nanoparticles,nps)-光敏剂耦合系统，以及该系统的制备方法和应用。

背景技术：

光动力学治疗(photodynamictherapy,pdt)是光敏剂经静脉给药后，经过4-48小时，使光敏剂选择性地富集在癌症病变部位，再经过特定波长的光源激发，光敏剂分子吸收光子产生大量活性氧物种(reactiveoxygenspecies,ros)杀死病变部位细胞。与传统外科手术、放疗、化疗相比，光动力治疗具有可控的局部光毒性，且安全无创、副作用小，已广泛用于多种恶性实体肿瘤的临床治疗。但是由于紫外—可见光光在人体组织内的穿透深度限制，目前其难以在较大或深部肿瘤开展，临床应用极大受限。

近年来，随着x射线激发纳米发光材料(x-rayluminescencenanoparticles,xlnp)的发展，一种新型光动力学治疗，x射线激发光动力学(x-rayexcitedphotodynamictherapy,xe-pdt)为深部肿瘤的pdt带来了新纪元。其原理为富集在肿瘤部位的xlnp经x射线激发后产生可见光，将其作为内部光源，激发与之耦合的光敏剂，产生ros促使肿瘤细胞凋亡，从而实现癌症治疗。因此，研制出一种发光光谱与光敏剂吸收光谱高度吻合且生物安全性好、光产额较高的xlnp，并将其与成熟光敏剂进行耦合是x射线激发光动力学治疗中关键问题。

碱金属的稀土金属氟化物(aref4,a为碱金属,re为稀土金属)相较于其它x射线激发纳米材料，因为具有更稳定的晶格结构、可控的尺寸、更低的光子能量状态，更宽的能量带隙(energygap,eg)，不易受周围生物环境影响等特性，使其具备了高效且稳定的发光性能以及可调控的高通透性和滞留(enhancedpermeabilityandretention,epr)效应。此外，稀土金属离子具有丰富的能级结构，可以通过改变掺杂的稀土离子，达到调控发光光谱的目的。2015年nanoletters上的研究通过将稀土发光纳米颗粒与fda批准的光敏剂mc540相结合，采用局部x射线照射0.5小时共0.5gy辐射剂量(16.7mgy/min)，可有效激发光敏剂产生ros，杀死60％肿瘤细胞(hongminchen,etc.nanoscintillator-mediatedx-rayinduciblephotodynamictherapyforinvivocancertreatment.nanoletters.2015,15,2249-2256)。2017年，本发明人所在研究小组首次将制备出的β-nagdf4:eu³⁺成功应用于实验动物，在体内x射线激发发光成像(wenlizhang,etc.sub-10nmwater-dispersibleβ-nagdf4:x％eu³⁺nanoparticleswithenhancedbiocompatibilityforinvivox-rayluminescencecomputedtomography.acsappliedmaterials&interface.2017,9(46),pp39985-39993)，为安全高效的xe-pdt奠定了材料基础。然而，x射线激发β-nagdf4:x％eu³⁺纳米粒的发射光谱与rb的吸收光谱不相匹配，故无法实现高效的xe-pdt治疗。本发明的提出有效地解决了这一现实问题。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的首要目的在于提供一种低剂量x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒(nanoparticles,nps)-光敏剂耦合系统。

为了实现本发明的目的，发明人对nagdf4系列发光纳米粒进行了深入研究，意外地发现通过改变掺杂稀土离子为tb³⁺，使其发射光谱与成熟二代光敏剂玫瑰红(rosebengal,rb)吸收光谱高度吻合，从而产生了更多的ros，大幅度降低了x射线的辐射剂量，从而实现了本发明的目的。

具体地，本发明的技术方案概况如下：一种x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统，该系统是将下转换β-nagdf4:x％tb³⁺纳米粒经aep修饰后，加入edc作为激活剂，使发光纳米粒与亲水性光敏剂单步共价耦合而得，其中x＝3～25，aep为2-氨基乙基膦酸(2-aminoethylphosphonicacid,aep)，edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(n-(3-dimethylaminopropyl)-n-ethylcarbodiimidehydrochloridecrystalline,edc)，亲水性光敏剂是在490-540nm处有吸收的光敏剂。

需要说明的是，试验中发现，将β-nagdf4:x％tb³⁺纳米粒表面油酸基团aep进行配体交换后修饰，可以使纳米粒具备良好的水溶性和生物安全性，以实现在较低剂量x射线照射下更安全高效的抑制或杀死癌细胞。

进一步优选地，如上所述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统，其中优选x＝3～18，进一步优选x＝7～15。

在本发明的一个最优选的试验处理组中，如上所述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统，其中x＝15。

在本发明的一个最优选的试验处理组中，如上所述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统，其中的亲水性光敏剂为玫瑰红、mc540或/和在490-540nm处有吸收的其它光敏剂。

进一步优选地，如上所述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统，其中β-nagdf4:x％tb³⁺与aep、edc的质量比为1：(3～5)：(0.8～2)。

再进一步优选地，如上所述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统，其中β-nagdf4:x％tb³⁺、aep、edc及玫瑰红的质量比为1：(3～5)：(0.8～2)：(0.04～0.06)。

另外，本发明还提供了上述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)取β-nagdf4:x％tb³⁺纳米粒和aep分散在醇溶液中，混合形成均一溶液，在室温下搅拌反应12～36小时后，离心得到经aep修饰的纳米粒；

(2)取aep修饰的纳米粒与光敏剂玫瑰红混合于水中，加入edc作为激活剂，室温搅拌反应6～18小时；

(3)将步骤(2)的反应液高速离心，速率为12000～14000rpm，分离出残余溶液中的沉淀物，将沉淀物纯化后获得目标产物。

进一步优选地，如上所述x射线激发光动力学治疗深部肿瘤的新型纳米粒-光敏剂耦合系统的制备方法，其中步骤(1)中所述的醇溶液为体积分数50％～70％的乙醇溶液。

本发明所述的nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒-rb耦合系统与肝癌细胞(hepg-2)共培养，结果显示耦合系统可通过经典的胞吞方式进入细胞，并稳定停留在内涵体/溶酶体等小泡结构中。当nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒-rb耦合系统溶液浓度为500μg/ml，x射线照射100秒时，单态氧产生量达到峰值，且随着照射时间的延长，其单态氧产生量维持在峰值水平。通过荷瘤裸鼠实验，可检测出该型纳米粒-光敏剂耦合系统在不同x射线照射时间下均呈现出显著的治疗效果，对肿瘤的生长起到了非常显著的抑制作用。因此，本发明还提供了上述的新型纳米粒-光敏剂耦合系统在制备x射线激发光动力学治疗肿瘤的药剂中应用。进一步优选地，所述的肿瘤为包括肝癌在内的深部肿瘤，以及浅表肿瘤。

与现有技术相比，本发明涉及的新型纳米粒-光敏剂耦合系统用于x射线激发光动力学治疗肿瘤时具有如下优点和进步性：

(1)本发明的β-nagdf4:x％tb³⁺纳米粒的发射光谱与成熟二代光敏剂rb的吸收光谱高度吻合，经x射线照射后可产生更多的ros，能够有效杀死80％以上肝癌细胞，从而有效抑制肿瘤的生长，首次实现了应用该型耦合系统对深部肿瘤的靶向治疗。

(2)本发明的β-nagdf4:x％tb³⁺-rb耦合系统在光动力学治疗深部肿瘤时，所需x射线照射的辐射剂量非常低，使用电离室测得平均每次每小时照射剂量为0.25gy。

(3)本发明的β-nagdf4:x％tb³⁺-rb耦合系统具有较好的生物安全性，体外细胞实验与小鼠体内实验均验证该系统无明显毒性。

附图说明

图1为β-nagdf4:x％tb³⁺-rb耦合系统的构建及其治疗机制示意图。

图2为β-nagdf4:x％tb³⁺nps制备流程示意图。

图3为β-nagdf4:15％tb³⁺nps的tem图。

图4为β-nagdf4:x％tb³⁺nps的xrd图。

图5为不同tb³⁺掺杂比例的β-nagdf4:x％tb³⁺光产额对比图。

图6(a)为荧光分光法测定β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒的发射光谱及rb吸收光谱图。图6(b)为荧光分光光度计测得β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒与rb共价/物理耦合前后的光谱对比图。图6(c)为β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒与rb物理(左)/共价(右)耦合后的实物对比图。

图7中，(a)为dpbf法测定不同浓度β-nagdf4:15％tb³⁺-rb耦合系统溶液中单态氧产生量对比图；(b-e)激光共聚焦显微镜观察耦合系统与细胞共培养后其在胞内的停留位置，其中(b)为蓝色荧光标记细胞核，(c)为lysotraker标记溶酶或内涵体等小泡结构，(d)为耦合系统荧光，(e)为b、c、d的叠加图；(f-j)透射电镜法检测耦合系统的入胞情况及胞内位置。

图8为mtt法测定细胞毒性，未经x射线照射的纳米粒-光敏剂耦合系统与细胞共培养的细胞成活率柱状图。

图9为mtt法检测纳米粒-光敏剂耦合系统给药后，经x射线照射后的细胞成活率图。

图10为荷瘤裸鼠经瘤体给药4次后，进行瘤体重量比较。其中，(a)为不同给药组的瘤体重量对比柱状图；(b)为不同给药组瘤体对比直观图。

图11为tunnel法检测各组实验组肿瘤细胞凋亡情况图的病理切片图。

图12为he染色法检测各实验组主要脏器情况的病理切片图。

具体实施方式

本发明研制了一种光谱与rb高度吻合的小尺寸、形状规则、粒径分布均匀、光产额较高的纳米粒(β-nagdf4:x％tb³⁺)，并与成熟光敏剂进行耦合(由一定tb³⁺掺杂β-nagdf4纳米发光材料为基质材料，与rb进行共价耦合)，制备出发光核心的发射光谱与rb吸收光谱高度匹配的纳米粒-光敏剂耦合体系。通过x射线激发纳米发光材料，光敏剂吸收发射光后产生ros，诱导肿瘤细胞凋亡，其整体设计如图1所示，整个制备和试验思路如下：

1.x射线激发下转换nagdf4:x％tb³⁺发光纳米粒的制备。

主要采用“油热法”制备nagdf4:x％tb³⁺发光纳米粒，并对其进行tem、xrd检测，分析其晶格结构、颗粒形态以及颗粒直径；使用x射线照射发光纳米粒，分析研究不同tb³⁺掺杂比例的光产额性能。

2.nagdf4:tb³⁺发光纳米粒与rb耦合。

通过对已制备的nagdf4:x％tb³⁺发光纳米粒表面进行aep亲水性修饰，使整个体系保证在高光产额的条件下，具有良好的生物相容性。加入edc作为激活剂，采用共价耦合(酰胺键)的方式，使rb稳定地耦合在纳米颗粒表面。

3.nagdf4:x％tb³⁺发光纳米粒-rb耦合系统的单态氧产生量分析。

通过x射线照射nagdf4:15％tb³⁺纳米粒-rb耦合系统溶液，运用1,3-二苯基异苯并呋喃(1,3-diphenylisobenzofuran,dpbf)来定量分析溶液中单态氧的产生量。

4.纳米粒-光敏剂耦合系统的生物安全性及胞吞测试。

基于nagdf4:15％tb³⁺-rb耦合系统的单态氧产生量分析结果，将耦合系统与肝癌细胞(hepg-2)共培养，通过共聚焦显微镜及细胞透射电镜法研究耦合系统的入胞能力，观察其入胞过程。采用mtt法验证不同浓度耦合系统自身的细胞毒性。

5.纳米粒-光敏剂耦合系统的体外评价。

通过肝癌细胞hepg2检测纳米粒-光敏剂耦合系统体外xe-pdt治疗效果。通过将肝癌细胞hepg2与耦合系统进行共培养24小时，使耦合系统通过epr效应有效的进入癌细胞内部，并通过照射不同时长的x射线进行xe-pdt的体外治疗。然后使用mtt法来测定细胞的成活率，以此判断耦合系统对肝癌细胞的体外疗效。

6.纳米粒-光敏剂耦合系统的小鼠在体评价。

通过荷瘤裸鼠检测纳米粒-光敏剂耦合系统体内xe-pdt治疗效果。荷瘤裸鼠经瘤体给药方式注入耦合系统，先后照射不同时长的x射线，比较瘤体大小及质量，并对瘤体石蜡切片进行tunnel染色，观察各对照组瘤体中肿瘤细胞凋亡情况。通过he染色法观察治疗各组裸鼠主要脏器情况，评价nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒—rb耦合系统的系统毒性及生物安全性。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容和本领域的常规技术手段予以实施，下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1：x射线激发下转换β-nagdf4:x％tb³⁺发光纳米粒的制备

称量出0.3159g的gdcl3·6h2o、0.056g的tbcl3·6h2o的稀土原料和6ml的油酸(oleicacid,oa)、15ml的1-十八烯(1-octadecene,ode)加入到100ml圆底烧瓶中。在氩气保护气氛下加热至160℃反应60分钟，形成均一透明溶液，略微带淡黄色。关闭加热设备，当体系温度降至室温后将溶解在甲醇中的nh4f(4mmol，0.1481g)、naoh(2.5mmol，0.1g)混合溶液缓慢滴加到烧瓶中，时间控制在15～20min为宜。在室温条件下，剧烈搅拌60分钟。升温至110℃-120℃进行抽真空操作10分钟。结束后，快速升温至290℃，并在此温度保持1小时。待反应结束后降至室温，用无水乙醇、甲醇离心洗涤3次分散在环己烷中，整个β-nagdf4:x％tb³⁺纳米粒制备流程如图2所示。图3是β-nagdf4:15％tb³⁺nps的透射电镜(transmissionelectronmicroscope,tem)图，可以看到nps的形貌为均一球体，且分散性良好，尺寸在7-10nm。图4是nagdf4:x％tb³⁺(x＝3、5、7、9、12、15、18、20、22、25)的x射线衍射(x-raydiffraction,xrd)图，从图中可以看出nagdf4:tb³⁺结晶性良好，晶格结构为β相，且与六方相nagdf4的jcpds卡片完全匹配。当tb³⁺掺杂比例为15％时，光产额最高(如图5所示)，故将其作为后续体内外研究的材料基础。

实施例2：β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒与rb共价耦合

在50ml圆底烧瓶中加入6ml无水乙醇与4ml蒸馏水，称取将β-nagdf4:15％tb³⁺纳米颗粒10mg，溶于1ml的环己烷后加入圆底烧瓶。称取40mgaep加入圆底烧瓶，在室温下剧烈搅拌24小时后，用蒸馏水离心洗涤3次后重新分散在1ml的蒸馏水中，并加入0.05mg光敏剂rb与10mg的激活剂edc，在室温条件下搅拌12小时，用蒸馏水高速离心洗涤3次，离心速率13000rpm，得到纳米粒-光敏剂耦合系统。

将rb与β-nagdf4:15％tb³⁺nps进行耦合，观察由x射线激发后β-nagdf4:15％tb³⁺的发射光谱与rb吸收光谱的匹配程度，分别测定静电吸附与共价耦合的rb吸收峰强度的差异，计算rb结合率，选取最佳的rb耦合方式。通过荧光分光光度法实验分析可得出，经x射线激发后，β-nagdf4:15％tb³⁺nps的发射光谱与rb的吸收光谱高度匹配(如图6a所示)，且荧光光谱法测定rb结合率表明，通过共价耦合的方式结合的rb量远高于静电吸附方式，所结合的rb量可完全吸收β-nagdf4:15％tb³⁺nps发出的发射光(如图6b所示)，且由直观比色法也可以看出，共价耦合的rb量远高于静电吸附(如图6c所示)。

实施例3：β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒-rb耦合系统的单态氧产生量分析

采用x射线照射耦合β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒-rb耦合系统溶液，运用1,3-二苯基异苯并呋喃(1,3-diphenylisobenzofuran,dpbf)法来定量分析溶液中单态氧的产生量，实验结果表明，当耦合系统溶液中rb浓度为500μg/ml，x射线照射100秒时，单态氧产生量达到峰值，且随着照射时间的延长，其单态氧产生量维持在峰值水平(如图7a所示)。

实施例4：人体肝癌细胞系hepg-2细胞复苏、培养和传代

人体肝癌细胞系hepg-2，购自于thermofisherscientific公司。取出冻存管后，投入37℃水浴中，震荡解冻2min，酒精消毒管壁外侧后，将其转入超净台中，将管内细胞转移至离心管中，加入5ml37℃预热的含10％胎牛血清的dmem培养基，并清洗冻存管1次，将离心管离心(1000rpm,5min)，弃去上清液，再加入2ml37℃预热的含10％胎牛血清的dmem培养基，转入培养瓶中，放置于37℃、5％co2饱和湿度的培养箱中孵育，并以0.5％胰蛋白酶消化并常规传代。

实施例5：纳米粒-光敏剂耦合系统的肝癌细胞体外评价

基于β-nagdf4:15％tb³⁺发光纳米粒-rb耦合系统的单态氧产生量分析结果，将耦合系统与肝癌细胞(hepg-2)共培养，通过共聚焦显微镜及细胞透射电镜法研究耦合系统的入胞能力，观察其入胞过程。实验结果表明，耦合系统可通过经典的胞吞方式进入细胞，并稳定停留在内涵体/溶酶体等小泡结构中(如图7b-j所示)。mtt法验证耦合系统自身细胞毒性，实验结果表明，单纯耦合系统在未经x射线照射下与细胞共培养，即使高浓度给药组也未显现出明显的细胞毒性(如图8所示)。而在x射线照射1个小时，使用电离室测得照射剂量为1.17gy，500μg/ml以上浓度的耦合系统给药组均显现出明显的细胞杀伤作用，细胞成活率不足10％(如图9所示)。以上结果在体外证明xe-pdt的治疗作用，为体内实验提供给药剂量，x射线照射剂量及照射时间等参数参考。

实施例6：纳米粒-光敏剂耦合系统的小鼠在体评价

通过荷瘤裸鼠考察纳米粒-光敏剂体内xe-pdt的治疗效果。荷瘤裸鼠经瘤体给药方式注入耦合系统(每3天注射1次，不同浓度给药，每次每只瘤体注射100μl)，给药后12小时进行x射线照射1个小时，总计给药4次、照射x射线4个小时，使用电离室测得4小时总照射剂量为1gy，可得出平均每次每小时照射剂量为0.25gy。

4次给药后处死裸鼠，比较瘤体大小及瘤体重量，考察体内xe-pdt治疗效果。实验结果表明，纳米粒-光敏剂耦合系统给药组(20mg/ml)在不同x射线照射时间下均呈现出显著的治疗效果，肿瘤重量不足生理盐水对照组的1/10(图10)。对瘤体石蜡切片进行tunnel染色，观察各对照组瘤体中肿瘤细胞凋亡情况。实验结果与肿瘤抑制率实验一致，np-rb给药经x射线照射组，肿瘤细胞凋亡最严重，且出现大面积坏死区(图11)。

通过he染色法观察治疗各组裸鼠主要脏器情况，评价纳米粒-耦合系统的系统毒性及生物安全性。如图12所示，未经x射线照射的各治疗组各个脏器情况良好，未见明显异常。x射线照射单纯纳米粒给药组脾脏生发中心略微受损，该情况也出现在nps-rb给药+x射线照射组。