KB-R7943或Bepridil在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体地说，涉及钠钙交换体抑制剂kb-r7943或bepridil在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。

背景技术：

神经胶质瘤是人类大脑最常见的恶性肿瘤，占中枢神经系统肿瘤的40％～50％，主要分为星型细胞瘤、胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤等类型。神经胶质瘤的英文名称为glioma或者glioblastoma。神经胶质瘤患者分为不同的级别，1-2级患者的生存期一般5-10年左右；3-4级患者较短，1年左右。神经胶质瘤具有高复发率、高病死率和低治愈率的特点，由于其分化差、增殖快、侵袭性强，目前的手术方式还无法完全切除肿瘤，手术后放射治疗和化学药物治疗是普遍接受的治疗方法。然而肿瘤细胞对放疗的辐射耐受性可能造成残余的病灶再次复发。另外，肿瘤耐药性的产生，全身用药的不良反应等因素均对化疗的治疗效果造成影响。如何提高神经胶质瘤的治疗效果，提高病人的生命质量和预后，仍是神经科医生面临的巨大难题。

现有的治疗神经胶质瘤的化疗药物主要有尼莫斯汀、卡莫斯汀、洛莫斯汀、甲基苄肼和甲氨喋呤等，近年来常用的是福莫司汀和替莫唑胺(temozolomide，tmz)。神经胶质瘤对这些化疗药物产生了明显的多药耐药性，胶质瘤的化疗效果长期以来一直不理想，亟待开发新的治疗药物，解决神经胶质瘤的药物治疗难题。

kb-r7943和bepridil的分子式和化学结构如图1所示。kb-r7943的药理作用是抑制细胞膜上的钠钙交换体(na⁺/ca²⁺exchanger,ncx)，目前还没有临床使用的报道，动物实验显示kb-r7943有抗心律失常和保护心肌缺血的作用。bepridil的中文名是苄普地尔，是一种临床上正在使用的心血管药物。bepridil的药理学作用主要是抑制钠钙交换体(ncx)和抑制钙离子慢通道，临床上用于治疗心绞痛、各种心律失常和高血压。

中国专利201380079011.7公开了用于减轻神经系统损伤的组合物，其具体公开一种用于减轻受治者神经损伤的方法，包括：向所述受治者施用治疗有效量的包含阿米洛利、阿米洛利类似物或它们的药学上可接受的盐的药物组合物，其中，所述阿米洛利类似物包括kb-r7943。现有技术中，关于化合物kb-r7943或bepridil在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用，目前还未见报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供钠钙交换体抑制剂kb-r7943或bepridil的制药新用途。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种治疗神经胶质瘤的药物组合物。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

钠钙交换体抑制剂kb-r7943或bepridil在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物的活性成分为kb-r7943。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物的活性成分为bepridil。

作为本发明的一个优选实施方案，所述药物单独使用或者以药物组合物的形式使用；所述药物组合物包含治疗有效量的kb-r7943或bepridil，也可以同时包含kb-r7943和bepridil，以及药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体包括但并不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、甜味剂、湿润剂。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种治疗神经胶质瘤的药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的kb-r7943或bepridil，也可以同时包含kb-r7943和bepridil，以及神经胶质瘤常规化疗药物。

作为本发明的一个优选实施方案，把kb-r7943或bepridil与其他常规化疗药物合并使用，可以增强神经胶质瘤对其他常规化疗药物的敏感性。

所述常规化疗药物包括但不限于：替莫唑胺、尼莫斯汀、卡莫斯汀、洛莫斯汀、甲基苄肼、甲氨喋呤或福莫司汀。

作为本发明的一个优选实施方案，所述常规化疗药物为替莫唑胺。

由于kb-r7943和bepridil口服以后，可以通过血脑屏障进入脑组织发挥作用，因此包含本发明化合物的药物组合物可以根据现有技术常规方法制备固/液体口服药物制剂或静脉注射液。

固体口服形式的药物制剂可以包括稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、甜味剂、湿润剂以及药物制剂中常用的无活性且无药理活性的物质。这些药物制剂可以以现有技术已知的方法进行制备。例如，通过混合、制粒、制片、糖包衣或膜包衣处理的方法，制备成胶囊剂、颗粒剂、片剂或合剂。示例性的稀释剂例如可以是：乳糖、右旋糖、二糖、蔗糖、纤维素、玉米淀粉或马铃薯淀粉；润滑剂可以是：硅石、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁或钙和/或聚乙二醇；粘合剂可以是：淀粉类、阿拉伯胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮；崩解剂可以是：淀粉、海藻酸、海藻酸盐或淀粉羟乙酸钠；湿润剂可以是：卵磷脂、聚山梨酯、月桂硫酸盐(酯)；和。

液体口服形式的药物制剂可以是糖浆、乳剂或混悬液。糖浆可以包含作为载体的二糖，或者二糖和甘油和/或甘露醇和山梨糖醇。混悬液和乳剂可以包含作为载体例子的天然胶、琼脂、海藻酸钠、果胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素或聚乙烯醇。

静脉注射剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。

所述治疗有效量，是指本发明化合物的施加量足以达到治疗预期目的量，其根据治疗前所期望的治疗效果实现。治疗有效量的确定是本领域技术人员的常规技术手段，有效量取决于多种因素，例如接受治疗个体的体型和/或个体所患疾病或不希望有的病症的发展程度。有效量也取决于药效化合物是否以单一剂量及用药频率。

本发明中的药物治疗个体，包括哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的例子包括但不限于：哺乳动物类的任何成员，例如成年人、儿童、非人的灵长类猩猩，以及其他猿和猴类；农场动物例如牛、马、羊、山羊、猪；家畜类动物例如兔、狗和猫；实验室动物包括啮齿类，例如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的例子包括但不限于，鸟、鱼等。

本发明提供的抗肿瘤药物能有效杀灭神经胶质瘤细胞，目前没有产生耐药性和抗药性，药物作用靶点与既往药物不同，属于老药新用，有望给神经胶质瘤的治疗带来光明前景。

在治疗神经胶质瘤的过程中，本发明的药物可以单独使用，也可以与手术治疗合用，或与其他化疗药物合用，与放射性治疗方法合用，产生综合治疗效果。

本发明提供的抗肿瘤药物具有见效快、疗效好的优点，细胞实验和动物实验结果显示：化学物质kb-r7943和bepridil对神经胶质瘤细胞的生长都有抑制作用，这两个药物在较高浓度杀死神经胶质瘤细胞，因此化合物kb-r7943和bepridil可用于制备治疗神经胶质瘤的药物，改善神经胶质瘤患者的预后和提高生存率，减轻社会负担。

kb-r7943和bepridil都是已知的化合物，本发明将钠钙交换体抑制剂kb-r7943和bepridil应用到神经胶质瘤的治疗，属于老药新用，有显著的创新性。

文献表明kb-r7943和bepridil口服以后，可以通过血脑屏障进入脑组织发挥作用，所以患者可以口服这两种药物，静脉注射也可以，用于治疗神经胶质瘤。与现有的抗胶质瘤药物相比较，kb-r7943和bepridil作用于全新的药物靶点，即细胞膜上的钠钙交换体，杀灭肿瘤细胞的机制与以往的药物完全不同，目前也没有产生耐药性。

附图说明

附图1为kb-r7943和bepridil的分子式和化学结构。

附图2为kb-r7943和bepridil抑制神经胶质瘤细胞生长的剂量-效应关系曲线图。

附图3为给药两周后不同实验组大鼠脑内神经胶质瘤体积对比。

附图4为对照组和kb-r7943治疗组荷胶质瘤大鼠生存时间对比。

附图5为对照组和bepridil治疗组荷胶质瘤大鼠生存时间对比。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1细胞实验

实验过程中，用dmem+10％的胎牛血清培养人神经胶质瘤细胞系u87、u251和sf188，细胞以8000个/孔接种于96孔板，放入含有5％二氧化碳的37℃培养箱内培养。待细胞长到70％-80％后，在培养基中加入一系列不同浓度的药物(kb-r7943或bepridil)，药物孵育3天以后观察胶质瘤细胞的生存和死亡情况，采用cck-8方法检测细胞活性。结果发现kb-r7943和bepridil都能显著抑制肿瘤细胞的生长，它们对u87胶质瘤细胞50％的抑制浓度(ic50)分别为17.30μm和12.93μm，在浓度大于20μm时能够杀死肿瘤细胞。kb-r7943和bepridil抑制神经胶质瘤细胞生长的剂量-效应关系如图2所示。

替莫唑胺(tmz)是目前治疗神经胶质瘤的一线化疗药物，我们的细胞培养和药物作用实验表明，替莫唑胺抑制神经胶质瘤细胞生长的50％抑制浓度(ic50)约为48.6μm。为了观察kb-r7943和bepridil能否增加肿瘤细胞对替莫唑胺的敏感性，我们将替莫唑胺与kb-r7943合并使用，这时替莫唑胺抑制胶质瘤细胞生长的ic50为5.02μm，kb-r7943抑制胶质瘤细胞生长的ic50为5.38μm，两药合用产生的分级抑制浓度指数(fici,thefractionalinhibitoryconcentrationindex)为0.41，该fici指数小于0.5，所以两药合用产生协同抗癌作用，并且kb-r7943增加了神经胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。

另外，我们也把替莫唑胺与bepridil合用，这时替莫唑胺抑制胶质瘤细胞生长的ic50为5.59μm，bepridil抑制胶质瘤细胞生长的ic50为3.71μm，两药合用的分级抑制浓度指数(fici)为0.40，该fici指数小于0.5，所以两药合用产生协同抗癌作用，并且bepridil增加了神经胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。

总之，我们通过体外细胞实验证明，kb-r7943和bepridil对神经胶质瘤细胞都有显著的杀灭作用。并且，将kb-r7943或bepridil与其他常规化疗药物合并使用，可以增强神经胶质瘤对其他常规化疗药物的敏感性。

实施例2体内动物实验

1)大鼠c6神经胶质瘤细胞的培养和体内种植：

用含10％胎牛血清的高糖dmem培养大鼠c6神经胶质瘤细胞，置于37℃、含5％co2的培养箱内传代生长。取对数生长期细胞，用pbs洗和0.25％胰酶消化，用pbs收集细胞制成细胞悬液，台盼蓝染色试验鉴定细胞存活率大于92％，调整细胞浓度为100000/μl后种植到大鼠脑内。

大鼠原位脑胶质瘤模型的种植，将c6细胞种植到大鼠右侧脑尾状核区。采用清洁级wistar大鼠45只,每只200-310g,均为雄性,购自上海交通大学医学院实验动物中心。大鼠腹腔注射2％戊巴比妥钠麻醉后，固定于立体定位仪上(型号68001，深圳瑞沃德生命科技有限公司)。剪去头顶部毛发，碘伏消毒，切开头皮，暴露颅骨。右侧脑尾状核区的坐标为前囟中点前1.0mm,矢状缝右旁开3.2mm,在此位置用牙科钻开一个小孔，然后用50μl微量注射器抽取c6细胞悬液10μl(含1000000个细胞)，沿骨孔缓慢垂直进针至硬脑膜下6mm，再退回1mm。缓慢注射10分钟后留针5分钟，缓慢拔针之后用骨蜡封闭骨孔，缝合头皮。

2)药物治疗和观察。实验分为三组：1)对照组；2)kb-r7943治疗组；3)bepridil治疗组。每组各15只大鼠，c6细胞种植后第6天开始分别接受kb-r7943和bepridil治疗。kb-r7943和bepridil配制方法是先用dmso溶解，最后溶解于阿拉伯树胶水溶液(5％)。kb-r7943(30mg/kg)和bepridil(50mg/kg)溶液通过灌胃给药，每天一次，连续给药2周。对照组15只，应用同样的阿拉伯树胶水溶液按照相同的时间点灌胃。移植后第20天，从每组中取6只大鼠，用多聚甲醛灌流固定，取脑后沿大鼠脑表面的接种穿刺点做冠状切开，取出肿瘤组织并按垂直和水平方向测量肿瘤大小,肿瘤体积＝a²×b×π/6(a为肿瘤短径，b为肿瘤长径)。剩余动物用来观察其生存期和作生存曲线分析。生存曲线绘制应用kaplan-meier氏方法，统计学检验方法为log-rank检验。

实验结果如下：

1)kb-r7943和bepridil显著抑制大鼠脑内神经胶质瘤的生长。

结果如图3所示，图中显示连续给药2周以后，kb-r7943和bepridil两个治疗组的肿瘤体积明显小于对照组。**表示两个治疗组分别与对照组比较得出p<0.01,每组数量n＝6，统计方法为方差分析(2-wayanova)。

2)kb-r7943治疗显著延长了荷胶质瘤大鼠的生存时间。

结果如图4所示，对照组大鼠中位生存时间为32天，平均生存时间为31.78±3.15天；kb-r7943治疗组中位生存时间为39天，平均生存时间为38.78±6.46天。图中显示应用kaplan-meier氏方法绘制的生存曲线，经log-rank检验后发现，kb-r7943治疗大鼠的生存时间比对照组显著延长(p<0.05,每组n＝9)。

3)bepridil治疗显著延长了荷胶质瘤大鼠的生存时间。

结果如图5所示，对照组大鼠中位生存时间为32天，平均生存时间为31.78±3.15天；bepridil治疗组中位生存时间为38天，平均生存时间为38.22±5.96天。图中显示应用kaplan-meier氏方法绘制的生存曲线，经log-rank检验后发现，bepridil治疗大鼠的生存时间比对照组显著延长(p<0.05,每组n＝9)。

体内动物实验结论：针对大鼠脑内种植神经胶质瘤的动物模型，采取灌胃给药的方法分别给予kb-r7943和bepridil进行药物治疗，2周以后发现kb-r7943和bepridil均能显著抑制神经胶质瘤的生长，并且均能显著延长荷胶质瘤大鼠的生存时间。体内动物实验证明kb-r7943和bepridil对神经胶质瘤有治疗作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。