本发明涉及干细胞
技术领域：
，特别涉及一种防治糖尿病足的干细胞组合物及其应用、干细胞制剂。
背景技术：
：近年来，随着世界人口老龄化的速度加快，糖尿病患者的数目急剧增加，严重影响了个人的生活质量。糖尿病的危害性很大程度上源于它的多种并发症，其中缺血性糖尿病足是最常见且最严重的并发症之一，且因其较高的病死率、截肢率和感染率，成为糖尿病患者致残和致死的常见原因。糖尿病足的主要临床表现为间歇性跛行、静息痛、足部溃疡和坏疽等，不但给患者造成痛苦，而且给社会和家庭带来了巨大的经济负担。长期以来对于糖尿病足的治疗处于相对混乱无序的状态，大量患者分散于骨科、普外科、内科、中医科，临床医生多将其归为神经病变和感染，下肢缺血引起的糖尿病足溃疡远未受到应有的重视。目前对缺血性糖尿病足的治疗仍缺乏有效的手段，由于其累及范围广，且有多支及多节段性等特点，传统治疗主要是内科的药物治疗和外科的血流重建,然而对于因远端流出道动脉闭塞性病变导致的足部缺血来说，药物治疗不能从根本上解决问题,外科血流重建是首先应该考虑的方法。但是,此类患者多为年老体弱，经常伴有心脑血管病变，无法接受动脉搭桥或下肢动脉介入等外科治疗而经常面临着截肢的危险。总之，目前临床上一般采用药物、血管搭桥、介入手术等方式治疗，都具有一定局限性，远期效果很不理想。如何促进糖尿病缺血下肢血管再生和有效循环的建立是治疗关键。干细胞是一类具有自我复制能力和分化能力的多潜能细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，医学界将其称之为“万用细胞”。而干细胞移植作为治疗血管再生的新疗法，为糖尿病足患者带来了希望，并成为近年来研究的热点。其治疗机制主要是参与新生血管形成、启动和分泌相关因子、免疫调节以及干细胞的增殖和分化能力等有关。干细胞移植后，一方面整合于受损的血管丛，在缺血、缺氧环境下可诱导生成血管内皮细胞、平滑肌细胞等，使其分化、形成新生毛细血管，促进血管再生；另一方面，干细胞可通过自分泌或旁分泌途径等反应性分泌多种生长因子，如血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和神经生长因子等细胞因子，与内皮细胞膜上的相应受体结合，促进内皮细胞增殖、迁移、重塑，形成新生血管，进一步促进局部新生血管形成、神经再生和重构等，最终可改善微循环，恢复患肢血流，提高患肢皮肤温度，实现促进创面愈合，达到治疗目的。外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)，即外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。徐世民于2013年发表的《自体外周血干细胞移植治疗糖尿病足的疗效及其与cd34+水平关系的研究》文章中报道了自体外周血干细胞移植后患者有明显的侧支循环建立，局部血运改善，利于溃疡愈合，从而避免了截肢或最大限度降低了截肢平面。目前还未见将间充质干细胞与外周血单个核细胞共同治疗缺血性糖尿病足的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种防治糖尿病足的干细胞组合物及其应用、干细胞制剂。该干细胞组合物可有效防治糖尿病足，效果好于干细胞或外周血单个核细胞单独使用的效果。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种干细胞组合物，由间充质干细胞和外周血单个核细胞组成。在本发明中将间充质干细胞和外周血单个核细胞联合使用后，可有效治疗糖尿病足，效果好于干细胞或外周血单个核细胞单独使用的效果。作为优选，干细胞组合物中间充质干细胞与外周血单个核细胞的细胞数量比例为(1～5)：(1～5)。在本发明提供的实施例中，干细胞组合物中间充质干细胞与外周血单个核细胞的细胞数量比例为1：1。作为优选，间充质干细胞为脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。本发明还提供了该干细胞组合物在制备预防和/或治疗糖尿病足药物中的应用。本发明还提供了一种干细胞制剂，包括间充质干细胞、外周血单个核细胞、人血白蛋白和溶媒。在本发明提供的实施例中，干细胞制剂的剂型为静脉注射剂或皮下注射剂。作为优选，干细胞制剂为静脉注射剂，各组分浓度为：间充质干细胞：(1～5)×105个/ml；外周血单个核细胞：(1～5)×105个/ml；人血白蛋白：5wt％；溶媒：补足。在本发明中，静脉输注静脉注射液按照体重以5～10×105个/kg的标准将本发明干细胞制剂沿静脉回输至患者体内。作为优选，干细胞制剂为皮下注射剂，各组分浓度为：间充质干细胞：(1～5)×106个/ml；外周血单个核细胞：(1～5)×106个/ml；人血白蛋白：5wt％；溶媒：补足。优选地，干细胞制剂为皮下注射剂，各组分浓度为：间充质干细胞：2×106个/ml；外周血单个核细胞：2×106个/ml；人血白蛋白：5wt％；溶媒：补足。在本发明中，患处局部注射皮下注射剂时，将含2×107个间充质干细胞的干细胞制剂装入5ml注射器，缓慢注入患处，注射完毕后用无菌纱布按压针眼处3～5min，患者俯卧30min，期间每5min活动患处8～10次。作为优选，溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。在本发明提供的实施例中，溶媒为生理盐水。本发明提供了一种防治糖尿病足的干细胞组合物及其应用、干细胞制剂。该干细胞组合物由间充质干细胞和外周血单个核细胞组成。本发明至少具有如下优势之一：1、本发明干细胞组合物可有效防治糖尿病足，效果好于干细胞或外周血单个核细胞单独使用的效果，间充质干细胞和外周血单个核细胞联合使用具有协同增效作用。2、使用安全，没有毒副作用。间充质干细胞具有来源广泛、含量丰富、分离简单、体外扩增稳定容易、不涉及伦理问题、便于自体/异体移植、免疫原性低、对供区损伤小等优势，备受临床医生的重视。研究显示，间充质干细胞能够有效调节免疫，分泌营养因子修复受损血管、促进新生血管生成、改善微环境等，为糖尿病下肢血管病变治疗提供了新途径。3、本发明干细胞组合物及其制剂能标本兼治，收到治本效果；治疗方法简便易行，患者都能接受和使用，对于那些无法进行下肢搭桥的，及年老体弱、并伴发其他疾病不能接受手术搭桥的患者来说尤为合适。具体实施方式本发明公开了一种防治糖尿病足的干细胞组合物及其应用、干细胞制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的一种防治糖尿病足的干细胞组合物及其应用、干细胞制剂中所用原料或辅料均可由市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1脐带间充质干细胞的培养与收集(1)在无菌条件下，取离开母体时间不超过2h的新鲜脐带，并筛查产妇是否携带传染性疾病病原体，将来源于健康供者(乙肝表面抗原、丙肝抗体、梅毒抗体和艾滋病抗体阴性)的新鲜脐带置于含有双抗的pbs中于4℃保温箱中运回实验室；(2)将新鲜脐带用无菌的pbs清洗，再用75％乙醇消毒，然后用pbs清洗干净，前后清洗消毒所用溶液体积均为能将脐带浸泡在其中为宜，去除脐带最外层膜及静、动脉后，将脐带剪碎至20mm3大小的块，将其以0.5～1cm的间距均匀接种于培养皿中，缓慢加入50～100μl/cm2完全培养基，置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中静止培养；(3)细胞贴壁融合后，使用胰酶进行消化，离心，分装至多个培养皿中进行传代培养。实施例2骨髓间充质干细胞的培养与收集(1)在无菌条件下，将通过骨髓穿刺抽取的患者骨髓组织转移至50ml离心管中，加入dmem-lg培养基等倍稀释混匀后，500rpm/min离心10min。离心后吸取上层的脂肪及上清弃掉；(2)在剩余沉淀中加入dmem-lg培养基等倍稀释混匀，并沿管壁加入到含与剩余沉淀等体积的ficoll淋巴分离液的试管中，2200rpm/min离心30min。收集离心后界面雾状层单个核细胞，转移至新的50ml离心管中，加入pbs洗涤细胞，离心后倒掉上清液，根据细胞计数结果，调整细胞密度为2×105cell/ml接种于培养皿中，置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中静止培养；(3)细胞培养72h时首次换液，去除未贴壁细胞，此后2～3d换液一次，直到细胞生长至融合度达80％，胰酶消化传代培养，传至第4代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用pbs缓冲溶液洗涤，细胞计数后离心收集。实施例3脂肪间充质干细胞的培养与收集(1)将无菌条件下抽取的脂肪组织分装至50ml离心管中，每管20ml。每管中加入等体积的0.5％ⅰ型胶原酶(终浓度为0.25％)，充分混匀，封口，转移至恒温空气摇床中，37℃、100rpm消化1h。每管加入4mlfbs终止消化，混匀。1500rpm/min离心5min。弃去上两层液体，每管加入40mlpbs重悬细胞，人工计数后离心收集。弃上清，将细胞以1×105个/ml接种于培养皿中，置于37℃，co2浓度为5％的培养箱中静止培养。(2)24h后首次换液，弃去悬浮细胞，随后每三天换一次液。当细胞融合度达85％时，胰酶消化传代培养，传至4代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用pbs缓冲溶液洗涤，人工计数后离心收集。实施例4外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)的制备与收集(1)采集10～80ml的外周血，将其与生理盐水按体积比1：1的比例混匀，将混匀后的血液混合液与淋巴细胞分离液按体积比2:1的比例缓慢地加至淋巴细胞分离液上层，700g离心20min；(2)离心后从上到下看，分别为血浆、白膜层(即pbmc层)、淋巴细胞分离液、红细胞层，抽取pbmc层，将收集到的pbmc用生理盐水重悬后，500g离心10min，重复洗涤两次，收集到pbmc；(3)将收集到的pbmc用rpmi1640基础培养基重悬，按1×106个/ml密度接种于培养瓶中，同时添加细胞生长因子il-2500u/ml和il-1530ng/ml，置于37℃，浓度为5％的co2培养箱中培养；(4)诱导5天后，进行补液，补液前细胞密度不大于3×106个/ml，补液后细胞密度在0.5～1.0×106个/ml，然后每隔3天补液和补加细胞生长因子，直至第14天收集细胞。实施例5组合制剂的制备将实施例1获得的脐带间充质干细胞传至第4代后，观察细胞生长状态，用胰酶消化后使用生理盐水洗涤，离心收集。最后把细胞沉淀按照所需回输剂量重悬于生理盐水和5％人血白蛋白制剂基质中，用70μm细胞筛网过滤后注入氯化钠注射液袋中。制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，包括：干细胞形态、存活率、内毒素、细菌、真菌等检测。检测结果合格后，将制剂放置在无菌盒中低温运送至诊疗室用于治疗。根据计数结果，将实施例4的外周血单个核细胞沉淀按照所需回输剂量重悬于生理盐水和5％人血白蛋白制剂基质中，用70μm细胞筛网过滤后注入氯化钠注射液袋中。制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，包括：干细胞形态、存活率、内毒素、细菌、真菌等检测。检测结果合格后，将制剂放置在无菌盒中低温运送至诊疗室用于治疗。脐带间充质干细胞混合细胞制剂的制备：将脐带间充质干细胞制剂和外周血单个核细胞制剂按照细胞数量1:1的比例充分混匀制成。静脉注射液混合制剂中，脐带间充质干细胞的浓度为(1～5)×105个/ml(总输注体积为100ml，浓度根据回输剂量具体确定)，外周血单个核细胞的浓度为(1～5)×105个/ml(总输注体积为100ml，浓度根据回输剂量具体确定)；人血白蛋白为5wt％。脐带间充质干细胞与外周血单个核细胞比例为1:1。皮下注射液混合制剂中，脐带间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，外周血单个核细胞的浓度为2×106个/ml；人血白蛋白为5wt％。实施例6组合制剂的制备根据计数结果，把实施例2的骨髓间充质干细胞沉淀按照所需回输剂量重悬于生理盐水和5％人血白蛋白制剂基质中，用70μm细胞筛网过滤后注入氯化钠注射液袋中。制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，包括：干细胞形态、存活率、内毒素、细菌、真菌等检测。检测结果合格后，将制剂放置在无菌盒中低温运送至诊疗室用于治疗。根据计数结果，将实施例4的外周血单个核细胞沉淀按照所需回输剂量重悬于生理盐水和5％人血白蛋白制剂基质中，用70μm细胞筛网过滤后注入氯化钠注射液袋中。制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，包括：干细胞形态、存活率、内毒素、细菌、真菌等检测。检测结果合格后，将制剂放置在无菌盒中低温运送至诊疗室用于治疗。骨髓间充质干细胞混合细胞制剂的制备：将骨髓间充质干细胞制剂和外周血单个核细胞制剂按照细胞数量1:1的比例充分混合制成。静脉注射液混合制剂中，骨髓间充质干细胞的浓度为(1～5)×105个/ml(总输注体积为100ml，浓度根据回输剂量具体确定)，外周血单个核细胞的浓度为(1～5)×105个/ml(总输注体积为100ml，浓度根据回输剂量具体确定)；人血白蛋白为5wt％。骨髓间充质干细胞与外周血单个核细胞比例为1:1。皮下注射液混合制剂中，骨髓间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，外周血单个核细胞的浓度为2×106个/ml；人血白蛋白为5wt％。实施例7组合制剂的制备根据计数结果，把实施例3的脂肪间充质干细胞沉淀按照所需回输剂量重悬于生理盐水和5％人血白蛋白制剂基质中，用70μm细胞筛网过滤后注入氯化钠注射液袋中。制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，包括：干细胞形态、存活率、内毒素、细菌、真菌等检测。检测结果合格后，将制剂放置在无菌盒中低温运送至诊疗室用于治疗。根据计数结果，将实施例4的外周血单个核细胞沉淀按照所需回输剂量重悬于生理盐水和5％人血白蛋白制剂基质中，用70μm细胞筛网过滤后注入氯化钠注射液袋中。制剂制成后，3h内对新鲜制得的制剂进行检测，包括：干细胞形态、存活率、内毒素、细菌、真菌等检测。检测结果合格后，将制剂放置在无菌盒中低温运送至诊疗室用于治疗。脂肪干细胞混合细胞制剂的制备：将脂肪干细胞制剂和外周血单个核细胞制剂按照细胞数量1:1的比例混合制成。静脉注射液混合制剂中，脂肪间充质干细胞的浓度为(1～5)×105个/ml(总输注体积为100ml，浓度根据回输剂量具体确定)，外周血单个核细胞的浓度为(1～5)×105个/ml(总输注体积为100ml，浓度根据回输剂量具体确定)；人血白蛋白为5wt％。脂肪间充质干细胞与外周血单个核细胞比例为1:1。皮下注射液混合制剂中，脂肪间充质干细胞的浓度为2×106个/ml，外周血单个核细胞的浓度为2×106个/ml；人血白蛋白为5wt％。试验例1干细胞注射制剂静脉注射治疗缺血性糖尿病足的临床疗效纳入160例糖尿病足受试者，男女各半，糖尿病病程7～20年。将受试者随机分为8组，其中一组为对照组，其余7组为实验组。对照组局部溃疡创面应用含有庆大霉素8～16万u、普通胰岛素4～8u、山莨菪碱注射液10mg和生理盐水的混合液涡流式冲洗创面，之后用无菌棉球擦干，盖以无菌纱布，每日一次。其余7组在应用常规治疗方案的同时，分别接受脐带msc、骨髓msc、脂肪msc、pbmc及其实施例5-7的混合制剂细胞静脉注射治疗。静脉输注：按照体重均以5×105个/kg的标准将单一间充质干细胞细胞制剂及间充质干细胞与pbmc混合制剂沿静脉回输至患者体内。具体分组如下：表1分组情况及处理措施治疗后，4周后观察疗效，疗效评价标准为：痊愈：4周内新生肉芽组织全部长全，创面完全愈合；显效：4周内创面缩小范围于75％～100％之间，新生肉芽组织大部分长出，无炎性渗出液；好转：4周内创面缩小＜75％，新生肉芽组织部分长出，炎性渗出液较少；无效：4周内无创面缩小，无新生肉芽组织，炎性渗出液较多。结果如下表2所示：表2各组对缺血性糖尿病足的疗效统计结果显示：实验组的有效率和治愈率均显著高于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而实验组1、3、5、7间没有统计学差异(p＞0.05)，说明单独使用干细胞制剂或pbmc制剂静脉注射治疗缺血性糖尿病足均能改善患者的症状，部分可达到治愈的疗效；而实验组2、4、6的效果显著好于干细胞与pbmc单独治疗的效果，差异具有统计学意义(p<0.05)，因此结果显示干细胞与pbmc组合使用产生了协同增效作用。试验例2干细胞注射制剂局部注射治疗缺血性糖尿病足的临床疗效纳入160例糖尿病足受试者，男女各半，糖尿病病程7～20年。将受试者随机分为8组，其中一组为对照组，其余7组为实验组。对照组局部溃疡创面应用含有庆大霉素8～16万u、普通胰岛素4～8u、山莨菪碱注射液10mg和生理盐水的混合液涡流式冲洗创面，之后用无菌棉球擦干，盖以无菌纱布，每日一次。其余7组在应用常规治疗方案的同时，分别接受脐带msc、骨髓msc、脂肪msc、pbmc及其实施例5-7的混合制剂细胞局部注射治疗。局部注射：将含2×107个间充质干细胞的制剂(单一制剂、混合制剂)装入5ml注射器，缓慢注入患处，注射完毕后用无菌纱布按压针眼处3～5min，患者俯卧30min，期间每5min活动患处8～10次。具体分组如下：表3分组情况及处理措施治疗后，4周后观察疗效，疗效评价标准为：痊愈：4周内新生肉芽组织全部长全，创面完全愈合；显效：4周内创面缩小范围于75％～100％之间，新生肉芽组织大部分长出，无炎性渗出液；好转：4周内创面缩小＜75％，新生肉芽组织部分长出，炎性渗出液较少；无效：4周内无创面缩小，无新生肉芽组织，炎性渗出液较多。结果如下表4所示：表4各组对缺血性糖尿病足的疗效统计组别例数痊愈显效好转无效有效率治愈率对照组200371050％0％实验组1208840100％40％实验组22015230100％75％实验组3206770100％30％实验组42013340100％65％实验组5207850100％35％实验组62014420100％70％实验组7206950100％30％结果显示：实验组的有效率和治愈率均显著高于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.05)，而实验组1、3、5、7间没有统计学差异(p＞0.05)，说明单独使用干细胞制剂或pbmc制剂局部注射治疗缺血性糖尿病足均能改善患者的症状，部分可达到治愈的疗效；而实验组2、4、6的效果显著好于干细胞与pbmc单独治疗的效果，差异具有统计学意义(p<0.05)，因此结果显示干细胞与pbmc组合使用产生了协同增效作用。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12