皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂的制作方法

本发明涉及一种皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂，其所含的有效成分为阿胶。

背景技术：

皮肤是位于生物体最外侧的器官，承担生物体防御、感觉、体温调节和排泄作用等重要的生理功能。此外，不仅通过作为皮肤主要构成的表皮和成纤维细胞，还可通过脂腺(皮脂腺)等皮肤附属器调节上述功能。即，综合调节并维持表皮、真皮和脂腺等的功能对于构建皮肤的结构性和功能性屏障是必须的。

脂腺分泌的皮脂的主要成分为由脂腺细胞合成的甘油三酯，此外还包括蜡酯、角鲨烯等脂腺特有的脂质。从脂腺排出的皮脂会防止水分从皮肤蒸发，维持皮肤的动态平衡，此外，还会通过皮脂中的甘油三酯分解而产生的游离脂肪酸的存在，使表皮保持较低的ph值，弱酸性脂质膜也能起到对有害物质的缓冲作用和生物体防御功能。因此，如果皮脂的合成或产生不够，则生物体防御机构不能充分发挥功能，也容易诱发过敏症状恶化等。

作为皮脂产生促进成分，需要开发出一种安全性高并来源于天然产物的有效成分。专利文献1记载的发明涉及一种皮脂产生促进剂，其特征在于，其有效成分为来源于花椰菜芽菜的成分。

透明质酸(ha)是糖胺聚糖中的一种，与胶原蛋白、弹性蛋白等蛋白质一起构成细胞外基质。透明质酸的保水力优异，因此认为其有助于皮肤的保湿。

皮肤组织中产生透明质酸，被认为主要是由成纤维细胞负责的。透明质酸的组成单位是葡萄糖醛酸和n-乙酰葡糖胺，在生物体内由透明质酸合成酶(has)合成，并被透明质酸酶等分解酶分解。而如果随着年龄的增长成纤维细胞的增殖能力下降或透明质酸合成能力下降，则皮肤组织中的透明质酸量会降低。由此，认为皮肤的保湿性和弹性受到影响，导致随着年龄增长而出现皱纹和皮肤粗糙。

作为透明质酸产生促进成分，需要开发出一种安全性高且来源于天然产物的有效成分。专利文献2记载的发明涉及一种胶原蛋白肽的透明质酸产生促进剂。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-114152号公报

专利文献2：日本特开2014-210766号公报

技术实现要素：

鉴于上述情况，本发明的目的在于提供一种高活性的皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂，其所含的有效成分来源于天然产物。

本发明人为了解决上述问题而进行了潜心研究，结果发现利用所含有效成分为阿胶的制剂可以解决上述问题，从而完成了本发明。

附图说明

图1表示在含有阿胶(真空)、喷雾阿胶、来源于鱼的肽(肽fpc)、来源于猪的肽(pra-pc)或改性胶原蛋白(明胶)的培养基中，每3天进行处理并培养6天的仓鼠脂腺细胞中的细胞内甘油三酯(tg)量(图中，“**”(p<0.01)和“***”(p<0.001)表示相对于对照组(cont)有统计学意义)。

图2是在含有胰岛素(阳性对照)、阿胶(真空)或喷雾阿胶的培养基中，每3天进行处理并培养6天的仓鼠脂腺细胞的油红o染色图。

图3表示在含有阿胶(真空)或喷雾阿胶的培养基中，培养人表皮细胞24小时后的培养基中的透明质酸(ha)量(图中，“*”(p<0.05)和“***”(p<0.001)表示相对于对照组(cont)有统计学意义；“#”(p<0.05)、“##”(p<0.01)和“###”(p<0.001)表示相对于il-1α有统计学意义)。

图4表示在含有阿胶(真空)或喷雾阿胶的培养基中，培养24小时的人表皮细胞中的透明质酸合成酶-2(has-2)mrna的相对表达量(图中，“*”(p<0.05)表示相对于对照组(cont)有统计学意义；“##”(p<0.01)表示相对于il-1α有统计学意义)。

图5表示添加阿胶(真空)或喷雾阿胶的新鲜培养基中的透明质酸(ha)量(图5a)；以及在透明质酸酶存在下或非存在下添加经预处理的喷雾阿胶的培养基中的透明质酸(ha)量(图5b)。

图6表示在透明质酸酶存在下或非存在下含有经预处理的喷雾阿胶的培养基中，培养24小时的人表皮细胞中的has-2mrna的相对表达量(图中，“*”(p<0.05)和“**”(p<0.01)表示相对于对照组(cont)有统计学意义)。

图7表示在含有喷雾阿胶的培养基中培养24小时人表皮细胞后，照射紫外线(uvb、0.6kj/m²)，再培养24小时后的培养基中的透明质酸(ha)量(图中，“***”(p<0.001)表示相对于照射紫外线(none)有统计学意义；“###”(p<0.001)表示相对于对照组(cont)有统计学意义)。

具体实施方式

下面，对本发明的实施方式进行说明。予以说明，本发明不限于以下实施方式。

本说明书中，表示范围的“x～y”意为“x以上且y以下”。此外，只要没有特别说明，操作和物性等测定在室温(20℃～25℃)/相对湿度40％rh～50％rh的条件下进行。

本发明的一实施方式是一种皮脂量增加剂，其所含的有效成分为阿胶。该实施方式的另一方面涉及阿胶在制备皮脂量增加剂中的用途。该实施方式的又一方面涉及用于增加皮脂量的阿胶。

本发明的另一实施方式是一种透明质酸产生促进剂，其所含的有效成分为阿胶。该实施方式的另一方面涉及阿胶在制备透明质酸产生促进剂中的用途。该实施方式的又一方面涉及用于促进透明质酸产生的阿胶。

通过本发明，可以提供一种高活性的皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂，其所含的有效成分来源于天然产物。

阿胶是日本药局方外生药标准中记载的生药，为马科动物驴(equusasinusl.)皮提取物。阿胶具有补血、止血等作用，正在研究将其用作美白化妆品的有效成分。予以说明，只要能得到希望的效果，本说明书中使用的“阿胶”也可以包括将驴皮的热水提取物(煎煮物)进一步纯化而成的纯化物、用任意分解酶等进行处理的酶处理物等加工品。

本发明的一实施方式中，透明质酸产生促进剂所含的有效成分阿胶是透明质酸酶处理物。阿胶的透明质酸酶处理物可以通过以下方式得到：通过后述方法将从驴皮中得到的提取物根据需要溶解为任意浓度，例如0.01mg/ml～1000mg/ml，优选0.5mg/ml～50mg/ml，利用透明质酸酶将透明质酸酶解。作为这样的溶剂，可以使用水、ph值5～8左右的磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、hepes等的两性离子缓冲液等缓冲液、生理盐水等。透明质酸酶的添加量可以根据提取物的量任意调节，例如为10rtu/ml～1000rtu/ml的浓度。透明质酸酶处理的反应温度和时间也没有特别限制，例如为在30℃～45℃进行1～100小时左右，优选进行10～30小时。反应后优选通过加热等进行酶的失活处理。然后，根据需要通过后述方法进行粉碎、干燥，由此可以得到作为透明质酸酶处理物的阿胶。透明质酸酶处理物所含的透明质酸量，例如可以通过实施例记载的elisa法等目前公知的方法进行确认。

本说明书中，“所含的有效成分”意为含有有效程度的皮脂量增加剂或透明质酸产生促进剂，不影响包括药学上可接受的载体等其他成分。

本发明的皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂的制备方法只要能达到本发明所期望的效果，就没有特别限制。下面，对皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂的优选制备方法进行说明。

皮脂量增加剂优选通过以下制备方法进行制备，该制备方法包括：通过真空干燥，得到驴(equusasinusl.)皮的热水提取物的干燥物。即，本发明的一实施方式提供一种皮脂量增加剂的制备方法，其包括：得到驴(equusasinusl.)皮的热水提取物；以及通过真空干燥，得到所述热水提取物的干燥物。通过该制备方法制备的皮脂量增加剂，其皮脂量增加效果特别优异。

另外，透明质酸产生促进剂优选通过以下制备方法进行制备，该制备方法包括：通过喷雾干燥，得到驴(equusasinusl.)皮的热水提取物的干燥物。即，本发明的一实施方式提供一种透明质酸产生促进剂的制备方法，其包括：得到驴(equusasinusl.)皮的热水提取物；以及通过喷雾干燥，得到所述热水提取物的干燥物。通过该制备方法制备的透明质酸产生促进剂，其透明质酸产生促进效果特别优异。

制备上述皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂中的热水提取条件没有特别限制，例如对于1g驴皮，在3ml～10ml、优选3ml～5ml的量的热水中进行提取。提取温度(热水温度)例如为70℃～100℃，优选为90℃～100℃。提取时间也没有特别限制，例如为5～12小时，优选为6～12小时。提取可以进行多次。通过这种方法制备的提取液，可以根据需要通过离心浓缩机等进行浓缩。浓缩时，为了提高蒸气压以促进浓缩，可以向提取液中任意添加以下物质：甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、叔丁醇等低级醇等。

另外，也可以向热水提取物中任意加入目前公知的赋形剂等用于制剂化的添加剂。作为赋形剂，没有特别限制，例如可举出：乳糖、蔗糖、葡萄糖、纤维素、甘露醇等糖类和糖醇；小麦淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉等淀粉；环糊精等糊精；羧甲基纤维素(cmc)、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素等纤维素衍生物；聚乙烯吡咯烷酮等合成高分子化合物等。此外，还可以将以下物质作为用于制剂化的添加剂添加到提取液中：橄榄油、大豆油、棉籽油、可可脂、角鲨烷、虫胶、鲸蜡醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、卵磷脂等亲油性成分。上述添加剂的量相对于热水提取物，例如为0.1重量％～5重量％的量。

如上制备的热水提取物，优选使用以下方法进行干燥。

在一优选实施方式中，热水提取物通过真空干燥进行干燥。真空干燥的条件例如是在0.1kpa～1kpa、优选0.5kpa～0.8kpa进行干燥。干燥时的温度例如为80℃～100℃，优选为80℃～85℃。此外，干燥时间例如为水分含量变为4重量％～8重量％、优选4重量％～6重量％的时间。真空干燥特别优选在制备皮脂量增加剂时使用。

在另一优选实施方式中，热水提取物通过喷雾干燥进行干燥。当通过喷雾干燥进行干燥时，例如在干燥入口温度(进气温度)为120℃～190℃，优选在140℃～170℃进行干燥。此外，喷雾干燥时的干燥出口温度(排气温度)例如在70℃～100℃，优选在80℃～90℃进行干燥。喷雾干燥后的水分含量例如为4重量％～8重量％，优选4重量％～6重量％。喷雾干燥特别优选在制备透明质酸产生促进剂时使用。

干燥物可任意通过以下公知方法进行粉碎：锤磨机、喷射式磨机、针磨机、珠磨机、微粒磨碎机、混合器、均化器等。

干燥物的平均粒径(进行粉碎时，则指粉碎后的平均粒径)例如为120μm～2000μm，优选为180μm～1500μm。予以说明，该平均粒径是用粒度分析仪测定的值。可以利用筛网等回收所希望的粒径的组分。

本发明的皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂，可以将有效成分阿胶与药学上可接受的其他成分一起制剂化。作为药学上可接受的其他成分，除了上述赋形剂以外，例如可举出：载体、稀释剂、增量剂、乳化剂、增稠剂、崩解剂、助溶剂、稳定剂、保存剂、缓冲剂、润滑剂、粘合剂、ph调节剂、紫外线吸收剂、等渗剂、抗氧化剂、防腐剂、表面活性剂、着色剂、香料、甜味剂等。剂型也没有特别限制，可以制成口服或非口服的任意方式，例如可举出：片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、细粒剂、溶液剂、胶囊剂、酏剂、悬浮液剂、乳剂、糖浆剂、注射剂、外用剂(例如软膏、霜剂、凝胶、喷雾剂、膏药剂、洗剂等)、栓剂等。给药途径也没有特别限制，可以使用包括口服、经肠经鼻、经皮肤给药、注射给药(例如静脉内给药、皮下给药、肌肉给药、腹腔内给药等)等的所有给药途径。此外，也可以是面部清洁剂、洗发水、漂洗液、化妆品等方式。制剂中的有效成分的含量例如为0.01重量％～90重量％，优选1重量％～10重量％。

皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂的最佳给药量根据患者的年龄、体重、性别、症状、给药方法等而不同，例如，在一次给药中，可以按照每1kg体重0.1μg～1000mg的比例、优选每1kg体重10μg～50mg的比例每天给药1次～多次。可以在固体状、半固体状、液状、悬浮液状、凝胶状、糊状、粉末状、颗粒状等公知方式的食品中混合有效成分进行给药。

本发明的皮脂量增加剂和透明质酸产生促进剂的给药对象可以是人或非人动物中的任一种，例如为包括人、猴、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、豚鼠、牛、猪、狗、马、猫、山羊、绵羊的哺乳动物、鸟类，优选为人。

实施例

下面，使用以下实施例和比较例来对本发明的效果进行说明。但本发明的技术范围并不限于以下实施例。

<制备例1：阿胶(真空)>

用水清洗驴皮后剃毛，对于50g驴皮，在200ml的热水(95℃)中提取8小时。反复进行3次热水提取。用过滤器过滤提取液后合并，相对于100ml的提取液添加0.4重量％乙醇水溶液0.2ml、蔗糖0.2g和大豆油0.2g，用离心浓缩机浓缩2～3倍左右，得到驴皮的热水提取物。然后，用真空干燥机(机器型号bvd205，温州金榜公司生产，真空度0.6kpa，干燥温度85℃)将在95℃加热杀菌30分钟的热水提取物干燥至水分含量为5.5重量％。用粉碎机将干燥物粉碎至粒径1000μm以下，制成样品(阿胶(真空))。

<制备例2：喷雾阿胶>

用喷雾干燥装置(机器型号lpg-200，河南新乡公司生产，干燥入口温度(进气温度)150℃，干燥出口温度(排气温度)85℃)，对与上述同样经加热杀菌的热水提取物进行干燥，得到样品(喷雾阿胶)，其为平均粒径500μm、水分含量4.5重量％的干燥物。予以说明，平均粒径用粒度分析仪测定。

<实施例1：皮脂量增加剂>

使用在上述制备例1和2中制备的样品，验证皮脂量增加效果。

(实验方法)

在阿胶(真空)(0.5mg/ml～5mg/ml)、喷雾阿胶(0.5mg/ml～5mg/ml)、胰岛素(10nm，阳性对照)、来源于鱼的肽(肽fpc，购自株式会社nippi)(0.5mg/ml～5mg/ml)、来源于猪的肽(pra-pc，购自株式会社nippi)(0.5mg/ml～5mg/ml)或改性胶原蛋白(明胶，bdbiosciences公司)(0.5mg/ml～1mg/ml)存在下，每3天更换培养基，培养仓鼠脂腺细胞6天。予以说明，仓鼠脂腺细胞的培养是按照jinvestdermatol2001:117:965-970.中记载的方法，使用seb培养基(dmem培养基/hamf12(1:1(v/v))(invitrogen)、6％(v/v)热灭活胎牛血清(jrhbiosciences)、2％(v/v)人血清(icnbiochemicals)、0.68mml-谷氨酰胺(invitrogen)，使样品的终浓度变成上述浓度添加到培养基中，在37℃进行培养。予以说明，细胞培养是在co2培养箱(5％(v/v)co2)内进行。

培养后，用aqua-autokainostg-ii(株式会社kainos)测定细胞内聚集的甘油三酯(tg)。此外，tg聚集量的测定中使用的细胞裂解物中的dna量通过analbiochem1982:162:338-344.(johnson-wintb,holliss.arapidinsitudeoxyribonucleicacidassayfordeterminingcellnumberincultureandtissue.analbiochem.1982:122(2):338-344.)中记载的方法求出，计算单位dna量所对应的细胞内tg量。

(结果)

如图1所示，阿胶(真空)(0.5mg/ml～5mg/ml)和喷雾阿胶(0.5mg/ml～5mg/ml)浓度依赖性地促进了tg合成。此外，关于阿胶的tg合成促进作用，阿胶(真空)强于喷雾阿胶。

另一方面，关于鱼或来源于猪的肽，或者改性胶原蛋白(明胶)，则未确认到tg合成促进作用(图1)。因此可推测，阿胶的促进tg合成是由与胶原蛋白和改性胶原蛋白不同的成分所产生的作用。

利用油红o，将培养后在仓鼠脂腺细胞内聚集的中性脂肪染色。如图2所示，在经阿胶(真空)(0.5mg/ml～5mg/ml)和喷雾阿胶(0.5mg/ml～5mg/ml)处理的仓鼠脂腺细胞中，油红o染色阳性的细胞数呈阿胶浓度依赖性地增加。

<实施例2：透明质酸产生促进剂>

使用在上述制备例1和2中制备的样品，验证透明质酸产生促进效果。

(实验方法)

用24孔板将正常人表皮角化细胞(来源于新生儿，仓敷纺绩株式会社)培养至铺满后，在阿胶(真空)(0.1mg/ml～1mg/ml)或喷雾阿胶(0.5mg/ml～5mg/ml)存在下培养24小时。予以说明，人表皮细胞的培养使用humedia-kg2培养基(仓敷纺绩株式会社)，在co2培养箱(5％(v/v)co2)内37℃进行培养。此外，紫外线照射试验是用uvb(313nm，toshibafl20s荧光灯，0.6kj/m²)照射细胞后，在喷雾阿胶(5mg/ml)存在下培养24小时。

回收培养后的培养基，用透明质酸elisa测定试剂盒(biotechtradingpartners公司)测定培养基中所含的透明质酸(ha)含量。

在培养后，使用isogen(株式会社nippongene)，从回收的细胞中提取rna。将得到的rna作为样品，利用定量pcr法(测定仪器名：thermalcyclerdice^tmrealtimesystem，宝生物株式会社)测定透明质酸合成酶-2(has-2)mrna的表达量。予以说明，利用定量pcr法的mrna的测定使用primescriptrtreagentkit(宝生物株式会社)、2×quantitectsybergreenpcrmastermix(qiagen公司)作为测定试剂进行测定。has-2mrna的表达量是作为根据标准管家基因的甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达量进行修正的相对值而计算出的。

(结果)

如图3所示，阿胶(真空)(0.1mg/ml～1mg/ml)和喷雾阿胶(0.5mg/ml～5mg/ml)浓度依赖性地促进了ha产生。阿胶的ha产生促进效果在更接近生物体的il-1α(10ng/ml)存在下也得到确认，喷雾阿胶的透明质酸分泌量多于阿胶(真空)。此外，如图4所示，喷雾阿胶促进了人表皮细胞中的has-2mrna的表达。因此可推测，阿胶促进ha产生的原因之一是通过has-2mrna的表达增加来进行的。

阿胶是驴皮的热水提取物(煎煮物)，因此含有透明质酸。在溶解有阿胶(真空)或喷雾阿胶的新鲜培养基中也存在ha(图5a)。为了考察图3和4中的效果是否是阿胶内在的ha所致，在37℃将喷雾阿胶溶液(用5mg/ml、50mm乙酸/0.15mnacl(ph6)溶解)用透明质酸酶(100rtu/ml)进行过夜酶处理。酶处理后，在100℃的沸腾水浴中加热30分钟，使酶失活。在经透明质酸酶处理的喷雾阿胶溶液中，未检测到ha(图5b)。予以说明，作为对照组，添加相同容量的溶剂(dh2o)或缓冲液(50mm乙酸/0.15mnacl(ph6))来代替透明质酸酶溶液，进行同样处理，并测定ha(图5b)。

在含有如上制备的喷雾阿胶经透明质酸酶处理物的培养基中，培养人表皮细胞24小时。测定培养后在人表皮细胞中的has-2mrna的表达量。结果是透明质酸酶处理物也具有has-2mrna的表达促进作用(图6)。

确认了阿胶对因紫外线照射而受到损伤的人表皮细胞的效果(图7)。虽然uvb(0.6kj/m²)照射使ha产生量下降，但经喷雾阿胶处理促进了ha产生。

本申请基于2016年7月21日提出申请的日本国专利申请第2016-143382号，将其公开的内容作为参照而全部引入。