本发明属于免疫领域，涉及二萜类化合物及其衍生物在细胞免疫治疗方面的应用，具体涉及一种tlr7激动剂在增强cik细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。
背景技术：
近年来，应用细胞因子诱导的杀伤细胞(cik细胞)进行恶性肿瘤治疗的临床试验在国内外陆续开展，cik细胞免疫治疗在临床治疗中表现出明显优于其他过继性免疫治疗的强大优势，因而越来越广泛地被应用到临床肿瘤治疗中。cik细胞可作为单独的治疗方法，也可与外科手术、放疗、化疗结合进行综合治疗。
通过不同途径提高cik细胞功能增强其对肿瘤细胞杀伤力成为近年来研究的热点。研究表明，tlr7激动剂可以增强人cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力(参考文献：tlr7激动剂增强人cik细胞杀伤功能的研究，免疫学杂志2016年7月第32卷第7期)。
querciformolideb、querciformolidec、querciformolided为三种二萜类化合物，化学结构式如下(参考文献：anti-inflammatorycembranoidsfromthesoftcoralssinulariaquerciformisandsinulariagranosa.jnatprod,2008,71:1754-1759)。
现有技术没有报道过querciformolideb、querciformolidec、querciformolided用作tlr7激动剂的用途，也没有报道过其可以激活cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种tlr7激动剂在增强cik细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
querciformolideb、querciformolidec或querciformolided用作tlr7激动剂的用途。
querciformolideb、querciformolidec或querciformolided用于增强cik细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途。
进一步地，所述肿瘤为胃癌。
一种tlr7激动剂，含有querciformolideb、querciformolidec或querciformolided，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
一种用于增强cik细胞对肿瘤细胞杀伤力的药物制剂，含有querciformolideb、querciformolidec或querciformolided，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。
进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。
进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
进一步地，所述肿瘤为胃癌。
本发明的技术效果：
本发明发现，querciformolideb、querciformolidec、querciformolided为tlr7的有效激动剂，querciformolideb、querciformolidec、querciformolided通过提高tlr7的表达进而激活cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力。
附图说明
图1为各组cik细胞tlr7表达量及对胃癌细胞sgc-7901、bcg-823的杀伤力。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
一、实验材料
rpmi-1640、aim-v培养液、胎牛血清(fbs)购自gibco公司。
重组人白细胞介素2(rhil-2)、重组γ干扰素(ifn-γ)、抗cd3mcab、重组人白细胞介素1α(rhil-1α)购自双鹭药业；淋巴细胞分离液购自nycomedpharma公司。
人胃癌细胞sgc-7901、bcg-823购自中国科学院上海细胞库。
二、实验方法
1、单个核细胞分离、分组及cik细胞培养
采集健康志愿者外周血，ficoll密度梯度离心，分离获得外周血单个核细胞(pbmc)。day0，用含有5％自体血浆、80u/ml庆大霉素的aim-v培养液将pbmc调至起始细胞数为1.0×106/l，将细胞均分为对照组和给药组，对照组常规培养：day0加入1000u/ml的ifn-γ，置于37℃，5％co2培养箱培养24h，然后加入质量浓度为50ng/ml的抗cd3mcab，300u/ml的rhil-2和100u/ml的rhil-1α；以后每3天添加含有5％自体血浆、80u/ml庆大霉素、1000u/mlrhil-2的aim-v培养液，将细胞数控制为1.0×106/l。给药组(querciformolideb组、querciformolidec组、querciformolided组、decaryiolc组)与对照组培养方法基本一致，仅在day0额外添加10μmquerciformolideb、querciformolidec、querciformolided或decaryiolc。
2、westernblot测定各组cik细胞中tlr7的表达量
收集day15各组cik细胞，用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。配制12％sds-丙烯酰胺凝胶，将蛋白与5×loadingbuffer混合后上样，浓缩胶中恒压60v，分离胶加至120v，待电泳完成，将蛋白转至pvdf膜上(恒流150ma，3h)。用5％脱脂牛奶将膜封闭2h后用tbst洗膜3次，每次10min，一抗以工作浓度1:500，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗(tlr7为兔抗1:10000；β-actin为鼠抗1:12000)。孵育2h，用ecl发光剂压胶片发光、显影，以tlr7与内参β-actin的灰度比值作为tlr7表达量。将对照组tlr7表达量归一化，计算各给药组tlr7表达量的归一化值。
3、cik细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力测定
胃癌细胞sgc-7901的培养：从液氮中取出sgc-7901细胞株，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清rpmi-1640培养基的50ml培养瓶中，37℃，5％co2环境培养，每2d半量换液，观察细胞生长情况并及时换液和传代。
各组cik细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力测定：day15，以sgc-7901细胞为靶细胞(2×104/孔，100μl/孔)，10:1效靶比加入96孔板，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于co2培养箱。18h后，每孔加入20μlcck-8试剂，继续培养4h。酶标仪在450nm波长下检测吸光度，杀伤率用以下公式来计算：
杀伤率(％)＝(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值×100％。
4、cik细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力测定
胃癌细胞bcg-823的培养：从液氮中取出bcg-823细胞株，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清rpmi-1640培养基的50ml培养瓶中，37℃，5％co2环境培养，每2d半量换液，观察细胞生长情况并及时换液和传代。
各组cik细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力测定：day15，以对数生长期bcg-823细胞为靶细胞(2×104/孔，100μl/孔)，10:1效靶比加入96孔板，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于co2培养箱。18h后，每孔加入20μlcck-8试剂，继续培养4h。酶标仪在450nm波长下检测吸光度，杀伤率用以下公式来计算：杀伤率(％)＝(实验组od值-效应细胞组od值)/靶细胞组od值×100％。
5、统计学方法
采用spss19.0软件进行单因素方差分析，p＜0.05为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、各组cik细胞中tlr7的表达量比较
querciformolideb组、querciformolidec组和querciformolided组cik细胞中tlr7表达量显著高于对照组，作为对比二萜的decaryiolc组cik细胞中tlr7表达量与对照组无显著差异。结果如表1所示。
2、各组cik细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力测定结果
querciformolideb组、querciformolidec组和querciformolided组cik细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力显著高于对照组，作为对比二萜的decaryiolc组cik细胞对胃癌细胞sgc-7901的杀伤力与对照组无显著差异。结果如表1和图1所示。
3、各组cik细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力测定结果
querciformolideb组、querciformolidec组和querciformolided组cik细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力显著高于对照组，作为对比二萜的decaryiolc组cik细胞对胃癌细胞bcg-823的杀伤力与对照组无显著差异。
结果如表1和图1所示。
表1各组cik细胞tlr7表达量及对胃癌细胞sgc-7901、bcg-823的杀伤力
结果表明，querciformolideb、querciformolidec和querciformolided为tlr7的有效激动剂，querciformolideb、querciformolidec和querciformolided通过提高tlr7的表达进而激活cik细胞对肿瘤细胞的杀伤力；作为对比的二萜类化合物decaryiolc不具备这种作用。
实施例2：
一种tlr7激动剂，含有querciformolideb、querciformolidec或querciformolided，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。
实施例3：
一种用于增强cik细胞对肿瘤细胞杀伤力的药物制剂，含有querciformolideb、querciformolidec或querciformolided，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。肿瘤细胞优选胃癌。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。