增强药物功效的组合物和方法

专利名称：增强药物功效的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及药物功效的增强，特别是同时克服了细胞或生物体的耐药性。
背景技术：
细胞耐药性的出现可能严重影响化疗剂或药物的临床有效性。因此，人们进行了大量研究，试图阐释细胞耐药性的机理并寻找克服这种耐药性的方法，迄今已提出了许多推定的细胞耐药性机理，包括(i)药物的改变的代谢作用，其可能包括降低的激活作用和增加的灭活作用；(ii)靶细胞或生物体对活性化合物的不渗透性；(iii)受抑制的酶的改变的特异性；(iv)靶分子的增加的生成；(v)细胞毒性损伤的增强的修复；(vi)通过其它生化途径避开受抑制的反应。
细胞耐药性机理是复杂的，因此，在开发克服耐药性问题的普遍适用的方法方面，鲜有进展。另外一个复杂的因素是耐药性是一个几乎与所有的化疗使用都相关的问题，而对那些需要用大量共存的药物进行长期治疗的疾病来说，耐药性更经常与之相关。
例如，在癌症的治疗中，经常观察到癌细胞对活性化合物的不渗透性。此外，经常发现对一种药物的耐药性可以引发对其它生化上不同的药物的耐药性。这被称为多药耐药性。通常受多药耐药性问题影响的药物包括多柔比星、长春新碱、长春碱、秋水仙碱和放线菌素D。至少在一些情况下，多药耐药性是复杂表型，该表型已联系到被称为MdrI蛋白或P-糖蛋白的细胞膜药物溢出转运蛋白的高水平的表达。这种膜“泵”具有宽的特异性，其发挥作用而从细胞中除去多种在化学上不相关的毒素(参见Endicott等，1989)。
最近，报道了某些微生物的广谱耐药性的类似的机理。这些结果表明具有非常广泛的底物特异性的细菌溢出系统的存在，其与哺乳动物细胞的多药耐药性相似(参见Nikaido，1993)。
逆转多药耐药性的物质被称作耐药性修饰剂(RMA)，其在增强那些人的癌细胞已对之产生耐药性的化疗剂的细胞毒性方面具有重要性。尽管许多试剂在体外已被鉴定为RMA，但因为在逆转多药耐药性的剂量下，具有高的体内毒性，所以这些试剂大部分没有或仅有很小的治疗潜力。例如，代谢毒物如叠氮化物能在体外逆转多药耐药性，但在体内却毫无作用。大多数其它的高效RMA，如PSC833，看来是MdrI蛋白的药物结合位点的竞争性拮抗剂。这些试剂的许多具有毒性，这限制了它们在体内的有效性。因此，需要开发替代的逆转多药耐药性的药理学策略。
在克服肿瘤对抗肿瘤药物的不良吸收并降低全身毒性的试验中(Singh等，1991)，研究者试图将抗肿瘤药物如甲氨蝶呤(MTX)靶向于恶性组织的位置。几项研究已经试图通过将药物连接到因它们对肿瘤的亲和力而被选择的聚合物上，从而使化疗剂靶向于肿瘤(Hudecz等，1993；Klein等，1994；Akima等，1996)。然而，尽管这些聚合物可以帮助将活性试剂转运到靶组织上，它们却并不一定克服耐药性问题。
已提出作为肿瘤靶向试剂的一种聚合物是透明质酸(HA)。HA是自然界存在的包含直链聚合物的多糖，其在动物界无所不在。HA是高度水溶性的，使其成为生物系统的理想的药物转运载体。
本申请人惊奇地发现HA显示独特的结构和物理化学性质，这些性质不仅增强其作为药物载体的有效性，而且帮助克服耐药性。在约1克/升的高浓度时，HA采取刚性的随机卷曲构象，这种构象占据相对于分子量而言异常的体积(Laurent，1970)，而且在这样的浓度或低于其的浓度时，它形成松散的连接以形成大分子网络(

图1)。虽然我们不希望被任何特定的理论所束缚，根据HA的物理性质，我们认为多糖与药物如甲氨蝶呤相互作用的机理可能采取以下一种或两种形式(i)化学相互作用(图2)在MTX的氨基与HA的羧基间形成离子键，但这种相互作用可能导致沉淀。另一种可能的相互作用是通过药物上的氨基与HA上的羟基形成的氢键，但由于甲氨蝶呤在水中相对不溶，这种情况也不大可能；因此如果其存在它也将是非常弱的相互作用。MTX与HA间最可能的结合是通过MTX中大量的疏水基团与HA二级结构中的疏水片段之间的疏水相互作用(Scott等，1989)。
(ii)分子缔合当MTX只是“混合”在HA凝胶中(图2B)，而没有特定化学键的形成时，MTX能在高浓度HA形成的三维网络中被俘获(Mikelsaar和Scott，1994)，以便药物在给予后简单地从HA中扩散出来。如果HA被特定的细胞受体快速吸收并结合，药物将在这些位点，例如具有HA受体的淋巴结、肝脏、骨髓、肿瘤细胞以高浓度被释放。
同样虽然不希望被任何特定的理论所束缚，HA帮助靶向活性试剂的一种机理可能是通过HA受体在几种类型的肿瘤中特征性的过度表达(Stamenkovic等，1991；Wang等，1998)。HA受体CD44、透明质酸介导的细胞游动性的受体(RHAMM)和ICAM-1已被同肿瘤起源(Bartolazzi等，1994)和生长(Gunthert 1993；Arch等，1992)连系起来。RHAMM是介导肿瘤细胞游动性和入侵的主要因素(Hardwick等，1992)。已经证明RHAMM是成纤维细胞的H-ras转化所需要的(Hall等，1995)，其使得该受体成为肿瘤形成和生长潜在的参与者。ICAM-1是试验性地与HA代谢相关的受体(McCourt等，1994)，其在被转化的组织，如小鼠肥大细胞瘤(Gustafson等，1995a)和人乳腺癌肿瘤细胞簇和间质中被高度表达(Ogawa等，1998)。
HA受体在肿瘤细胞上的增加的表达为试图将HA引入化疗治疗方案中提供了理论基础。但是，迄今已获得的十分有限的数据实际上不是本申请要求保护的方法。例如，通过将HA化学络合到丝裂霉素C和表柔比星上而获得有限的成功；研究者能够抑制0.8-25％的结肠癌生长(Akimq等，1996)。Klein及其同事(1994)报道仅通过将HA与5-FU混合而实现植入的大鼠乳腺癌和Fischer膀胱癌对药物的增加的吸收。小鼠肥大细胞瘤也被证明与静脉注射的HA有亲和力(Gustafson等，1995b)。
但是，虽然一些对HA的研究已经表明HA能被用作药物载体，但是这些研究还没有显示HA能克服细胞耐药性。
发明概述本发明提供增强细胞毒性或抗肿瘤药的功效的方法，该方法包含将所述药物与透明质酸联合给予的步骤，其中同透明质酸联合给予增强了药物对癌细胞的杀伤力。
通常，细胞毒性或抗肿瘤药与透明质酸的联合给予增强其对癌细胞的杀伤力。也就是说通常耐药的癌细胞变得对药物敏感了。
优选的药物是甲氨蝶呤、紫杉醇或5-氟尿嘧啶(5-FU)。
根据本发明的第二个方面，提供细胞毒性或抗肿瘤药物组合物，该组合物包含透明质酸和细胞毒性或抗肿瘤药。任选地，该药物组合物中可以包含常规的药物添加剂。
通常所述药物在透明质酸中被携带或与透明质酸结合。
根据本发明的第三个方面，提供增强细胞毒性或抗肿瘤药的功效的方法，该方法包含给予含有透明质酸与所述药物的药物组合物的步骤。
虽然不希望被任何理论所束缚，据信克服耐药性的可能机理是1.透明质酸与耐药细胞上的受体结合或通过整体胞吞作用进入细胞，导致所携带或结合的药物被转运入细胞，使之成为治疗活性的。
2.透明质酸结合到耐药细胞的表面，在那里所携带或结合的药物从透明质酸网络中扩散入细胞，导致药物被转运入耐药细胞中。
3.透明质酸和其它粘多糖采取卷曲构象携带药物，并且也可以结合多种药物。
根据第四个方面，本发明提供降低或克服耐药性的方法。该方法包含将细胞毒性或抗肿瘤药和粘多糖联合给予的步骤，该粘多糖能够携带和/或结合所述药物，而且能与耐药细胞上的受体结合或通过整体胞吞作用进入细胞内，其中所述药物被转运入细胞中，从而使之成为治疗活性的。
虽然不希望被理论所束缚，可能是透明质酸与药物的组合导致药物在细胞存留更长的时间，从而允许延长的释放并使药物更长时间地发挥其药理作用。
根据本发明的第五个方面，提供增强药物功效的方法，该方法包含将所述药物和粘多糖联合给予的步骤，该粘多糖与所述药物缔合，缔合方式使所述药物在细胞内存留的时间长于如果所述药物被单独给予时其在细胞内的存留时间。例如，当药物是细胞毒性药物时，那么药物将在细胞内存留更长的时间，使得药物有延长的释放并更长时间地发挥其毒性作用。
根据本发明的第六个方面，提供治疗耐药性疾病的方法，该方法包含给需要这种治疗的患者联合给予透明质酸和药物的步骤。
在一个实施方案中，本发明的这个方面提供了治疗耐药性疾病的方法，该方法包含给予需要这种治疗的患者包含透明质酸和药物的组合物的步骤。
特别地，治疗耐药性疾病的方法适用于患有耐药性癌症的患者。优选地，癌症是耐甲氨蝶呤或5-FU的。
更优选地，所述耐药性是多药耐药性。
根据本发明的第七个方面，提供治疗癌症的方法，该方法包含将药物和粘多糖联合给予的步骤，该粘多糖能够携带或结合所述药物和/或与所述药物缔合，缔合方式使所述药物在癌细胞内存留时间长于如果单独给予所述药物时其在细胞内存留时间。
根据本发明的第八个方面，提供降低药物胃肠毒性的方法，该方法包含将所述药物与粘多糖联合给予的步骤，该粘多糖能够携带或结合所述药物和/或与所述药物缔合，缔合方式使所述药物具有降低的胃肠毒性。
纵观本发明的说明书与权利要求书，单词“包含”意指“包含但不局限于”，其不试图排除其它添加剂、组份、整数或步骤。
附图的简要说明图1显示高浓度HA形成三维网络，其能携带小分子如甲氨蝶呤。通过HA快速结合到特定细胞受体上，随后药物从HA扩散出，和/或通过HA和/或药物受体细胞将HA和药物共同内在化而实现HA/药物对病理位点的靶向。
图2A显示甲氨蝶呤和HA之间的可能相互作用。其包括(i)离子键、(ii)氢键或(iii)疏水键。
图2B是甲氨蝶呤在HA中缠结的示意图。在高浓度下，HA形成三维网络，其由大的卷曲分子表示。(*)代表分子量仅为454D的甲氨蝶呤，其易于在400-900KD的HA分子中被携带。
图3显示人乳腺癌肿瘤在裸鼠内生长的一般病理学。画面A表示II-III级人类肿瘤的一般形态学；画面B表示在图3A中所示肿瘤的另一切片的显微图。该切片显示了周围小鼠肌肉(M)、肿瘤被膜(C)、肿瘤的坏死区(N)和浸润性肿瘤(T)。(→)表示被称为“一路纵队”的常见现象，其中肿瘤细胞依次排列，其通常与浸润性癌症相关(Carter，1990)。
图4显示恶性乳腺肿瘤的典型的病理特征。画面A所示为带有大面积坏死区(N)的特征性的浸润性管癌的切片，显示了肿瘤更强的侵入性的病程；画面B显示了血细胞的存在(→)，证明肿瘤血管形成因而是能生存的。在很接近血管的地方可以观察到少量导管(D)；画面C表示被标记为A的细胞，其正经历被核碎裂表明的编程性细胞死亡。
图5显示生长在裸鼠中的人乳腺癌肿瘤上的HA受体的免疫组织化学识别。画面A显示肿瘤中癌胚抗原(CEA)的位置；画面B显示RHAMM在人乳腺癌上的表达；画面C显示ICAM-1在人乳腺癌上的表达。HA受体，ICAM-1的位置主要在内皮组织周围(→)；画面D显示CD44在人乳腺癌上的表达。CD44在大约95％的肿瘤细胞被检测到。H人源细胞，M鼠源细胞。
图6显示用作靶向于肿瘤的甲氨蝶呤的载体的透明质酸的分子量分析结果。
图7显示用HA作载体，甲氨蝶呤对人乳腺癌肿瘤的靶向。
图8显示在HA存在下，肝脏中甲氨蝶呤的增强的吸收。
图9显示当药物与HA联合给予时，胃肠道中甲氨蝶呤的降低的吸收。
图10为MTX/HA之间可能的物理相互作用，以及作为结果的药物/HA组合治疗的肿瘤靶向能力的示意图。
图11显示将HA与5-FU组合的体外细胞毒性协同作用。
图12显示用HA作载体，5-FU对人乳腺癌的靶向。
图13显示HA在人体中的消除途径。
图14显示5-FU在胃、脑及肺中的增加的吸收。
图15显示HA对血浆5-FU的药代动力学消除的影响。
图16显示定义试验终点的标准。显示了标准2(画面A)和标准3(画面B)。
图17显示5-FU/HA辅助治疗的功效(6周治疗方案)对原发肿瘤体积的影响。
图18显示5-FU/HA辅助治疗的功效(6周治疗方案)对体重的影响。
图19显示5-FU/HA辅助治疗的功效(6周治疗方案)对淋巴结癌的扩散和新肿瘤形成的影响。
图20显示6月功效研究的肿瘤的一般外观。
图21显示HA/5-FU辅助治疗对患者存活的影响。
图22显示CMF/HA治疗6周后的小鼠体重变化百分数。
图23显示CMF/HA治疗6周后的小鼠肿瘤体积变化百分数。
图24显示溶于水中的MTX的1HNMR谱图。该谱图中很容易识别MTX的每组氢。
图25显示MTX与HA的可能相互作用。
图26显示透明质酸在298K和600MHz时的600MHz谱图。
图27显示在298K时，MTX独自的600MHz1H NMR谱图以及逐渐添加2纳摩尔、10纳摩尔、20纳摩尔和80纳摩尔HA(50KDa)的MTX的600MHz1H NMR谱图。
图28显示在298K时，在70.0到8.5ppm之间的5-FU的600MHz1H NMR谱图以及5-FU(1.25毫克/毫升、1.6毫克/毫升和6.4毫克/毫升)HA(750KDa，3毫克/毫升)的600MHz1HNMR谱图。缩写BSA牛血清白蛋白Ci 居里CMF环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶Cyc环磷酰胺DNA脱氧核糖核酸Dpm每分钟衰变DTTP 脱氧胸苷三磷酸ECM细胞外基质EDTA 乙二胺四乙酸ELISA 酶联免疫吸附测定FCS胎牛血清5-FU 5-氟尿嘧啶GAG葡糖胺聚糖GlcNAc N-乙酰葡糖胺GlcUA 葡糖醛酸HA 透明质酸HABP 透明质酸结合蛋白HAase 透明质酸酶HBSS 汉克氏平衡盐溶液HRP辣根过氧化物酶h 小时Kav凝胶内可利用的分配体积l 升min分钟PBS 磷酸盐缓冲盐水PM 质膜RHAMMHA介导的细胞游动性的受体RMCa 大鼠乳腺癌RNA 核糖核酸RT 室温S-期 合成期S.D. 标准偏差SEM 平均标准误差Ve洗脱体积Vo空隙体积Vt总体积TGD 肿瘤生长延迟TDT 肿瘤加倍时间发明的详细描述本发明现在将仅通过参考以下非限制性实施例而被进一步描述。然而，应该理解以下实施例仅是说明性的，而不应在任何方面被认为是对上述本发明的的概述的限制。尤其是，当本发明涉及到癌症而被详细描述时，应清楚地理解本文的发现不局限于癌症的治疗。例如，细胞毒性药可以被用于其它症状的治疗；甲氨蝶呤广泛用于治疗严重的类风湿性关节炎。实施例1裸鼠中人类乳腺肿瘤的确认与乳腺肿瘤上透明质酸受体的原位鉴定要建立人乳腺癌的合适的动物模型，需要进行病理学试验。肿瘤要是生理上能生存的，新血管形成是必需的，因为毛细血管网络给肿瘤提供营养物质。血管形成、导管入侵、坏死、编程性细胞死亡的存在，高有丝分裂指数和核异常都是乳腺癌的特征。
人乳腺癌细胞系MDA-MB-468(美国组织培养物保藏中心，罗克维尔，美国)基于其HA受体，CD44、RHAMM和ICAM-1的表达而被选择。细胞常规生长并在175厘米2培养瓶中在补充了10％胎牛血清(FCS)和10微克/毫升庆大霉素的Leibovitz L-15培养基中传代培养成单细胞层。为了注射入小鼠体内，细胞生长到100％铺满，在0.05％胰蛋白酶/0.01％EDTA溶液中受胰蛋白酶作用，通过在Beckman TJ-6台式离心机(Beckman，澳大利亚)中，在400gav下离心10min而洗涤2次，用ZM Coulter型计数器(CoulterElectronics，英国)计数，并在无血清的Leibovitz L-15培养基中以1×108细胞/毫升重悬浮。
85只无胸腺6到8周大的Balb/c/WEHI雌性裸鼠(Walter andEliza Hall Institute of Medical Research，墨尔本，澳大利亚)养在无特定病原的条件下，提供无限制的无菌食物与水。如上述方法准备一千万个MDA-MB 468细胞，并直接注射入小鼠乳头下的脂垫。在96％的小鼠中观察到肿瘤生长。当肿瘤生长到肉眼可测时，通过每周测定肿瘤的体积监测肿瘤的进展。肿瘤体积使用以下公式由3个垂直的直径计算V＝(1/6)p(d1d2d3)其中V是肿瘤体积(单位毫米3)，d1是肿瘤的第一直径(单位毫米)，d2是肿瘤的第二直径(单位毫米)，以及d3是肿瘤的第三直径(单位毫米)(Lamszus等，1997)。肿瘤接种8周后，平均肿瘤大小为482.2毫米3(SEM，39.8毫米3)。
肿瘤诱导大约8周后，两只带有肿瘤的小鼠被给予致死剂量的戊巴比妥。在3min内处死小鼠，肿瘤经外科手术转移并立即在10％缓冲的福尔马林中固定12小时。固定的肿瘤在一系列70-100％乙醇中洗涤液中过夜脱水，接着用石蜡包埋，并由其切下2-4微米的切片。将切片置于载玻片上，脱蜡，并放到水中。载玻片在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤3×5min。嗜异性蛋白通过和10％胎牛血清保温10min，接着用PBS冲洗而被封闭。在室温(RT)下应用检测抗体60min。控制抗血清或抗体对抗RHAMM(Applied BioligandsCorporation(马尼托巴，加拿大)、ICAM-1、CD44v6、CD44v10、总CD44H和CAE。所有其它检测抗体均购自Zymed(加利福尼亚，美国)。载玻片在PBS中洗涤3×5min，内源过氧化物酶活性通过浸入0.3％H2O2/甲醇20min而被阻断。在进一步用PBS洗涤之后，过氧化物酶接合的猪抗兔二级抗血清(达科，丹麦)在室温下应用60min，接着在PBS中洗涤3×5min。Sigma快DAB(3，3′-二氨基联苯胺，Sigma，圣路易斯，美国)片剂根据生产商的说明书被制备，并且DAB溶液在RT下应用5-10min。载玻片在自来水中洗涤10min，用苏木精复染色，脱水并制成标本。
苏木精和曙红染色的乳腺癌切片的检查显示所有与能生存的肿瘤相关的一般特征，如图3和图4所示，这确证了动物主体成功地保留了II级人乳腺癌。有几个特征是恶性肿瘤特征性性的。标记为(B)的载玻片的切片显示了这些特征。在切片(B)中观察到恶性肿瘤的所有病理特征，即i)高的细胞核/细胞质比率ii)角形的染色质和核仁iii)不规则的核膜推定II-III级肿瘤能被裸鼠模型支持。II-III级肿瘤一般给出约47％的预后生存率(Bloom和Richardson，1957)。II-III级肿瘤的特征在于
i)中等的细胞核复型现象、深色染色质，与有丝分裂活性，在所有显示的肿瘤切片中观察到的特征；以及ii)很少或没有导管形成。
大面积坏死(N)可能与肿瘤扩散有关，这意味着更有侵入性的入侵病程(Carter，1990)。肿瘤的浸润性边缘用()表示。
本试验的主要目的是确认在这些小鼠中建立的肿瘤的组织学和细胞学行为与这种肿瘤在它们的自然人主体中的行为类似。在实现这一目的的同时，我们还显示了小鼠中的肿瘤细胞是人源的，并且它们高度表达相关的HA受体如RHAMM、CD44和推定的ICAM-1。由于假定肿瘤靶向可以通过受体介导的内在化或结合而发生，因此有必要确证HA受体，ICAM-1、CD44和RHAMM的表达。图5B-D证明了所有这些受体都存在。表1列出了在两种所测试的肿瘤上受体的表达程度。
表1在人类乳腺肿瘤异种移植物上透明质酸受体的表达在肿瘤上表位表达百分率的等级指数定量如下0％-1-25％ +26-50％++51-75％+++76-100％ ++++
肿瘤细胞的人源通过用人类特定的癌标记物将肿瘤和周围组织染色而得到确证。CEA的存在清楚地证明了肿瘤是人类的，而由鼠主体的心血管系统供养(图5A)。选择多克隆CEA抗血清，因为它排他性地与人类CEA反应。这一显微图证明了肿瘤完全是人源的(H)，如棕色染色所显示。周围肿瘤被膜和脂肪组织一定是鼠源的，这通过没有抗血清(M)染色而表明。棕色染色证明了RHAMM在肿瘤细胞上的高度表达。在组织坏死和肿瘤浸润的周围区域可以观察到最强的染色强度。实施例2甲氨蝶呤/透明质酸药物组合物的制备和注射建立了裸鼠模型的有效性后，它现在能被用来试验HA/MTX制剂的有效性。
MTX储备溶液通过将MTX粉末溶解在0.5％w/v的碳酸钠(pH9)中而制备，并用0.9％w/v氯化钠将其浓度调到24.5毫克/毫升。储备溶液在加入[3H]甲氨蝶呤并用注射级氯化钠稀释到注射浓度前通过0.22微米滤器过滤以确保其无菌。关于裸鼠和人类的MTX药代动力学的比较数据已经出版(Inaba等，1988)，并且被应用在本研究设计中，从而尽可能接近地模拟人的治疗剂量。根据各小鼠的体重制备各注射液，以实现在50微升中注射药量为15毫克/千克MTX(相当于人治疗剂量对平均体重60千克的人来说是0.42毫克/千克；Inaba等，1988)的目的。
干燥的HA(Mr8.9×105kDa型)加到一份24.5毫克/毫升的MTX储备溶液中并涡旋过夜而溶解，得到浓度为21毫克/毫升。为了确保无菌，加入庆大霉素至浓度达50微克/毫升并在4℃保温过夜。在[3H]甲氨蝶呤加入后，HA/MTX储备混合液用注射级氯化钠稀释到注射浓度。根据各小鼠的体重单独制备注射液，使在50微升中注射15毫克/千克MTX和12.5毫克/千克HA。当这一数量的HA注射到体内后，在试验期间观察饱和动力学(Fraser等，1983)。
为确保HA在甲氨蝶呤/HA注射混合液制备过程中保持其分子量，注射溶液用Sephacryl S-1000大小排阻凝胶(Pharmacia，乌普萨拉，瑞典)分析，柱规格为1.6厘米×70厘米，样品体积为2毫升，流速为18毫升/h，流份为2毫升。图6显示了在混合期间HA保持它的分子量不变。
小鼠被随机分成2组，每组40只。组1只接受MTX治疗，组2接受MTX/HA组合治疗。动物被单独放在注射箱中，通过尾静脉给予注射液。包含在15毫克/千克MTX±12.5毫克/千克HA内的氚代甲氨蝶呤(平均注射的每分钟衰变(dpm)±平均标准误差(SEM)19159146±1336819)在各注射液中转运。小鼠被单独放在柔软、不可湿润的塑料围栏中以收集尿样。在注射30min、1h、2h、4h或8h后，腹膜内注射0.1毫升戊巴比妥(Glaxo，Australia Pty.Ltd.，墨尔本，澳大利亚)将小鼠麻醉，并从心脏或大血管用针和注射器采集血样。采集血样后的动物通过颈部扭断处死。
血样转移到涂有EDTA的玻璃试管中，血浆通过在14000gav下离心10min制备。在用100微升30％v/v过氧化氢脱色并加入3毫升HiSafeII闪烁体后计算50微升等分试样的放射性。为了克服化学发光和光致发光，根据样品来源在3、7或20天的时间内，在Wallac1410β计数器中将样品计数2min。在计数之间的时间中，样品储存在室温黑暗中。所有计算都在除去化学发光和光致发光的稳定的样品上进行。
为了测定注射的MTX在血浆中的百分比，需要使用以下标准公式计算各小鼠的总血浆体积(毫升)小鼠质量(g)×小鼠血液体积(0.07)×血液的血浆比例(0.59)然后计算血浆中注射的MTX的百分比 ＝％血浆中注射的MTX。
为确保转运入血流中的MTX量的精确定量，切开尾静脉上的注射位点，定量MTX。残留在注射位点的MTX注射液的平均百分比为3.78％(SEM0.57％)。转运入血流中的MTX量(用于分布到组织和肿瘤中去的MTX)计算如下 转运入血流中的MTX量此后将被称为“注射剂量”。
为了进行样品群间的精确比较并归一化器官及肿瘤质量的轻微偏差，在身体器官和肿瘤以及体液中MTX的浓度表示为注射剂量/克组织的％。
残留在注射位点的MTX注射液的平均百分比为3.78％(SEM0.57％)。为了归一化该偏差，在肿瘤和组织中发现的dpm百分比被计算为注射的dpm百分比减去残留在注射位点的dpm百分比。该量此后被称为可利用的dpm或可利用的甲氨蝶呤。结果列于表2中。表2小鼠肿瘤、器官和体液中的甲氨蝶呤吸收数值是中值+sEM，其中n＝8*和 代表当使用Mann-Whitney佚和检验时统计意义上显著的数字#代表MTX在小鼠血浆总体积中的Dmp。数值代表用％表示的注射MTX剂量的Dmp@代表MTX在小鼠尿总体积中的Dmp。数值代表用％表示的注射剂量。N＝3-8ID代表数据不足以分析
当药物与HA联合注射时，没有发现MTX的血浆浓度有统计意义上的显著性差异。MTX的总药代动力学保持不变，在静脉给予后0.5至2h内血浆的MTX水平达到最高(MIMS，1997)。
当可能时，用注射器和针从不可湿润的塑料围栏中采集尿样。通过在14000gav下离心10min使尿样澄清。在向8-30微升样品中加入3毫升HiSafeII闪烁体后测定其放射性含量。尽管精确定量每只小鼠产生的尿的体积有技术困难，我们通过以下公式计算尿中注射的MTX剂量的百分比 ＝尿中注射的MTX的％。
因为排尿速率的变化，不可能从每只小鼠收集尿样。当在每个治疗的每个时间点有3个或3个以上的尿样时，则在那些时间点进行数据的非参数统计分析。在给药后一小时，在接受MTX/HA的小鼠的尿中有50％(p＝0.043)以上的MTX(见表2)。
在处死小鼠后，立即将肿瘤、肝脏、心脏、脾脏、膀胱、左肾和右肾、子宫、肺、胃、肠、脑和淋巴结切除并分析其总放射性。各组织的总放射性通过将100-400毫克组织在22℃下溶解在3-6毫升OptiSolv(ACC，墨尔本，澳大利亚)36h而被测定。溶解完成后，组织中的放射性在加入10毫升的HiSafeIII闪烁体后被计数。同样为了克服化学发光和光致发光，根据样品来源在3、7或20天的时间内在Wallac1410β-计数器中将样品计数2min。在计数之间的时间中，样品储存在室温黑暗中。所有计算都在除去所有化学发光和光致发光的稳定的样品上进行。数字表示中值±SEM(n＝8)。
确定代谢活性器官如肝脏、脾脏和肾脏不经历高水平的药物靶向很重要，这些器官的高水平的药物靶向能抵销增加的肿瘤靶向的任何积极方面。表2列出了在各测试时间点上各组织的甲氨蝶呤的吸收。
利用Mann-Whitney佚和检验和斯氏t-检验，当MTX和HA联合注射时，MTX浓度/克组织没有统计意义上的显著性差异。由于每个时间点动物数目少，所以如果有一个数据点重叠，Mann-Whitney检验就在统计意义上变得无效，但在肝脏、子宫和肠中可以观察到明确的趋势。
在肝脏中，当MTX与HA组合时，MTX的吸收看来有短期增加，如图7所示。
在30min和1h，肝脏分别含有MTX浓度中值的65％和26％的增加。在2h时，与治疗无关，没有观察到肝脏中的MTX的量的差别。在4h后，令人感兴趣的趋势变得明显，当MTX与HA联合注射时，在肝脏中发现更少的MTX(4h68％以下的MTX以及8h75％以下的MTX)，如图8所示。
在肠中具有明确的趋势，HA和MTX的组合导致每个时间点上降低的药物吸收，如图9所示。
将肠充分匀浆，接着将约400毫克组织在22℃下在3-6毫升OptiSolv中溶解24h，接着加入10毫升Hisafe-3闪烁体。为了克服化学发光和光致发光，根据样品来源在3、7或20天的时间内在Wallac 1410β-计数器中将样品计数2min。在计数之间的时间中，样品储存在室温黑暗中。所有计算都在除去所有化学发光和光致发光的稳定的样品上进行。
数字表示中值±SEM(n＝8)。匹配对用非参数随机化检验分析数据证明HA的联合给予显著降低药物排泄到胃肠道中(p＝0.031，一尾检验)。
MTX浓度的下降在43-67％的范围内。匹配对非参数随机化检验显示HA的联合给予显著降低药物排泄到胃肠道中(p＝0.031，一尾检验)。
在肺中，当与HA联合给予时，在4h MTX显著地较少存在，其中值下降52％(p＝0.014)。然而，在其它时间点上没有显示差别，因此这一观察的意义仍不确定。
在脾脏、子宫、脑、心脏、淋巴结、胃和肾没有测到可观察的变化趋势。
甲氨蝶呤的HA靶向于肿瘤细胞的可能机理有2个(图10)。
当HA和MTX组合时有显著的靶向作用(图7)。肿瘤中药物的存留的最大相对增加在0.5h(平均增加24％)、1h(平均增加30％)、2h(平均增加119％)时观察到，而在4h和8h增加可忽略不计。由于样品数量小以及数据的非参数分布，使用Mann-Whitney佚和检验，显示当HA被联合注射时肿瘤中药物吸收的显著增加。在1h统计意义上的显著性是p＝0.021，在2h时，p＝0.050。其它时间点上不显示统计意义上的显著性差异，但是当与HA联合给予时，MTX浓度/克肿瘤的趋势一致地更大。
图7所示的数据明确表明与HA联合给予在注射后30min内显著增加肿瘤对MTX的吸收。而且，在随后的肿瘤中药物浓度的下降期间，联合给予也使得肿瘤中药物浓度维持在显著较高的水平。通过非参数检验，在1h，差异在p＝0.021(n1＝8，n2＝8)显著，在2h，p＝0.05(n1＝8，n2＝8)差异显著。
含有俘获的MTX的HA与受体结合(CD44和/或I-CAM-1)并通过受体介导的胞吞作用而被内在化，从而将药物释放到肿瘤细胞中。
HA分子网络将作为向外扩散的障碍物，这样在HA结合到受体(CD44、RHAMM和/或ICAM-1)上后，所携带的MTX能够扩散到肿瘤细胞中。因为被HA基质保留在分子表面上，MTX具有比通常用于将MTX转运到在下面的细胞中增加的有效性。
副作用和药物分布在所期望的活性位点之外也可被其与HA缔合影响。例如，HA一般通过受体介导的细胞吸收和肝脏(80-90％)、肾(10％)、脾脏和骨髓中的分解代谢而从血流中清除，其中在后两个位置具有一些小的变异。正如所预期的，HA至少在很短的时间内似乎增加药物的肝脏转运。在30min和1h，肝脏的MTX浓度分别表现出中值增加65％和26％。在2h，不管治疗与否，在肝脏中没有观察到MTX的量的差别。在4h后，令人感兴趣的趋势变得明显，即当MTX与HA联合注射时在肝脏中发现较少的MTX(4h68％以下的MTX，8h75％以下的MTX)。静脉注射给后，MTX广泛分布在体液中，并能在肝脏中存留数月(McEvoy，1988)；因此当与HA联合注射时在4和8h肝脏中下降的MTX浓度中值表明在药代动力学清除途径中改变的平衡。考虑到HA在肝脏内皮细胞(LEC)中快速代谢，必然的结果是与HA共同内在化的MTX将在肝脏窦状腺衬细胞内释放，在那里它或者扩散入肝细胞以被分泌入胆汁中并接着进入胃肠道，或者返回到循环体系进一步分布到体液中并泌尿排泄，或者两者均采用。
短期肝脏靶向可能具有治疗优势。在肝转移的情况中快速高度暴露于MTX可能是有益的，并且由于观察到靶向仅有1h，这将抵销任何长期毒性问题。肝脏靶向可以和需要生物活化的药物一起使用，例如丝裂霉素C、多柔比星，其中药物/HA混合物将靶向于LEC。当无活性的药物浓缩在LEC中，它将能够扩散到肝细胞中而被活化，这样为活化靶向机理。
MTX毒性的主要位点之一是胃肠道。MTX和HA联合给予显著减少了转运到胃肠道中的药物。可能有几种机理与肠中MTX浓度的下降有关。
甲氨蝶呤是非常小的分子，预期它将正常地穿过多数毛细血管壁，而与HA缔合将大大地降低它这一途径的通过。
HA在肝脏内皮细胞中的快速降解导致MTX快速释放到肝脏并回到血流中，这样它将经历增加的肾脏清除，如在1h所示，50％以上的MTX在MTX/HA制剂的小鼠泌尿排泄。
从身体中最终清除MTX的主要途径是泌尿排泄。带有HA的药物在肾中的含量似乎很少增加，但我们根据其它证据相信HA被肾脏很快吸收并分解代谢，这样它的存留时间将很短，并且所缔合的药物将很快释放到尿中。结论这里报告的结果代表临床前研究的第一个阶段，检验以下论题与透明质酸联合给予治疗药物将能够实现它们的选择性地转运到所期望的病理组织靶上；这样在那个位点上获得更高更有效的浓度。在这一情况中，甲氨蝶呤，一种广泛用于目前人乳腺癌和其它人恶性肿瘤以及类风湿性关节炎的治疗方案中的细胞毒性药，已经通过和透明质酸一起或不和透明质酸一起静脉注射的途径被研究。
我们已发现裸鼠模型是研究在活的主体中人乳腺癌的特别合适的模型，并解决了在使用HA来引导治疗药物到疾病组织的位置的一些基本问题，这样加强了它们的有益作用。我们已获得了用小分子量药物的结果，该药物没有与HA缔合的特定形式，表明当HA注射到血流中时，它仍能转运更多量的这样的药物到病理组织去。该研究表明在体内条件下，MTX被HA充分保留以实现转运到人乳腺癌的显著增强，同时也可能地降低了不期望的胃肠道毒性的副作用。实施例3紫杉醇/透明质酸药物组合物的制备和注射已经建立了用于HA/紫杉醇的裸鼠模型的有效性后，现在它可被用来测试其它化疗的有效性。由于紫杉醇(也称他克唑)的治疗意义，决定使用紫杉醇。
紫杉醇从短叶紫杉Taxus brevifolia中分离而得(Wani等，1971)，它对于晚期卵巢癌和乳腺癌有临床活性(Rownisky等，1990；McGuire等，1989)，现在它正进行治疗多种其它癌症的临床试验。然而与紫杉醇相关的主要问题是它的特别高的亲脂性和作为结果的差的水溶性。解决该问题的尝试是紫杉醇类似物和前药的合成以及设计安全和生物相容的配方的广泛的尝试。至今没有任何前药表现出能进行临床开发的充分的稳定性、溶解性或活性(Mathew等，1992；Vyas等，1993)。然而，半合成紫杉烷比紫杉醇表现出更大的溶解性和效力(Bissery等，1991)，并且一种形式泰索帝已进入人体试验(Bisset等，1993)。
用于静脉注射的紫杉醇的目前的临床配方使用1∶1(v/v)比例的乙醇和聚乙二醇类化合物EL，其药量为6毫克/毫升。聚乙二醇类化合物EL实际上是聚乙氧基化蓖麻油，一种澄清、油状粘性的黄色表面活性剂。稳定性研究表明原始配方在4℃时保存期为5年。制剂在使用前用0.9％盐水或5％葡萄糖稀释至浓度为0.3-1.2毫克/毫升，在这些条件下该物质的物理和化学稳定性约为27h。然而，载体稀释到这些水平可能产生过饱和溶液(Adams等，1993)，如果不按照所给的指导使用，其可能倾向于产生沉淀。因此在给予时需要内嵌的滤器作为阻止颗粒物进入的安全措施。还推荐稀释的紫杉醇溶液在制备24h内使用。基于上述因素影响，也观察到溶液轻微浑浊，并被归因于聚乙二醇类化合物从输注袋和管中萃取增塑剂(Waugh等，1991)。
除了前面提到的物理不稳定性问题，聚乙二醇类化合物的最显著的问题是它被报道具有药理活性。多种药物使用聚乙二醇类化合物EL给予，包括环孢菌素、他克莫司和替尼泊苷。然而，和紫杉醇联合给予的聚乙二醇类化合物EL的剂量比和任何其它市售药物联合给予的都要高。聚乙二醇类化合物已被观察到引起严重的或致死的超敏反应事件。载体毒性也很大程度对在将紫杉醇快速输注到动物或人体中时观察到的致死的或威胁生命的过敏反应负有责任。(Dye和Watkins，1980；Lorenz等，1977；Weiss等，1990)。
制备紫杉醇的储备溶液并根据每只小鼠的体重制备单独的注射液。
将干燥的HA(Mr8.9×105k Da型)加入到一份24.5毫克/毫升的紫杉醇储备溶液中并涡旋过夜溶解，得到最终浓度为21毫克/毫升。为了确定无菌，加入庆大霉素至浓度为50微克/毫升并在4℃保温过夜。在加入[3H]紫杉醇后，HA/紫杉醇储备混合物用注射级氯化钠稀释到注射浓度。根据小鼠体重单独地制备注射液，以在50微升中注入15毫克/千克紫杉醇和12.5毫克/千克HA。当这种量的HA注入身体后，在试验期间观察饱和动力学(Fraser等，1983)。
为了确保HA在制备紫杉醇/HA注射混合物中保持其分子量，注射溶液在ephacryl S-1000大小排阻凝胶(Pharmacia，乌普萨拉，瑞典)上分析，柱规格为1.6厘米×70厘米，样品量为2毫升，流速为18毫升/h，流份为2毫升。图4显示在混合过程中HA保持其分子量。
小鼠被随机分成2组，每组40只。组1只接受紫杉醇，组2接受紫杉醇/HA组合治疗。动物被单独放到注射箱中，经尾静脉给予注射液。氚代紫杉醇(平均注射的每分钟衰变(dpm)±平均标准误差(SEM)19159146±1336819)在各注射液中被注入。小鼠单独放在柔软、不可湿润的塑料围栏中以收集尿样。在注射30min、1h、2h、4h或8h后，腹膜内注射0.1毫升戊巴比妥(Glaxo，Australia Pty.Ltd.，墨尔本，澳大利亚)将小鼠麻醉，并从心脏或大血管用针和注射器采集血样。采集血样后，通过颈部扭断处死动物。
血样转移到涂有EDTA的玻璃试管中，通过在14000gav下离心10min制备血浆。在用100微升30％v/v过氧化氢脱色并加入3毫升HiSafeII闪烁体后在50微升等份试样中计数放射性。为了克服化学发光和光致发光，根据样品来源在3、7或20天的时间内，在Wallac 1410β计数器中将样品计数2min。在计数之间的时间中，样品储存在室温黑暗中。所有计算都在除去化学发光和光致发光的稳定的样品上进行。
为了测定注射的紫杉醇在血浆中的百分比，需要使用以下标准公式计算每只小鼠的总血浆体积(毫升)小鼠质量(g)×小鼠血液体积(0.07)×血液中的血浆比例(0.59)然后计算血浆中注射的紫杉醇的百分比 ＝％血浆中注射的紫杉醇为了确保注入到血流中的紫杉醇的精确定量，切开在尾静脉上的注射位点并定量紫杉醇。残留在注射位点的紫杉醇的平均百分比也被测定。注入血流中的紫杉醇量(可分布到组织和肿瘤中的紫杉醇)可如下计算 注入血液中的紫杉醇量此后将被称为“注射剂量”。
为了进行样品群间的精确比较并归一化器官及肿瘤质量的轻微偏差，在身体器官、肿瘤和体液中的MTX浓度被表示为注射剂量/克组织的％。
计算残留在注射位点的紫杉醇注射液的平均百分比。为了归一化这种偏差，在肿瘤和组织中发现的dpm百分数被计算作注射的dpm减去残留在注射位点的dpm。该量被称为可利用的dpm或可利用的紫杉醇。
当可能时，用注射器和针从不可湿润的塑料围栏中采集尿样。通过在14000gav下离心10min使尿样澄清。在向8-30微升样品中加入3毫升HiSafeII闪烁体到后测定其放射性含量。
在处死小鼠后，立即将肿瘤、肝脏、心脏、脾脏、膀胱、左肾和右肾、子宫、肺、胃、肠、脑和淋巴结切除并分析总放射性。各组织的总放射性通过将100-400毫克组织在22℃下溶解在3-6毫升OptiSolv(ACC，墨尔本，澳大利亚)36h而被测定。溶解完成后，组织中的放射性在加入10毫升HiSafeIII闪烁体后而被测定。同样为了克服化学发光和光致发光，根据样品来源在3、7或20天的时间内在Wallac1410β-计数器中将样品计数2min。在计数之间的时间中，样品储存在室温黑暗中。所有计算都在除去所有化学发光和光致发光的稳定的样品上进行。实施例4 5-氟尿嘧啶和HA的使用介绍5-氟尿嘧啶(5-FU)是常用于治疗乳腺癌和胃肠道癌的抗代谢物(Piper和Fox，1982)。5-FU在细胞内转化成其核苷活性形式，在细胞内干扰DNA和RNA的合成。药物在体内通过两种机理作用(i)FdUMP紧密结合到胸苷酸合成酶，阻止胸苷酸形成，而胸苷酸是脱氧胸苷三磷酸(dTTP)的必需前体，dTTP是DNA合成所需的四种脱氧核糖核苷之一。由这种抑制引起的胸腺嘧啶较少状态对活性的分裂细胞是毒性的(Pinedo和Peters，1988)。
(ii)在第二种方式中5-FU的功能是将FUTP引入到RNA干扰RNA功能。将Fdurd和5-FU引入到RNA而导致的胸苷酸合成酶的抑制能够引起对细胞的细胞毒性作用。5-FU暴露的浓度和时间都是细胞毒性的重要决定因素。RNA指导的作用可能对延长暴露时间起主要作用，而DNA指导的作用可能在S期的细胞短期暴露期间更为重要。
几项研究已检验了HA作为抗癌药物的药物转运系统的用途。Coradini等(1999)将丁酸钠共价结合到HA上来测定该HA/丁酸钠组合是否增加体外乳腺癌细胞对药物的吸收。该研究表明HA作为药物转运载体的作用机理可能涉及HA-丁酸盐-酯衍生物被带到CD44受体上。HA/药物复合物被内在化，接着HA/药物复合物发生细胞质水解，而后释放丁酸盐，丁酸盐发挥抗增殖作用。进行了一项体内研究，此研究将丝裂霉素C共价结合到HA上，作为治疗鼠的Lewis肺异种移植物的手段(Akima等，1996)。发现HA-MMC复合物在0.01毫克/千克的低剂量下导致抗肿瘤活性，其中唯一的药物丝裂霉素C并不显示抗肿瘤活性。实施例5在人乳腺癌细胞中5-FU和HA协同作用的研究人乳腺癌细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-435和MDA-MB-231根据HA结和亲合力(Culty等，1994)和HA受体CD44和RHAMM的表达(Wang等，1996)而被选择。该细胞系的特点概述列于表3。表3透明质酸结合和人乳腺癌细胞系的受体表达
aCulty等，1994bWang等，1996细胞系MDA-MB-468，MDA-MB-435和MDA-MB-231如实施例1所述常规培养。
从表4可见当与未治疗的细胞相比时，生长在含有0纳摩尔/升5-FU+100纳摩尔/升HA的培养基中的乳腺癌细胞并不显示具有统计意义上的显著性的增殖或细胞毒性作用。表4透明质酸对乳腺癌细胞增殖的影响
统计检验通过使用非参数秩和检验和参数斯氏t-检验进行。因此所有结果都以0纳摩尔/升5-FU/0纳摩尔/升HA细胞数的百分比表示。在细胞系间发现了生长模式的显著性差异，例如MDA-MB-231和MDA-MB-468细胞表现很差的平板效率，其中在施加试验培养基前存在许多悬浮的细胞。MDA-MB-435细胞系表现高的平板效率和很快的生长速率。
当HA与5-FU组合时，在MDA-MB-468细胞系中观察到了协同细胞毒性作用，但在MDA-MB-231或MDA-MB-435乳腺癌细胞系中没有。如图11所示。单独的5-FU的IC50大于50微摩尔/升，但当与HA组合时，IC50为40纳摩尔/升，药物剂量下降1250倍。
体外试验的结果证明当在HA存在下将5-FU施加到乳腺癌细胞时，细胞杀伤力增强。MDA-MB-468细胞对5-FU/HA治疗最为敏感，其IC50从＞50微摩尔/升下降到40纳摩尔/升，而MDA-MB-231和MDA-MB-435均不被5-FU/HA组合显著影响。所有乳腺癌细胞系都表达高水平的CD44受体，其中MDA-MB-468(60-80％)，MDA-MB-231(40-60％)以及MDA-MB-435(40-60％)，如Culty等所测定(1994)。已证明用于这些试验的三种细胞系能够降解HA，这暗示着肿瘤细胞中CD44的功能可能是介导HA的降解(Culty等，1994)。
要考虑的另-个因素是细胞在前的暴露于化疗剂。在癌细胞系从患者分离前，癌症患者经常经过了化疗或放疗，这可导致肿瘤含有治疗抗性细胞。在MDA-MB-435和MDA-MB-231的情况中，细胞系来自其的患者以前都曾接受过5-FU治疗(Cailleau等，1974)。由于癌细胞含有几种适用的机理来克服药物的细胞毒性，很有可能在治疗后仍存活的肿瘤物质是耐5-FU的，因而改变细胞对药物的体外敏感性。
为了从小鼠的体外治疗数据推知相应的人的数据，仔细地开发试验模型和设计。为了明确表明5-FU/HA辅助治疗对人乳腺癌异种移植物的靶向和治疗功效，测定了以下因素人乳腺癌肿瘤在良好认证的Walter和Eliza Hall Institute的裸鼠系上建立，该裸鼠系是这种研究的被广泛接受的模型，它避免了对同种异体细胞的免疫反应。
在裸鼠和人体上的5-FU的药代动力学对比数据已经出版(Inaba等，1988)，它们用于本研究的设计，以尽可能近似地模拟人的治疗剂量。
主要目的是确证建立在这些小鼠中的肿瘤的组织学和细胞学行为与在它们的天然人主体上肿瘤的行为类似。在实现该目的的同时，我们还表明小鼠中的肿瘤细胞是人源的，并且它们表现与HA受体如RHAMM和CD44的高度相关性。实施例6HA和5-FU溶液的制备HA储备溶液(10微摩尔/升，7毫克/毫升)通过将干燥的HA(Mr7×105kDa型)溶解在0.9％w/v无热原注射级氯化钠中而制备。为确保溶液的均一性，HA在4℃过夜溶解，接着彻底涡旋。为确保在储备溶液制备过程中HA保持其分子量，溶液在Sephacryl S-1000大小排阻凝胶上分析，柱规格为1.6厘米×70厘米，样品体积为2毫升，流速为18毫升/h，流份为2毫升。HA最终使用浓度为100纳摩尔/升，所有稀释均在合适的生长培养基中进行。
5-FU的储备溶液通过将5-FU溶解在0.1摩尔/升氢氧化钠中并且其浓度用0.9％w/v无热原注射级氯化钠调至20毫克/毫升而制备。储备溶液在加入[3H]-FU并用注射级氯化钠稀释到注射浓度前用0.22微米滤器过滤以确保无菌。根据各小鼠的体重制备单独的注射液，目的是在50微升中注入30毫克/千克的5-FU(相当于平均体重为60千克的人的治疗剂量为10.5毫克/千克；Inaba等，1988)。将无热原的HA储备溶液(10毫克/毫升；Mr7×105Da型)加入到20毫克/毫升5-FU储备溶液中并涡旋保温过夜，到HA最终浓度相当于12.5毫克/千克小鼠质量。根据小鼠体重单独制备注射液，以在50微升中注入30毫克/千克5-FU和12.5毫克/千克HA。当这样量的HA注入体内后，在试验期间观察饱和动力学(Fraser等，1983)。为确保在注射混合物制备期间HA维持其分子量，注射溶液在SephacrylS-1000大小排阻凝胶上分析，柱规格为1.6厘米×70厘米，样品体积为2毫升，流速为18毫升/h，流份为2毫升。透明质酸在柱流份中通过糖醛酸分析而被测定。
糖醛酸分析用于定量测定从凝胶过滤色谱过程中收集的流份中的透明质酸。接着转移各流份的25微升等份试样到96孔板上。然后向这些流份中加入250微升咔唑试剂(3M咔唑/0.025摩尔/升硼酸盐的H2SO4溶液)。96孔板在80℃保温45-60min。使用带有550纳米滤光片的Dynatech MR7000平板读数器来读96孔板。当吸光度大于3倍背景吸收值的标准偏差时，吸光度被认为是显著性的。背景通过在V0和Vt前后取相同数目的样品点来计算，其中所取的平均数目为16(Fraser等，1988)。
HA和5-FU的配方(在0.5％氯化钠中的10毫克/毫升HA和20毫克/毫升5-FU，pH8.9)并未显示HA分子量的降解效应。大小排阻凝胶色谱分析表明保持700000Da的模态分子量。实施例7药物细胞毒性分析试验设计在设计体外药物滴定试验中，合乎需要的是使用与经静脉给予后血浆中达到的浓度相似的浓度。当5-FU以10.5毫克/千克(400毫克/米2)通过静脉内途径(iv)治疗给予时，在30min内血浆浓度峰值达到8克/毫升(61微摩尔/升，Kubo，1990)。根据这些体内血浆浓度，选择以下药物浓度0、1、5、10、20、50、100微摩尔/升5-FU±100纳摩尔/升HA。细胞系MDA-MB-468、MDA-MB-231和MDA-MB-435如实施例4到5中所述生长。当培养物达到铺满时，从瓶中的0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA中移出细胞。单细胞悬浮液用Coulter计数器(ZM1型)计数并且将细胞重悬浮到细胞特异性培养基中，至100000细胞/毫升。通过向每个孔加入0.5毫升细胞悬浮液将细胞涂到24孔板上(2厘米2表面积)，结果是50000细胞/孔。使培养物附着24h，在培养基被移出前，用HBSS洗涤单层细胞并施加测试培养基(5-FU+HA)。在测试培养基中生长4天后，培养物用HBSS洗涤，细胞通过用0.25％胰蛋白酶/0.05％EDTA而受胰蛋白酶作用被移出，并且用Coulter计数器计数。实施例8HA作为药物转运与肿瘤靶向载体的确认根据如实施例5到7所描述的体外试验中药物敏感性的结果和HA受体CD44与RHAMM的表达，选择人乳腺癌细胞系MDA-MB-468作为癌细胞接种体来产生任何裸鼠人体肿瘤异种移植物。细胞常规生长并如前面实施例5中所述而传代培养。为了注射到小鼠体内，细胞生长到100％铺满，在0.025％胰蛋白酶/0.01％EDTA溶液中受胰蛋白酶作用，在Beckman TJ-6台式离心机中在400gav下离心10min来洗涤两次，用ZM型Coulter计数器计数并在无血清Leibovitz L-15培养基中重悬浮至1×108细胞/毫升。
6到8周大的无胸腺CBA/WEHI雌性裸鼠养在无特定病原的条件下，供给不受限制的无菌食物和水。每只小鼠接受50微升含有5×106个细胞的注射液。细胞用26规针注射到在第一个乳头正下的乳脂垫中(Lamszus等，1997)。每周通过测定三个垂直直径(d1d2d3)而进行肿瘤测定。肿瘤体积用以下公式估算(1/6)π(d1d2d3)用5-FU±HA的治疗在癌细胞接种约4-8周后开始。在各项研究中使用的小鼠的平均肿瘤大小列于表5中。表5 在各项研究开始时人乳腺癌肿瘤的概要
要建立乳腺癌细胞系MDA-MB-468的肿瘤发生及其在注射入合适的动物主体后产生肿瘤的能力，需要进行病理学试验。肿瘤要是生理上有活力，新血管形成时必须的，其中毛细血管网为肿瘤提供营养物。血管形成、导管入侵、坏死、编程性细胞死亡的存在，高有丝分裂指数和核异常都是乳腺癌的特征。检测苏木精和曙红染色的乳腺癌切片表明了所有这些特征，从而证实了动物主体成功地保持了II级人乳腺癌。
在肿瘤引入后约8周，给予两只带有肿瘤的小鼠致死量的戊巴比妥。在处死小鼠的3min内，手术移出肿瘤并立刻在10％缓冲的福尔马林中固定12h。固定的肿瘤在一系列70-100％乙醇中过夜脱水，接着石蜡包埋，从其切下2-4微米的切片。将切片置于载玻片上，脱蜡，并放到水中。载玻片在PBS中洗涤×5min。嗜异性蛋白通过和10％胎牛血清保温10min而被封闭，接着用PBS洗涤。在RT应用检测抗体60min。检测抗血清或抗体是抗RHAMM、CD44H和CAE的。载玻片在PBS中洗涤3×5min，内源过氧化物酶活性通过浸入0.3％H2O2的甲醇溶液20min而被阻断。进一步用PBS洗涤之后，过氧化物酶接合的猪抗兔二级抗血清在室温下应用60min，接着在PBS中洗涤3×5min。Sigma快3，3′-二氨基联苯胺片剂(DAB)根据生产商的说明书而被制备，并且在RT下应用DAB溶液5-10min。这些载玻片在自来水中洗涤10min，用苏木精复染色，脱水并制成标本。
肿瘤的人源通过用人特异性的标记物将肿瘤和周围组织染色得到证实。CEA的存在清除地证明了肿瘤是人的，而由鼠主体的心血管系统供养。由于我们假设肿瘤靶向可以通过受体介导的内在化或结合而发生，因此有必要建立HA受体，CD44和RHAMM的表达。表6列出了在人乳腺癌异种移植物上受体的表达程度。表6在生长在裸鼠中的人乳腺癌肿瘤上的HA受体的分布
肿瘤上表位表达的级别指数0％ -1-25％+26-50％ ++51-75％ +++76-100％ ++++实施例9 5-FU和HA在裸鼠模型中的使用将小鼠随机分成两组，每组25只。组1只接受[3H]5-FU，组2接受[3H]5-FU/HA的组合。经尾静脉定量注入药物，注射器在注射前后被称重。包含在30毫克/千克5-FU±12.5毫克/千克HA中的氚代5-FU(平均注射的dpm±SEM31313002±131348)在每次注射中注入。
为了确保注入血流中的[3H]5-FU的准确定量，切开尾静脉的注射位点并测定其中的[3H]5-FU含量。注入血流中的5-FU量(用于分布到组织和肿瘤的5-FU)如下计算 注入血流中的5-FU被称为“注射剂量”。
为了在样品群间进行精确的比较并归一化器官和肿瘤质量的轻微偏差，身体器官、肿瘤和体液中的5-FU浓度以注射剂量/克组织的％表示。
小鼠单独养在柔软，不可湿润的塑料围栏中以收集尿样。在注射后10min、20min、30min、1h或2h后，腹膜注射0.1毫升戊巴比妥将小鼠麻醉。
麻醉动物后，从心脏或大血管用针和注射器采集血样。血液收集到EDTA玻璃试管中，通过在14000gav下离心10min而制备血浆。在用100微升30％v/v过氧化氢脱色并加入3毫升HiSafeII闪烁体脱色后在50微升等份试样中计数放射性。为了克服化学发光和光致发光，根据样品来源，在3、7或20天的时间内，在Wallac1410β计数器中将样品计数2min。在计数之间的时间中，样品储存在室温黑暗中。所有计算都在化学发光和光致发光已消失的稳定的样品上进行。为了测在血浆中注入的5-FU的百分比，需要计算每只小鼠的总血浆体积(毫升)。标准公式为小鼠质量(g)×小鼠血液体积(0.07)×血液中血浆的比例(0.59)1血浆中注入的5-FU的百分比可通过下式计算
当可能时，用注射器和针从不可湿润的塑料围栏中采集尿样。通过在14000gav下离心10min使尿样澄清。在向8-30微升样品中加入3毫升HiSafeII闪烁体后测定其放射性含量。尽管精确定量每只小鼠产生的尿体积有技术困难，通过以下公式计算尿中注射的5-FU剂量的百分比 一旦血液采集后，小鼠就被颈部扭断处死。小鼠处死后，立即将肿瘤、肝脏、心脏、脾脏、膀胱、左肾和右肾、子宫、肺、胃、肠、脑和淋巴结切除并分析总放射性。每个组织的总放射性通过将100-400毫克组织在22℃下溶解在3-6毫升OptiSolv 36h而被测定。溶解完成后，在加入10毫升HiSafeIII闪烁体后计数组织。样品如前所述计数以避免化学发光。
如图12所示，当将HA和5-FU组合时，有显著的靶向作用。药物在肿瘤的保留的中最大相对增加在10min时观察到，其中HA增强药物吸收的系数是2.42(p＝0.001，斯氏t-检验)。在给予HA/5-FU 20min和30min后，也观察到了肿瘤对5-FU的实现的统计意义上显著的增加，药物吸收的增加分别为1.5和2倍(p＜0.001，斯氏t-检验)。其它时间点没有表现单独给予5-FU和将其与HA联合注射间有统计意义上的显著性差异。
确定代谢器官如肝脏、脾脏和肾脏并不经历高水平的药物靶向很重要，这种药物靶向能抵销增加的肿瘤靶向的任何积极方面。表7列出了各组织在测试的不同时间点的[3H]5-FU的吸收。表7在带有人乳腺癌异种移植物的裸鼠中透明质酸对[3H]5-氟尿嘧啶的生物分布的影响 12点黑体代表HA的联合给予显著降低5-FU浓度的测量(斯氏t-检验)代表HA的联合给予显著升高5-FU浓度的测量(斯氏t-检验)图13显示HA的主要代谢器官是肝脏、淋巴结和脾脏，而5-FU大部分在肝脏中被代谢。
当5-FU与HA联合注射时，这些器官在5-FU吸收方面并不表现出显著增加。然而，在与HA联合给予后10min肾脏确实表现5-FU靶向的显著增加(增加1.8倍，p＝0.004)。在这一点后，即使不是统计意义上显著性的，该药物吸收增加的趋势一直持续到采样阶段结束。
膀胱、肠和骨髓并不显示5-FU的吸收增加。在如子宫的组织中，在10min时有短期药物吸收增加(增加1.8倍，p＝0.032)，但在其它时间点上没有显示差别，所以这一观察的意义仍不确定。
在一个或两个采样点上，胃、脑和肺没有显示5-FU吸收的增加。然而，由于在每个时间点上动物数目少(n＝5)，不可能证实统计意义的显著性，即使如图14A-C中所示可观察到明确的趋势。
在后来的取样点1h和2h，观察到心脏的5-FU的显著下降，其中与HA联合给予分别导致59％(p＝0.003)和53％(p＝0.021)的下降。
由于排尿速率的变化，不可能从每只小鼠上收集到尿样；因此没有收集到充足的尿样来实现统计分析。
当5-FU和HA联合注射时，5-FU在循环系统水平有早期下降(表7)。透明质酸降低血浆中的5-FU55％(p＝0.001)。接受5-FU/HA的小鼠的药代动力学血浆半衰期从28min改变为56min，如图15所示。实施例10小鼠治疗方案的给药人乳腺癌的最常用的治疗方案是环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶，它们在28天循环中的第1天和第8天给予。在人乳腺癌中，初始治疗方案是6个循环，其后重新评估患者的症状，因此我们通过对小鼠进行6个循环(6个月)的长期疗效研究和6个循环(6周)的短期疗效研究来尽可能近似地模拟人治疗方案。考虑到小鼠的生命周期大约为2年，我们同时开始短期和长期治疗方案，如表8所示。表8治疗给药方案
短期研究的小鼠被随机分成7组，每组8只，长期研究的小鼠被随机分成5组，每组8只(参考表8中的剂量和治疗给药方案)。
治疗不超过6个月，因为已证明化疗超过6个月一般不会有更大的好处(Harris等，1992)。
在进行长期研究的那天，如实施例8中所描述，称重动物并测定肿瘤体积。在6周研究中，每天称重动物并测定肿瘤体积。动物单独放在注射箱中，注射液经尾静脉给予。试验已证明紧张是患者对化疗的反应的主要因素(Shackney等，1978)，因此我们确保在每个笼中分配相同数目的小鼠，每个笼中动物的数目根据试验阶段在5到8的范围内变化。
当动物因疾病进展程度加重而必须被处死或当6个月(长期)或6周(短期)治疗结束时，试验终点出现。由于动物伦理准则，动物由评估疾病进展程度的独立的动物伦理官员每两周监测一次。如图16所示，以下的标准用来决定动物是否已经到达必须死亡的试验终点1).动物不吃或喝，并且体重急剧下降；2).肿瘤尺寸大于10％体重(画面A)；3).肿瘤质量大到动物不能行动(画面B)。
在试验终点，动物通过腹膜注射0.1毫升戊巴比妥(60毫克/毫升)麻醉，采集血液，接着扭断脖颈处死动物。
在6周研究结束时，测定肿瘤质量，5-FU和5-FU/HA治疗均比盐水治疗组有明显小的肿瘤(p＝0.005)，如图17。在5-FU和HA/5-FU治疗组间肿瘤体积没有显著性差异，表明两种治疗表现出对原发肿瘤的相同功效。在盐水组和HA组原发肿瘤体积间没有观察到统计意义上的差异。
处死小鼠后，立刻切除肿瘤、肝脏、脾脏、膀胱、左肾和右肾、子宫、肺、胃、肠、脑和淋巴结并放入4％用0.06摩尔/升，pH7.5的磷酸盐缓冲的福尔马林和1.0％w/v氯化十六烷基吡啶鎓中。组织在组织学分析前固定16-24h。固定的组织逐级脱水到100％乙醇，并在石蜡中包埋，从其取2-4微米切片放到玻璃显微载玻片上。组织切片用苏木精细胞核染色并用曙红细胞质染色，突出能表明治疗毒性的病理特征。
采集每只小鼠的9到11个淋巴结，确保采集所有给肿瘤区导液的淋巴结。目前有两种方法用来测定淋巴结转移i)总器官结构的常规苏木精和曙红染色ii)使用癌症标记物如癌胚抗原的免疫组织化学两种转移测定方法在本研究中都被使用。并非所有市售CEA抗体都与人乳腺癌细胞反应，所以我们测试了5种不同抗体(DAKO，Amersham和KPL)的反应性。
苏木精和曙红染色的淋巴结由P.Allen博士(有授权证书的病理学家)检测，其中每个淋巴结都经显微检测是否存在肿瘤细胞。CEA免疫染色的淋巴结被显微检测，其中任何正染色的淋巴结被计数并被认为是淋巴结转移阳性的。
肿瘤体积每天或每周通过卡钳测量而被监测，并且肿瘤体积如前面实施例8所述而计算。
5-FU最常规的毒性之一是在胃肠道中，在那里可能发生出血性肠炎和肠穿孔(Martindale，1993)。每天监测动物胃肠道紊乱如腹泻，并且每周监测更严重的毒性表现如体重减轻。体重减轻通过减去肿瘤重量而估算的净体重来监测，肿瘤重量以1克×肿瘤体积(厘米3)来计算，如Shibamoto等，1996中所述。为了表明动物体重的任何变化，将动物体重归一化至治疗开始时的体重 无论何种治疗方案，没有在任何小鼠上观察到每日胃肠道紊乱如腹泻。每种治疗方案的严重的胃肠道毒性通过使用体重(不包括肿瘤重量)减轻作为指标而被估计。在每只动物死亡时，体重变化的百分比如前所述计算。盐水、HA、5-FU治疗组与5-FU/HA治疗组相比时，归一化的体重有统计意义的显著性差异(图18)。接受5-FU/HA辅助治疗的小鼠在整个治疗过程中，与未治疗组相比，显示体重有16％的增加(斯氏t-检验，p＝0.025)，未治疗组的体重净增加为2％。
癌胚抗原(CEA)的免疫组织化学检测与传统的诊断病理学的组合提供淋巴结转移的极佳的定量方法。小鼠平均含有15-19个淋巴结(Lamszus等，1997)，因此本研究检测了动物大约60-70％的淋巴结。接着进行仔细的过程以确保所有给乳脂垫和胸部导液的淋巴结都被切除并测定。如表9A中所示，所有动物都表现出淋巴结转移。表9A 5-FU/HA辅助治疗对裸鼠中人乳腺癌异种移植物的生长和转移的影响6周研究
图19A显示淋巴结累及(每只动物转移的淋巴结的数目)的百分比受到5-FU、5-FU/HA和HA治疗的很大影响，而盐水组显示淋巴结累及数目增加6倍。HA再-次证明它具有治疗价值。
当在研究结束解剖动物时，每一组织都经显微镜和肉眼检查其肿瘤小结。除了接受HA/5-FU或HA治疗的小鼠外，在颈部周围和邻近原发肿瘤的腋下区观察到了新的肿瘤。将HA引入到治疗方案中抑制新肿瘤的形成，如图19B所示。
无论何种治疗，在患者总体存活上没有显著性差异(表9A)，其中所有组的动物均完成了治疗方案。
与5-FU治疗有关的主要毒性之一是骨髓抑制以及作为结果的白细胞下降，因而需要评估任何与治疗相关的血液毒性。在将动物麻醉后，用针和注射器从心脏或大血管采集血液。通过在小鼠韧度盐水(mouse tenacity saline)(M)中稀释小鼠血液1/10并在血细胞计数器上来估计白细胞数目。通过计数，中性粒细胞、淋巴细胞和红细胞而进行不同的血液计数。血细胞部分总体的总估算与出版的小鼠血液数据进行比较。
为确保治疗不诱导器官萎缩或增大，在死后检查期间移出器官并称重。计算各器官的质量占总净体重的百分比，并且与盐水组(组1)的器官质量比较。实施例11长期治疗6月治疗方案当本研究仍在进行中时，产生着有意义的数据。
TDT是肿瘤的质量或细胞数目加倍所需的时间(天)，它是肿瘤生长的参数，它易于测定并能很容易地在理论上与临床肿瘤行为相联系(Shackney等，1978)。通过监测肿瘤加倍时间，经常可能评估肿瘤化疗的反应，因为缓慢生长的肿瘤倾向于对化疗反应差(Schabel，1975)。
每种治疗的肿瘤加倍时间列于表9B。表9B 5-FU/HA辅助治疗对裸鼠中人乳腺癌异种移植物的生长和转移的影响6月研究
在5-FU/HA和5-FU治疗间TDT没有显著性差异。如6周研究所示，给予HA也显示对原发肿瘤的治疗作用，其TDT为26±1.75天，而盐水组为13±4天。在给予5-FU前24h给予HA看来抵消与肿瘤延迟生长有关的5-FU的任何治疗价值。
在监测肿瘤治疗反应和进展中，肿瘤质量和体积是有用的参数，但它们并不最终证明由治疗产生的细胞毒性作用。我们希望确证HA/5-FU治疗是否杀死更多的肿瘤细胞以及细胞的位置。垂死的细胞可通过以下方法得到病理学显示i).细胞核解体(编程性细胞死亡)ii).细胞溶胞(坏死)将整个肿瘤图像扫描到计算总肿瘤面积的MCID计算机中定量计算垂死细胞的数目。具有碎裂细胞核的细胞或溶解的细胞被描绘和扫描，接着将这些面积数字化，从而计算垂死细胞的准确面积。对垂死细胞有贡献的肿瘤的百分比可如下计算 能生存的细胞比垂死或死细胞含有更多的水，因此通过测定干肿瘤质量对湿肿瘤质量的比率就有可能估计能生存的对不能生存的总面积。将肿瘤两侧地切开，其中一半进行肿瘤病理学检查，剩余一半在50℃干燥48h前后称重。干质量作为湿肿瘤质量的百分数如下计算
患者总体存活时间以动物在开始治疗后存活的时间(天或周)来计算。
各治疗的肿瘤加倍时间列于表9A。在用5-FU/HA和5-FU治疗间TDT没有显著性差异。然而给予HA显示对原发肿瘤的治疗作用，其中TDT明显大于盐水组(p，0.05，多重比较Tukey检验)。在给予5-FU 24h前给予HA看来抵销与延迟肿瘤生长有关的5-FU的任何治疗价值。
所引用的5-FU的治愈率是26％(Inaba等，1989)，但是接受5-FU的动物并不经历“治愈”。两只接受HA/5-FU辅助治疗的小鼠经历了“治愈”，其中肿瘤完全坏死并在治疗约12周后脱落。图20B显示接受HA和HA/5-FU的小鼠上特征的小痂形成的出现，而图20C显示小面积坏死的出现，接着形成大面积痂。其中一只小鼠经历小结的再生长，但第二只小鼠在22周时仍无肿瘤。如图20A所示，接受5-FU或盐水的小鼠具有大肿瘤，最终以动物因肿瘤质量的负担过重而死亡(表9B)，但是接受HA±5-FU的小鼠表现出特征性的肿瘤外观，其中小面积肿瘤坏死，接着形成痂。
在第22周，37.5％的5-FU/HA小鼠仍然存活，5-FU/HA辅助治疗的小鼠死亡的主要原因是体重减轻与代谢抑制(表9B)。
当将HA±5-FU给予带有人乳腺癌异种移植物的小鼠时，总患者生存看来有显著性差异。在24周研究的第22周，唯一存活的组是5-FU/HA和HA组，图21所示。结论来自5-FU靶向的数据显示当5-FU与HA联合注射时，在时间点10、20和30分钟时肿瘤对在5-FU的吸收有统计意义上的显著性增加，它们分别为2.4、1.5和2倍增加(表7)。这表明5-FU通过HA靶向于肿瘤。HA将5-FU靶向于肿瘤细胞有两种可能的机理含有缔合的5-FU的HA结合到受体(CD44)上并通过受体介导的胞吞作用被内在化，从而将药物释放到肿瘤细胞中。
HA分子网络将起阻止向外扩散的作用，这样在HA结合到受体(CD44和RHAMM)上后，所携带的5-FU能够扩散到肿瘤细胞中。当5-FU被HA基质保留在细胞表面时，5-FU增加了通常用于5-FU转运到下面的细胞中的主动转运机理的可用性。
HA的分解代谢主要发生在淋巴结(Fraser等，1988)和肝脏中(Laurent等，1986)。HA一般通过在肝脏(80-90％)、肾脏(10％)、脾脏(0.1％)和骨髓(0.1％)中受体介导的细胞吸收和分解代谢被从血流中清除(Fraser等，1983)。循环的HA被代谢受体吸收，代谢受体也称为肝脏内皮细胞(LEC)受体(Eriksson等，1983)，而CD44受体看来与HA内在化有关，HA内在化与细胞过程而不是代谢分解有关，而RHAMM受体仅与细胞游动性有关。HA与5-FU组合能导致高水平的5-FU靶向于HA或5-FU代谢位点上。来自靶向试验的数据(表6)显示当5-FU与HA联合给予时，在5-FU靶向于肝脏上没有显著性增加。由于没有观察到靶向于肝脏的增加，她可能意味着在肝脏上的LEC受体与CD44受体相比具有对HA更低的亲合力。另一可能性是表达在肝细胞上的CD44同种型(Stamenkovic等，1991)并不与HA以高亲合力结合。与肝脏一样，没有观察到在其它代谢器官，脾脏、骨髓和淋巴结上5-FU靶向的增加。
在10min时间范围内5-FU靶向肾脏有1.8倍的显著增加。虽然在其它4个时间点上，当HA/5-FU联合给予时肾脏并未表现出对5-FU吸收的显著增加，但看来有一般趋势出现，其中在与HA联合给予时有更多的5-FU转移到肾脏。5-FU从体内最终消除的主要途径是泌尿排泄。即使HA与药物的肾脏含量看来只有很少的增加，但我们根据其它证据相信HA被肾脏吸收并很快分解代谢，这样其存留时间将很短，并且所缔合的药物将很快释放到尿液中。
在组织中如胃、脑、肺和子宫，短期靶向在一个或多个时间点上被观察到。没有一致的药代动力学模型产生，这可能表明我们需要增加样品数目，这能最终表明这些观察是否真实。在10-30min时靶向于脑的增加的情况中，这可以通过以前的观察得到解释，即HA与增强药物穿过血脑屏障的能力有关(Nelson和Falk，1994)。
当5-FU与HA联合给予时，在时间点30min和1h，肺中的5-FU水平显著增加。已报道肺巨噬细胞含有高水平的HA-结合，CD44同种型(Underhill等，1993)，这可能是靶向增加的原因。这可能与在肺癌治疗中的治疗优势有关，其中小的和大的肺癌细胞已被报道含有CD44和RHAMM的过度表达(Horst等，1990)。
当HA与5-FU联合注射时，在时间点1和2h上，5-FU靶向于心脏显著下降。由于给予5-FU能导致心脏毒性(MIMS，1997)，5-FU与HA联合给予与单独给予5-FU相比可能降低对心脏的毒性。
当评估HA/5-FU辅助治疗的治疗功效时，在长期和短期治疗方案中的几种观察均一致。
接受HA/5-FU或单独的HA的小鼠看来具有更多的能量并维持或增加体重，在6月研究中HA/5-FU小鼠的存活时间增加支持这个观察。
接受5-FU/HA或HA的小鼠的肿瘤发展外部坏死区，到两个肿瘤脱落的程度。
将HA加入到5-FU中在治疗6周后看来对原发肿瘤的体积没有显著影响，但是这可能是由于肿瘤的脉管系统所致。肿瘤由三个区组成。当HA与或不与5-FU联合给予时，它将到达肿瘤，通过损伤的血管的缝隙连接进入良好血管化和半坏死的区域。由于HA的吸水能力，这可导致细胞外液流入肿瘤坏死区，从而增加肿瘤体积并引起肿瘤脉管系统的进一步损伤。这一假设与以下观察一致用HA±5-FU治疗的肿瘤并不常规显示坏死和肿瘤细胞内液的渗漏。当计算完坏死对能生存的细胞面积的比率和于质量湿质量比率时，我们将能证实这一假设。
长期功效研究显示接受HA/5-FU治疗的小鼠存活率增加，如图21所示。这些小鼠的平均肿瘤体积与其它治疗组相比也下降。还注意到在长期研究中HA/5-FU组的死亡原因主要是由于代谢抑制，而5-FU组的死亡原因更多是由于肿瘤体积太大而引起的行动不便。所有仅HA治疗的小鼠都死于肿瘤太大而引起的行动不便，而不是由于毒性而死亡。因此给予HA看来并无任何毒性作用。从靶向结果可以发现当HA与5-FU组合时，5-FU靶向肿瘤增加(图12)。通过HA结合到在肿瘤位点上存在增加的HA特定受体CD44和RHAMM(Culty等，1994；Wang等1996)，HA将5-FU靶向于肿瘤的能力可反映HA与5-FU及其它细胞毒性药物的使用可能有助于克服没有足够的药物到达肿瘤而没有任何治疗效果的问题。还发现在短期研究中5-FU/HA小鼠与所有其它组相比体重明显增加(图21)。因此，HA靶向肿瘤位点的能力可以降低进入其它器官如肠中的5-FU的量，这样减少与5-FU治疗有关的副作用，尤其是胃肠道毒性。
与先前实施例1到3中公开的MTX/HA辅助治疗的评估相比，我们注意到一些独特的共同结果和差别，如表10中所列。表10MTX/HA和5-FU/HA辅助治疗间的共有结果与差别
两项研究的主要差别是肿瘤的起始质量，其中在MTX/HA研究中平均肿瘤体积为175.13毫米3，而在5-FU/HA研究中平均肿瘤体积为61.63毫米3。通过质点运动到肿瘤中的动力学和患者对肿瘤体积的反应，可解释获得的与TDT估计有关的不同结果。实施例12与透明质酸组合治疗的治疗功效对人体原发和转移乳腺癌，最常用的治疗方案之一是环磷酰胺(Cyc)、MTX和55-FU的组合化疗，它们在28天周期的第1天和第8天给予。通常称为CMF的该组合治疗通常进行6个周期，之后患者的症状被重新评估。用CMF治疗的抗肿瘤反应率被报道约为50％(Bonadonna，1981；Bonadonna，1988)，但是该治疗具有许多相关的副作用，例如疲劳、恶心、白细胞减少和呕吐(Bonadonna，1976；Meyerowitz，1979)。由于成功地将HA用作MTX和5-FU的药物转运载体，我们评价了6周和6月的治疗方案中HA/CMF辅助治疗的功效和毒性。
MTX和-FU分别如前面实施例2和6中所述被制备。储备浓度的Cyc通过将1克冻干药物溶解在1毫升注射级无热原蒸馏水中，并用注射级0.9％氯化钠稀释到50毫升而制备。储备溶液等分成小体积并冷冻在-20℃，直到使用。
CMF注射液通过将适量药物储备溶液调至药物最终浓度而获得，药物最终浓度为30毫克/千克5-FU (储备溶液20毫克/毫升)15毫克/千克MTX (储备溶液24.5毫克/毫升)26毫克/千克Cyc (储备溶液20毫克/毫升)12.5毫克/千克HA (储备溶液10毫克/毫升)为了确定CMF/HA辅助治疗的疗效和任何可能的毒性，使用在裸鼠中的人乳腺癌异种移植物。为了尽可能近似地模拟人治疗方案，小鼠在长期疗效研究中被治疗6个周期(6个月)，在短期疗效研究中被治疗6个周期(6周)。小鼠被随机分成7组，每组8只，用于短期研究，另5组，每组8只，用于长期研究。
小鼠在6周治疗的7天治疗方案的第1或2天或在6月治疗的28天治疗方案的第1或8天用30毫克/千克5-FU；15毫克/千克MTX；26毫克/千克Cyc±12.5毫克/千克治疗。对照组包括给予盐水、12.5毫克/千克HA的小鼠或第一天给予12.5毫克/千克HA，接着第二天给予CMF的小鼠。每天监测小鼠的任何治疗毒性，每天或每周测定肿瘤质量(见表11)。表11治疗给药方案
如表12a和12b所示，在6周研究中观察到以下现象1).接受含有HA治疗方案(CMF/HA，HA接着是CMF或仅HA)的小鼠表现出比仅CMF组存活增加50％。CMF治疗组的平均存活时间是40.4天，而所有其它组的为42天。2).用HA和CMF组合治疗的动物均显示比仅用CMRF或仅用HA治疗的动物体重增加(t-检验，p＜0.001)并显示保持良好的状态。(见图22)。3).盐水治疗的小鼠(无治疗对照组)的肿瘤加倍时间显著小于其它治疗组(t-检验，p＜0.001)，但是其它治疗组间没有统计意义上的显著性差异(见图23)。4).关于原发肿瘤终点体积，CMF和CMF/HA治疗组间存在显著性差异(t-检验，p＝＜0.001)，其中CMF导致7/8的动物的肿瘤质量的下降，而CMF/HA仅导致3/8的动物原发肿瘤体积减小。5).当小鼠用HA±CMF治疗时没有观察到治疗毒性，而仅用CMF治疗的小鼠表现出疲劳、结膜炎、一般健康变差。
当在28天周期中的第1天和第8天给予CMF/HA或HA治疗时，能观察到以下现象1).在治疗组间没有体重增加上的显著性差异。2).接受HA±CMF治疗的小鼠的原发肿瘤表现出小面积坏死和痂的形成。3).在原发肿瘤治疗中，CMF作为单独的药物并不显示治疗功效高于盐水和HA治疗。将HA加入CMF导致显著增大的原发肿瘤(t-检验，p＝0.001)。表12ACMF/HA辅助治疗对裸鼠中人乳腺癌异种移植物生长和转移的影响6周研究
表12BCMF/HA辅助治疗对裸鼠中人乳腺癌异种移植物生长和转移的影响6月研究
由本研究可得到下列结论1).长期(6月)给予HA/CMF辅助治疗并不显示疗效增加或治疗副作用降低。2).短期(6周)给予HA/CMF辅助治疗显示比仅用CMF治疗具有许多优点。3).体重明显增加。4).完成治疗的动物数目增加50％。5).消除副作用如疲劳、结膜炎、食欲丧失。6).接受HA的小鼠不表现出任何毒性现象。实施例13化疗药与HA相互作用性质的NMR研究为了进一步研究HA与化疗药间相互作用的性质，使用1H核磁共振(NMR)谱。重水(2H2O(99.96％))得自剑桥同位素实验室。MTX来自Faulding Pharmaceuticals，5-FU和HA储备溶液如前所述制备。
在298K下在用一个屏蔽的梯度元件(gradient unit)在600MHz下操作的Bruker DRX分光计上纪录谱图。2D试验在相敏模式下纪录，用时间一比例相增量以在t1维中积分(Marion和Wuthrich，1983)。2D试验包括TOCSY序列，使用MLEV-17自旋锁序列混合时间为120ms(Bax和Davis，1985)；混合时间为250和400ms的NOESY(Kumar等.，1980)和混合时间为250ms的ROESY谱。探针的温度校正通过与乙二醇化学位移比较获得。所有化学位移(ppm)都以4，4-二甲基-4-硅杂戊烷-1-磺酸盐的甲基共振(DSS，0ppm)为对照。
用于NOESY、ROESY和T℃SY试验的水信号的溶剂抑制是通过使用改进的WATERGATE序列(Piotto等，1992)获得的，WATERGATE序列中1ms的二梯度脉冲被应用于二项3-9-19脉冲的任一侧。光谱在6024Hz下用4096综合数据点在F2和F1维的512增量下常规获得，TOCSY试验每一增量扫描32次，NOESY试验每一增量扫描80次。缓慢交换NH质子通过得到一系列在16K数据点上用32扫描获得的1维(1D)光谱测定。
NMR扩散试验在装有梯度控制元件并在500MHz下操作的Bruker AMX分光计上获得。所有试验在298K下在16K数据点上和在7575Hz上用16或64扫描获得。15.44G/厘米的梯度强度被用于扩散试验。每一扩散试验从一系列12 PFGLED光谱获得，光谱中延迟(τ＝20ms，Δ＝50ms，T＝30ms及Te＝14ms)，其中G的量级保持不变，但在最终光谱中场梯度脉冲的长度(δ)以1ms步幅从0.2ms增加到12.2ms。
所有光谱都在Silicon Graphics Indigo工作站上用Xwinnmr(Bruker) 软件处理。对于2D试验，t1维是零填充的2048真实数据点，90°相位移的正弦钟形窗口(sine-bell window)功能在傅里叶转换前得到使用。
NMR试验被设计用来监测在加入HA时的MTX的1H NMR谱图变化。通过监测药物MTX谱图中的特定变化，如峰的加宽或移动，也有可能观察药物分子的哪个区域与HA相互作用。图24显示了溶在H2O中的MTX的1H NMR谱图。该谱图很容易识别甲氨蝶呤中的各组氢。甲氨蝶呤甲氨蝶呤具有许多可能与透明质酸分子相互作用的官能团。在MTX的芳香环上2，4-氨基-喋啶的伯胺基团能与透明质酸分子的羧基形成离子缔合。在甲氨蝶呤上的胺基与透明质酸糖环的羟基间的氢键相互作用是另一种可能性。MTX的疏水芳环和折叠的透明质酸聚合物的疏水块间的疏水相互作用也是可能的。这些相互作用在图25中说明。
为了解决在甲氨蝶呤和HA间是否有特异性的相互作用的问题，设计NMR试验来监测在加入HA后MTX的1H NMR谱图的变化。图26显示了透明质酸在600MHz和298K下的600MHz谱图。
图27显示了在298K下MTX单独的600MHz1H NMR谱图和逐渐加入HA(50kDa)的600MHz1H NMR谱图，加入的HA为2纳摩尔、10纳摩尔、20纳摩尔和80纳摩尔。这些谱图显示甲氨蝶呤的任何峰的化学位移位置。另外的峰出现于谱图，当连续量的HA加入时，这些峰与因透明质酸的共振完全一致。由于在这些光谱中MTX的任何共振的化学位移位置都没有变化，看来没有与HA分子相互作用的MTX分子的特定区域。
确定MTX的NH基团和HA的酸基团间是否有强的相互作用的一个方法是测定NH质子的交换速率。这些氢是不稳定的并能与大量溶剂快速交换。然而如果它们在与HA分子强的相互作用中被涉及，那么它们将被保护，而免于与大量溶剂交换，并且它们的交换速率将下降。在该试验中，MTX的胺基氢与D2O的氘交换，交换率应提供MTX和HA间相互作用强度的定性估计。通过将重水加入到MTX和HA溶于0.5％w/vNa2CO3(pH9)的溶液中制备的溶液的1H NMR分析表明在4分钟内MTX的所有胺基氢都与样品中的氘交换。这一结果表明MTX中的胺基氢未被保护，而能与大量溶剂交换。
胺基氢的峰从1H NMR谱图中消失的原因是因为氘比氢具有非常不同的共振频率，因此它在1H NMR谱图中并不出现。类似的试验常规地用来测试在多肽和蛋白质中主链酰胺氢原子是否得到保护不受溶剂影响。当蛋白质的酰胺氢包含在稳定α-螺旋和β-片二级结构的氢键排列中时，这些氢的交换速率经常急剧下降。在一些情况下，包含在这些相互作用中的氢信号能根据相互作用的强度和它被保护不受大量溶剂影响(例如在蛋白的疏水核心中)而持续数小时，数天，甚至数月。
扩散试验在单独的MTX下和有HA存在的MTX下进行。这些试验能表明被俘获的MTX的扩散是否被HA骨架的存在而延迟。双重1H NMR扩散试验的结果表明对于绝大多数MTX分子，MTX扩散率没有延迟，因为在MTX和在HA存在下的MTX的扩散系数间几乎不存在差别。这些发现表明在HA骨架中在HA分子间具有很大的溶剂空穴，它们允许药物自由扩散进入介质。
扩散试验显示大量MTX分子自由扩散通过HA骨架。这一设想并未考虑是否小部分MTX(比方说5％的MTX分子)以非特异性方式与HA分子很弱地相互作用。
根据前面的试验，显然MTX并不与HA强烈相互作用，即便存在的话，相互作用也是非特异性的。测试非特异性结合的弱结合配体(10-3-10-7M)的一种方法是进行变换的(transferred)NOESY试验。在这些2D试验中，如果配体与大分子HA弱结合，交叉峰将会出现。MTX/HA的变换的NOESY谱图表明由于MTX与HA的结合而没有交叉峰，表明MTX和HA间相互作用可以忽略。
作为是否小部分MTX(比方说5％MTX分子)以非特异性方式与HA分子很弱地相互作用的进一步检查。在ROESY谱图中的峰应显示是否甚至在化学交换方面有小部分MTX分子在自由和与HA结合状态间。250ms ROESY谱图并不显示任何化学交换峰，这表示没有甚至很小百分比的MTX与HA存在相互作用。5-氟尿嘧啶图28显示了在298K时在70.0和8.5ppm间5-FU和具有HA(750kDa，3毫克/毫升)的5-FU(1.25毫克/毫升、1.6毫克/毫升和6.4毫克/毫升)的600MHz1H NMR谱图。要研究是否有相互作用的初始试验用50kDa透明质酸进行。在5-FU与HA间没有观察到相互作用(数据没有显示)。为了研究相互作用是否依赖于所用的HA的分子量，进一步滴定试验用750kDa透明质酸进行。所用的5-FU的浓度等于HA/5-FU辅助治疗Kings College London配方研究，该研究以瑞典临床试验中的制剂进行。这些浓度被设计来模拟用于HA/5-FU混合的浓度，输注袋中的浓度和在血浆中估计的HA/5-FU浓度。遗憾的是，5-氟尿嘧啶的胺共振在这些配方的pH(8.8到9.1)下与大量溶剂水快速交换，因此这些共振在5-FU谱图中看不见。在5-FU谱图中只可看见一个CH共振。降低这些溶液的pH是不可行的，因为5-FU将在低pH值下从溶液中沉淀出来。这些谱图显示在5-FU的CH峰的化学位移位置没有变化。这些谱图表明5-FU看来并不与HA分子相互作用。
扩散试验在5-FU单独存在和与HA一同存在下进行。列于表13的双重1H NMR扩散试验结果表明5-FU扩散并不因为HA存在而被延迟，因为在5-FU单独存在和与HA一同存在的扩散系数几乎没有差别。表4NMR扩散系数
2D试验，NOESY和ROESY5-FU上的2D试验是不可能的，因为在它的1H NMR谱图上只有一个共振是可见的。
MTX和5-FU在HA存在下的NMR分析使用滴定试验、氘交换试验、扩散试验和MTX的变换的NOESY试验，5-FU的滴定试验和扩散试验显示在化疗剂和透明质酸间没有测到相互作用。这些结果表明化疗剂被HA网络俘获足以增加转运到病理位点上的药物的量。这些结果与以前使用凝胶过滤色谱、平衡透析和CD光谱的HA和MTX间分子相互作用的研究完全一致，它们也未检测到相互作用。
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权利要求
1.增强细胞毒性或抗肿瘤药物的有效性的方法，包含将所述药物与透明质酸联合给予的步骤，其中与透明质酸联合给予增强所述药物的癌细胞杀伤力。
2.根据权利要求1的方法，其中的药物选自由甲氨蝶呤、紫杉醇(他克唑)、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺以及它们的组合组成的组。
3.细胞毒性或抗肿瘤药物组合物，包含透明质酸和细胞毒性或抗肿瘤药物，其中所述组合物被全身给予。
4.增强细胞毒性或抗肿瘤药物的有效性的方法，包含给予权利要求3的组合物的步骤。
5.降低或克服耐药性的方法，包含将细胞毒性或抗肿瘤药物与能够携带和/或结合所述药物的粘多糖联合给予的步骤，所述粘多糖能够与耐药细胞上的受体结合或通过整体胞吞作用进入细胞，其中所述药物被转运到细胞中，从而使其成为治疗活性的。
6.根据权利要求5的方法，其中的粘多糖能够结合于耐药细胞表面，其中所携带或结合的药物从所述粘多糖扩散进入细胞。
7.增强药物有效性的方法，包含将所述药物和与所述药物缔合的粘多糖联合给予的步骤，缔合方式使与所述药物被单独给予相比，所述药物在细胞内存留更长的时间。
8.治疗耐药性疾病的方法，包含将透明质酸与药物联合给予需要这种治疗的患者。
9.根据权利要求8的方法，其中的耐药性疾病是耐药性癌症。
10.根据权利要求9的方法，其中的癌症对甲氨蝶呤、紫杉醇(他克唑)、5-氟尿嘧啶、环磷酰胺或它们的组合中的一种或多种有耐药性。
11.治疗癌症的方法，包含将药物与能够携带或结合所述药物和/或与所述药物缔合的粘多糖联合给予的步骤，缔合方式使与所述药物被单独给予相比，所述药物在细胞内存留更长的时间。
12.减轻药物的胃肠毒性的方法，包含将药物与能够携带或结合所述药物和/或与所述药物缔合的粘多糖联合给予的步骤，缔合方式使所述药物具有降低的胃肠毒性。
全文摘要
本发明涉及药物疗效的增强,特别是同时克服细胞或生物体的耐药性。尤其是,本发明提供了增强细胞毒性或抗肿瘤药物的有效性的方法,所述方法包含将所述药物与透明质酸联合给予的步骤,其中与透明质酸联合给予增强药物的癌细胞杀伤力。
文档编号A61K31/519GK1336828SQ00802748
公开日2002年2月20日 申请日期2000年1月6日 优先权日1999年1月13日
发明者特蕾西·布朗 申请人:美迪泰克研究有限公司