本发明属于药品及药品制造
技术领域：
，特别涉及一种积雪草总苷脂质体及其制备方法。
背景技术：
积雪草总苷(centellatotalglucosides，ctg)是伞形科植物积雪草的提取物，有效成分为三萜型皂苷及其衍生物类，其中以积雪草苷、羟基积雪草苷的含量最高，活性最强。现代药理研究表明：ctg不仅能够促进细胞生长，加速伤口愈合，修复皮肤损伤，还具有抗氧化，抗溃疡、消炎等作用。临床上常用于手术创伤、烧伤，增生性疤痕等疾病的治疗。但由于ctg中多为极性大分子，不容易透过皮肤表皮到达病变部位，单纯的促渗不能完全达到治疗疾病的目的。将药物包封于脂质体中，不仅可以发挥良好的促透作用，还可使药物尽可能少的进入血液循环，集中于皮肤病灶，形成药物贮库，缓释药物，是理想化的皮肤局部给药载体。与普通外用制剂相比，脂质体可以增加药物的治疗指数，减少给药次数及剂量，提高患者的顺应性。因此有必要优化ctg脂质体的制备工艺，并对其理化性质及体外透皮特性进行考察。技术实现要素：针对积雪草总苷脂质体的处方优化问题，本发明在前期工作研究的基础上，通过采用单因素结合box-behnken效应面法优化积雪草总苷脂质体的制备工艺。一种积雪草总苷脂质体，包括卵磷脂、胆固醇、积雪草总苷和超纯水，且卵磷脂与胆固醇的质量比为4-8﹕1；卵磷脂与积雪草总苷的质量比为20-40：1；有机相与水相的体积比为5-7﹕1。进一步的，卵磷脂与胆固醇的质量比4﹕1，卵磷脂与积雪草总苷的质量比23.22﹕1，有机相与水相的体积比7﹕1。一种积雪草总苷脂质体的制备方法，包括以下步骤：s1、按一定比例称取卵磷脂、胆固醇，将卵磷脂、胆固醇溶于氯仿；s2、再加入积雪草总苷的水溶液，冰水浴超声，形成均匀乳剂；s3、将乳剂旋转蒸发至形成凝胶状态，加入适量超纯水溶液；s4、继续旋蒸1小时使胶体脱落，冰水浴超声即得脂质体。进一步的，所述将乳剂旋转蒸发至形成凝胶状态，加入适量超纯水溶液，水化温度为50℃。本发明的有益技术效果为：本发明的积雪草总苷脂质体中羟基积雪草苷、积雪草苷体外12h累计释放率分别为52.10％、45.97％，ctg脂质体2种成分透皮速率较小于原料药溶液，脂质体组表现出明显的缓释性；脂质体组2种有效成分的皮肤滞留量均高于水溶液对照组，提示药物主要集中于皮肤病灶，以贮库的形式产生缓释作用。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为a和b(1)、a和c(2)、b和c(3)的交互作用对y1影响的等高线图(a)及三维效应面图(b)；图2为a和b(1)、a和c(2)、b和c(3)的交互作用对y2影响的等高线图(a)及三维效应面图(b)；图3为ctg脂质体的电镜图(a)、粒径分布(b)和zeta电位(c)；图4羟基积雪草苷(a)、积雪草苷(b)累计释放量q与时间t的曲线；图5为羟基积雪草苷、积雪草苷累积透皮量qn与时间t的曲线；图6为羟基积雪草苷、积雪草苷皮肤滞留量qs与时间t柱状图；其中：a表示卵磷脂-胆固醇的质量比；b表示卵磷脂-ctg的质量比；c表示有机相-水相的体积比；y1积雪草苷的包封率；y2羟基积雪草苷的包封率。具体实施方式为了使本
技术领域：
人员能更好地理解本发明的目的、技术方案和有益效果，下面结合具体实施例和说明附图来进行完整的描述。实施例11、ctg脂质体包封率的测定取ctg脂质体，加入甲醇破乳，0.22μm滤膜过滤，取续滤液测定脂质体的总药物含量w总。采用超滤离心管分离脂质体和游离药物，另取ctg脂质体于超滤离心管内，4000r/min离心20min取外管溶液，测定游离药物的含量w游。按下式计算包封率：y包封率＝(1－w游/w总)×100％2、ctg脂质体制备方法的筛选1)薄膜分散法称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg，氯仿溶解，旋转蒸发至形成均匀脂质薄膜。继续抽真空20min除尽有机溶剂。加入ctg的水溶液振荡水合1h使薄膜脱落。冰水浴超声至形成脂质体混悬液。积雪草、苷羟基积雪草苷的包封率分别为65.50％、56.79％。2)乙醇注入法称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg，无水乙醇溶解，缓慢匀速滴入ctg的水溶液，300r/min恒温搅拌1h，旋蒸除乙醇，冰水浴超声得ctg脂质体。积雪草苷、羟基积雪草苷的包封率分别为61.77％、52.51％。3)逆相蒸发法称取卵磷脂200mg、胆固醇50mg，溶于氯仿，加入ctg的水溶液，冰水浴超声，形成均匀乳剂。旋转蒸发至形成凝胶状态，加入适量水溶液，继续旋蒸1h使胶体脱落。冰水浴超声即得脂质体。积雪草苷、羟基积雪草苷的包封率分别为74.11％、60.05％。以上3种方法以逆相蒸发法制备的脂质体具有较大的水容积，适合于水溶性药物的包封，ctg脂质体的包封率最高。故选择逆相蒸发法用于ctg脂质体的制备。3、ctg脂质体单因素考察1)卵磷脂-胆固醇的质量比固定卵磷脂-ctg的质量比为20﹕1，有机相-水相的体积比为5﹕1，水化介质为2ml超纯水，选取卵磷脂-胆固醇的质量比分别为2﹕1、3﹕1、4﹕1、5﹕1、6﹕1制备脂质体，见表1，结果表明：随着卵磷脂的增加，两种成分的包封率均呈先增大后减小的趋势；当卵磷脂-胆固醇的质量比较小时(2:1、3:1)，在水化阶段，胶体脱落困难，放置过夜脂质体溶液产生絮凝沉淀现象，提示卵磷脂-胆固醇的质量比在4-8﹕1时具有较好的稳定性。表1卵磷脂-胆固醇的质量比对ctg包封率的影响2)卵磷脂-ctg的质量比固定卵磷脂-胆固醇的质量比为4﹕1，有机相-水相的比为5：1，水化介质为2ml超纯水，选取卵磷脂-ctg的质量比分别为1﹕1、5﹕1、10﹕1、20﹕1、40﹕1制备脂质体，见表2，结果表明：卵磷脂-ctg的质量比是影响脂质体包封率的显著因素，过大或过小包封率均较低，其中卵磷脂-ctg的质量比为20﹕1时，脂质体包封率高。表2卵磷脂-ctg的质量比对ctg包封率的影响3)有机相-水相的体积比固定卵磷脂-胆固醇的质量比为4﹕1，卵磷脂-ctg的质量比为20：1，水化介质为2ml超纯水，选取有机相-水相的比为4﹕1、5﹕1、6﹕1、7﹕1、8﹕1制备脂质体，见表3，结果表明：当有机相-水相的体积比在5-7﹕1间时，形成的乳剂较均一，无分层现象，且包封率高。表3有机相-水相的体积比对ctg包封率的影响实施例21、ctg脂质体处方优化的实验数据为进一步优化ctg脂质体处方，在单因素考察的基础上，选取卵磷脂-胆固醇的质量比(a)、卵磷脂-ctg的质量比(b)、有机相-水相的体积比(c)3个显著变量，以积雪草苷、羟基积雪草苷的包封率y1、y2为响应值，采用box-behnken效应面法进行优化设计，通过dseign-expert软件对实验结果进行响应面分析，试验安排及结果见表4，方差分析见表5。表4：响应面分析方案和实验结果表5：方差分析方差来源平方和自由度f值p值方差来源平方和自由度f值p值y1模型988.37919.280.0004y2模型1143.31917.440.0005a294.76151.740.0002a160.38122.020.0022b132.11123.190.0019b217.67129.880.0009c52.9919.30.0186c100.32113.770.0075ab1.5110.270.6222ab1.0410.140.7167ac59.44110.430.0144ac235.93132.390.0007bc138.89124.380.0017bc155.88121.40.0024a23.8310.670.4395a25.2710.720.4231b2285.24150.070.0002b2241.04133.090.0007c28.1411.430.2708c213.0611.790.2224残差39.887残差50.997失拟值24.8832.210.2292失拟值22.5331.060.4604纯误差154纯误差28.4647.122、模型拟合采用design-expert软件对数据进行分析处理，以评价指标y1、y2对自变量进行模型拟合处理，以相关系数(r2)和置信度(p)为拟合模型评价。得二次多项回归方程:y1＝-27.54+11.77a－0.74b+23.46c－0.03ab－1.92ac+0.49bc－0.24a2－0.06b2－1.39c2，y2＝-127.24+23.84a－1.24b－39.91c+0.02ab－3.84ac+0.52bc－0.27a2－0.05b2－1.76c2，拟合方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对相应值的影响程度，系数的正负反映了其影响的方向。由方程可知制备工艺的影响顺序为有机相-水相的体积比＞卵磷脂-胆固醇的质量比＞卵磷脂-ctg的质量比。由拟合结果可知模型相关性系数r2(r12＝0.9612，r22＝0.9573)均大于0.95，说明实测值与预测值间有高度相关性，能够准确地预测实际情况；校正决定系数r2adj(r12adj＝0.9113，r22adj＝0.9073)，说明该实验误差较小，操作可信；模型p值均小于0.01，该模型拟合度较高，极具统计学意义。失拟项p值大于0.05，模型失拟不显著，该回归方程能较好的拟合真实的效应面，可用来反映卵磷脂-胆固醇的质量比、卵磷脂-ctg的质量比、有机相-水相的体积比对脂质体包封率的影响，模型可用于优化ctg脂质体的制备工艺。3、参数预测和工艺优化通过多元回归方程作等高线及三维效应曲面图，预测ctg脂质体的最佳处方配比，结果模型y1见图1、模型y2见图2。从回归系数显著性检验结果可知：在模型y1中：a(p＝0.0002)、b(p＝0.0019)、c2(p＝0.0002)、bc(p＝0.0017)项极显著，c(p＝0.0184)、ac(p＝0.0144)显著，其他项均不显著；模型y2中：a(p＝0.0022)、b(p＝0.0009)、c2(p＝0.0002)、bc(p＝0.0024)、c(p＝0.0075)、ac(p＝0.0007)项极显著，其他项均不显著；由此可知，各因素对响应值的影响并非简单的线性关系，所选因素间存在交互作用。效应面的等高线图和三维效应曲面图可以直观地反应因素间交互作用的强弱及最优条件下各因素的取值。等高线呈椭圆形且较越密集，则表明影响因素对响应值的影响大，交互作用强；响应面3d图越弯曲、陡峭，表明交互作用越明显。模型y1中，ac、bc效应面等高线图呈椭圆形交互作用强，但bc效应面3d图曲面弯曲程度稍大，bc为影响积雪草苷包封率的主要交互因素。模型y2中，ac效应面等高线图呈椭圆形，且3d图曲面坡度陡峭，表明ac对羟基积雪草苷包封率值交互作用最强。design-expert软件优选出最佳脂质体制备处方：卵磷脂-胆固醇的质量比4﹕1，卵磷脂-ctg的质量比23.22﹕1，有机相-水相的体积比7﹕1。实施例31、验证实验的准备按最优制备工艺制备3批ctg脂质体，测定两种成分的包封率，积雪草苷实测平均包封率为84.94％，rsd为1.51％，该成分预测值为87.30％；羟基积雪草苷实测平均包封率为75.85％，rsd为2.26％，预测值为78.67％。各指标的实测值与预测值接近，相对偏差低于3％，表明该模型具有良好的预测性，且工艺稳定可行。2、ctg脂质体形态、粒径和zeta电位测定采用扫描电镜观察ctg脂质体的形态，取脂质体适量，稀释至适当浓度，滴少量于载玻片上，在室温下自然风干，然后真空镀金后，观察其形态。采用激光粒度仪测脂质体平均粒径分布及zeta电位。如图3所示，结果表明脂质体呈类球型，表面圆整，无黏连，其粒径为201.7nm，zeta电位为-15.7mv。3、ctg脂质体体外释放度测定采用《中国药典》2015年版四部溶出度与释放度测定法中第三法(小杯法)进行测定，相关参数：温度37.5℃、转速120r/min、释放介质为脱气的生理盐水100ml。精密移取ctg脂质体混悬液及原料药溶液各6ml分别置于处理好的透析袋内，扎紧并绑于溶出仪搅拌桨上，分别于1、2、3、4、5、6、7、8、10、12h定位吸取溶液2ml(同时补充同温介质2ml)过微孔滤膜后，hplc法进样检测，计算样品各时间点的累计释放量q，并对时间t作图，见图4。结果表明：脂质体中羟基积雪草苷、积雪草苷体外12h累计释放率分别为52.10％、45.97％；有明显的缓释效果，与之相比，游离药物7h内几乎释放完全。实施例41、离体皮肤的制备用8％na2s溶液脱去小鼠腹部的毛发，24h后将小鼠处死，剥离腹部皮肤，用生理盐水洗净，置生理盐水中，于4℃保存。2、体外透皮试验采用franz扩散池法，进行体外透皮试验。将皮肤固定于扩散池供给室与接受室之间，分别精密移取ctg脂质体混悬液、原料药溶液2ml于皮肤表面，接受池加入20％乙醇-生理盐水，排净气泡使真皮一侧与接收液完全接触。水浴温度为32℃，磁力搅拌速度200r/min。分别于4、8、12、16、20、24h，取出接收介质2ml，同时向接受池中补加等量的新鲜接收介质。取出的接收介质经0.22μm微孔滤膜过滤后，测定含量。以qn＝(v总cn+σcn－1v取)/a(qn为累积透皮量，v总为接受池体积，cn为该次取样测定浓度，n表示取样次数；v为每次取样体积，a为渗透面积)计算单位面积累积渗透量。以qn-t作图，见图5，并对透皮吸收速率曲线进行模型拟合，结果积雪草苷、羟基积雪草苷在水溶液中符合零级释药模型。透皮速率拟合方程分别为qn＝28.50t-58.87，r2＝0.995；qn＝16.46t-37.01，r2＝0.983。积雪草苷、羟基积雪草苷脂质体符合higuchi释药模型，透皮速率拟合方程分别为qn＝139.74t1/2-241.2，r2＝0.987；qn＝67.93t1/2-50.34，r2＝0.988。结果表明，ctg脂质体2种成分透皮速率较小于原料药溶液，脂质体组表现出明显的缓释性。3、皮肤滞留量试验取ctg脂质体混悬液、原料药溶液，按上述方法进行透皮实验，分别在4、8、12、16、20、24h取透皮试验给药后的皮肤，轻轻试净表面残留，用打孔器打下半径8mm的圆皮肤片，剪碎，加入生理盐水0.5ml匀浆，加入1.0ml水饱和正丁醇，涡旋5min，13000r/min离心30min，分离有机层，氮气吹干。残渣用0.1ml甲醇溶解，涡旋5min混匀，10000r/min离心15min，取上清液用hplc法检测，计算不同时间单位面积皮肤滞留量qs(qs＝cs×0.1/a；cs为第n个时间点测得的皮肤样品液中药物质量浓度，a为渗透面积)，见图6。结果表明：经24h透皮后，脂质体组羟基积雪草苷、积雪草苷的皮肤滞留量分别为76.0μg/cm2、48.7μg/cm2；水溶液组为34.7μg/cm2、29.3μg/cm2。经24h透皮之后，脂质体组2种有效成分的皮肤滞留量均高于水溶液对照组，提示药物主要集中于皮肤病灶，以贮库的形式产生缓释作用。制备脂质体影响因素很多，前期实验考察了卵磷脂-ctg的质量比、卵磷脂-胆固醇的质量比、有机相的种类及用量、水化介质种类及用量、水化温度等因素对包封率影响，发现脂材在氯仿中溶解效果最好，且形成凝胶的过程中无起泡现象，与水相混匀后超声可形成均一的乳剂，故选择氯仿为有机相；预实验用pbs缓冲液(磷酸缓冲盐溶液)制备脂质体，在水化阶段，凝胶脱落不完全，残留量大，且放置过夜后出现分层现象，故选择超纯水为水化介质；水化温度考察了40℃、50℃、60℃，其中50℃时所需的水化时间短，凝胶易脱落且脂质体稳定性较好，故选择50℃为水化温度。在单因素筛选的基础上对影响较大的卵磷脂-ctg的质量比、胆固醇-卵磷脂的质量比、有机相-水相体积比采用box-behnken效应面法进行优化试验，得到最佳工艺参数，并对最优处方进行验证，相对偏差较小，表明该回归模型可较好地预测ctg脂质体的包封率，结果预测准确，真实可靠。与目前普遍采用的正交和均匀设计优化工艺相比，box-behnken效应面法可连续对试验各水平进行分析，在反映各因素不同程度对制备工艺影响的同时，还直观体现了因素间的交互作用，具有实验精度高、预测性好的优势。在分离游离药物与脂质体的过程中试采用透析法，发现所需时间较长；凝胶柱色谱法，重现性差，洗脱过程中会因为洗脱剂的稀释而出现药物泄露的现象；超滤离心法效果较好，且分离迅速，故采用超滤离心法测定ctg脂质体的包封率。由体外透皮考察结果可知：羟基积雪草苷和积雪草苷的qn-t曲线具有相似性，其原因可能是：两者的化学结构、性质和分子量具有相似性。由图6可知，经皮给药前期，ctg脂质体2种成分的透皮速率较原料药溶液无明显差异，随时间的增加，脂质体透皮速率逐渐降低；皮肤滞留量试验表明脂质体组羟基积雪草苷、积雪草苷的皮肤滞留量分别为76.0μg/cm2、48.7μg/cm2；水溶液组为34.7μg/cm2、29.3μg/cm2，相对提高了1.56和1.17倍。以上所举实施例，对本发明的目的、技术方案和优点进行了进一步的详细说明，所应理解的是，以上所举实施例仅为本发明的优选实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12