一种寨卡病毒小分子抑制剂的制作方法

本发明涉及一种寨卡病毒小分子抑制剂。

背景技术

寨卡病毒病(zikavirusdisease,zvd)是一种由寨卡病毒(zikavirus，zikv)感染所致的急性传染病，主要由蚊媒传播，也可通过母婴传播以及血液和性传播，并且寨卡病毒rna能够在人的精液中长期存在。该病的典型临床表现为急性发热伴皮疹、结膜炎、关节痛、肌肉痛和头痛等。寨卡病毒可以感染并损伤人的神经祖细胞，并对眼睛、大脑、胎盘、睾丸和子宫这些组织中的细胞具有偏好性，而且在多种体液中，如眼泪、唾液、精液、宫颈粘液和尿液等，都可以检测到感染的病毒。寨卡病毒感染还可以引起胎儿脑组织损伤，导致胎儿和新生儿小头症；此外，还能引起神经发育相关疾病，如格林巴利综合症；近年来，研究发现寨卡病毒感染还会引发睾丸损伤，最终导致雄性不育等并发症。寨卡病毒病疫情一旦暴发，就会在全球范围内迅速蔓延。据世界卫生组织(worldhealthorganization,who)网站显示，迄今累计全球80多个国家和地区出现了寨卡病毒感染病例。我国大陆以及台湾地区也在2016年出现了输入性寨卡病毒感染病例。因此，寨卡病毒的持续传播和感染严重威胁着全球人类健康。

遗憾的是，全球目前尚没有可应用于临床的抗寨卡病毒感染的特效药物。

据文献报道，2016年，美国科学家gopalsapparapu和estefaniafernandez等人分离出了能够抑制寨卡病毒毒株活性的人类中和性抗体zikv-117，小鼠模型证实zikv-117能够保护孕鼠，降低孕鼠母体、胎盘及胎儿的寨卡病毒感染。此外，karinstettler和martinabeltramello等人发现了针对寨卡病毒的单克隆抗体zka64，该抗体对感染寨卡病毒的a129小鼠有较好的治疗效果。然而，这些已研究报道的抗体，其安全性和有效性尚待科学研究进一步证实；并且，由于其潜在的ade效应以及较高的获得成本，可能会限制其应用于制备抗寨卡病毒的药物。

因此，研发出寨卡病毒小分子抑制剂，是保障全球人民生命安全与健康的迫切需要。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种寨卡病毒小分子抑制剂。

本发明首先提供了化合物(a)或化合物(b)的应用，为如下(a1)或(a2)：

(a1)制备抑制寨卡病毒的药物；

(a2)抑制寨卡病毒；

所述化合物(a)为y320或其药学上可接受的盐；

所述化合物(b)为y320经结构修饰后的衍生物。

所述抑制寨卡病毒表现为如下(b1)和/或(b2)：

(b1)抑制寨卡病毒ns3蛋白酶的活性；

(b2)抑制寨卡病毒的复制。

本发明还保护一种抑制寨卡病毒的药物或药物组合物，其活性成分为化合物(a)或化合物(b)；

所述化合物(a)为y320或其药学上可接受的盐；

所述化合物(b)为y320经结构修饰后的衍生物。

所述抑制寨卡病毒表现为如下(b1)和/或(b2)：

(b1)抑制寨卡病毒ns3蛋白酶的活性；

(b2)抑制寨卡病毒的复制。

本发明还保护化合物(a)或化合物(b)在制备的药物或药物组合物中的应用；所述药物或药物组合物的功能为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)：(c1)抗寨卡病毒；(c2)治疗寨卡病毒感染；(c3)预防寨卡病毒感染；

所述化合物(a)为y320或其药学上可接受的盐；

所述化合物(b)为y320经结构修饰后的衍生物。

本发明还保护一种药物或药物组合物，其活性成分为化合物(a)或化合物(b)；所述药物或药物组合物的功能为如下(c1)和/或(c2)和/或(c3)：(c1)抗寨卡病毒；(c2)治疗寨卡病毒感染；(c3)预防寨卡病毒感染；

所述化合物(a)为y320或其药学上可接受的盐；

所述化合物(b)为y320经结构修饰后的衍生物。

以上任一所述药物组合物除活性成分外还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。

所述药物组合物除活性成分外还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。

以上任一所述寨卡病毒具体可为寨卡病毒毒株sz_smgc-1。

以上任一所述y320为式(i)所示化合物，其化学式为c27h29cln6o2，分子量为505.01，cas号为288250-47-5。

本发明的发明人经过泛而深入的研究，通过大量筛选，得到一个寨卡病毒小分子抑制剂y320，本发明首次证明该抑制剂能够在不伤害细胞的情况下有效抑制寨卡病毒。本发明对于寨卡病毒的有效防治具有重要意义。

附图说明

图1为y320的化学结构式。

图2为寨卡病毒ns3蛋白酶的抑制剂筛选结果。

图3为y320对寨卡病毒ns3蛋白酶活性的抑制效果。

图4为y320对感染细胞中寨卡病毒复制的抑制效果。

图5为y320对细胞活力的影响。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、寨卡病毒小分子抑制剂的筛选

从商业购买的陶素抑制剂库(targetmol-inhibitorlibrary)中，通过多轮实验筛选，得到若干个候选寨卡病毒小分子抑制剂。将每个候选寨卡病毒小分子抑制剂对寨卡病毒ns3蛋白酶活性的抑制效果分别进行单浓度实验评价，结果如图2所示，筛选得到多个抑制效果较好的小分子抑制剂，其中，本发明所述的小分子抑制剂y320是图2中的36号受试物。

y320的化学结构式如图1所示，其化学式为c27h29cln6o2，分子量为505.01，cas号为288250-47-5。

实施例2、y320的抑制功效评价

一、酶活水平多浓度梯度实验评价y320的抑制功效

将y320用dmso溶解，再用反应缓冲液逐级稀释为不同终浓度(1000μm、500μm、125μm、62.5μm、31.25μm、15.63μm、7.81μm、3.91μm、1.95μm和0.98μm)的待测溶液。

将5nm寨卡病毒ns3蛋白酶(参考文献方法zhang,zhenzhen；li,yan；luo,dahaietal.crystalstructureofunlinkedns2b-ns3proteasefromzikavirus.science2016,354(6319),p.1597-1600.制备获得)与不同浓度的待测溶液混合，37℃孵育20min，然后加入20μm荧光底物(吉尔生化公司，多肽序列：ac-lkkr-amc)，使用反应缓冲液定容至50μl，置于spectramaxm5酶标仪(美国moleculardevices公司)进行检测(仪器参数设置为：激发光波长355nm，发射光波长460nm)，每隔15s检测一次，总共检测10min。每个浓度的待测溶液设置3个重复孔。

反应缓冲液：10mmtris，20％(体积百分比)甘油，1mmchaps，5％(体积百分比)dmso，ph8.5。

数据用graphpad处理，计算出抑制剂的ic50(半数抑制浓度，即酶活反应被抑制一半时对应的抑制剂浓度。)

结果如图3所示。

二、细胞水平抑制寨卡病毒的功效评价实验

1、将y320用dmso溶解，再用dmem培养液稀释为不同终浓度(4μm、2μm、1μm、0.5μm、0.25μm和0.125μm)的待测溶液，待测溶液中dmso的终浓度为0.5％(体积百分含量)。

2、将vero细胞(长春长生生物技术公司)接种于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱孵育过夜24h，待其长至90％-100％密度时，弃掉培养上清，pbs清洗2遍。

3、配置反应体系：在100μldmem培养液中加入3000pfu的寨卡病毒(毒株sz_smgc-1，记载于如下文献：王强等，深圳口岸输入寨卡病毒的基因和生物学特性分析，科学通报，2016,61(22)：p.2461-2474.；公众可以从中国科学院微生物研究所获得)和不同浓度的待测溶液，每个浓度设置3次重复。同时设置采用dmso替代待测溶液的阴性对照组。

4、取步骤2的96孔板，将步骤3配置的体系加至孔内，置于37℃，5％co2培养箱孵育48h后，弃掉培养上清，采用固定液(1体积份甲醇+1体积份乙醇)固定细胞6h，pbs洗2遍，加入100μl含有5％(质量百分含量)脱脂奶粉的pbs，37℃孵育1h。弃之，加入100μl按1:2000稀释的z6抗体(由本实验室从寨卡感染病人体内分离筛选获得，记载于已发表文献qihuiwanget,al.moleculardeterminantsofhumanneutralizingantibodiesisolatedfromapatientinfectedwithzikavirus.sciencetranslationalmedicine.2016,8(369):p.369ra179.)，37℃孵育1h。pbst洗3遍，每次5min，加入100μl按1:2000稀释的辣根酶标记山羊抗人igg二抗(中杉金桥公司，货号：zb-2304)，37℃孵育1h。pbst洗3遍，每次5min，然后加入50μltmb显色液。显色15min后，加入50μl1mh2so4。取受试样品，在khbst-360micro-platereader酶标仪上检测，读取od450数值，数据用graphpad处理，计算出抑制剂的ec50(半数最大效应浓度，即药效实验中能引起50％最大效应时的受试物浓度)。

结果如图4所示。

三、抑制剂对细胞毒性评价实验

1、将y320用dmso溶解，再用dmem培养液稀释为不同终浓度(125μm、62.5μm、31.25μm、15.62μm、7.81μm、3.91μm和1.95μm)的待测溶液，待测溶液中dmso的终浓度为0.5％(体积百分含量)。

2、将vero细胞(长春长生生物技术公司)接种于96孔板中，置于37℃，5％co2培养箱孵育过夜24h，待其长至90％-100％密度时，弃掉培养上清，pbs清洗2遍。

3、配置反应体系：在100μldmem培养液中加入不同浓度的待测溶液，每个浓度设置3次重复。同时设置采用dmso替代待测溶液的阴性对照组，设置采用dmem培养液替代待测溶液的空白对照组。

4、取步骤2的96孔板，将步骤3配置的体系加至孔内，置于37℃，5％co2培养箱孵育48h后，弃掉培养上清，使用pbs洗2遍，加入100μldmem培养液和10μlcck-8试剂(日本同仁公司)，置于37℃，5％co2培养箱里孵育4h，取受试样品，在khbst-360micro-platereader酶标仪上检测，读取od450读数。数据用graphpad处理，计算出抑制剂的cc50(半数细胞毒性浓度，即在细胞毒性实验中导致50％的细胞发生病变时的受试物浓度)。

结果如图5所示。

计算cc50/ec50值。

上述实验的统计结果见表1。

表1

上述实验结果得出，cc50/ec50比值(即选择性指数si)>128，说明y320在不伤害细胞的情况下对寨卡病毒具有抑制作用。