靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用与流程

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。

背景技术

免疫治疗是继手术治疗、治疗和放射治疗后的又一种新型疗法。免疫治疗的作用方式有三种：1)设计单克隆抗体以增强免疫反应进而杀伤癌细胞；2)使用免疫检查点抑制剂来帮助免疫系统识别和攻击肿瘤细胞，如pdl-1、ctal-4等；3)合成疫苗引发免疫反应来治疗和预防肿瘤。与直接用药物杀死肿瘤细胞的化学疗法不同，免疫疗法是通过激活或重建病人免疫系统并改变肿瘤微环境，使机体对肿瘤细胞重新产生识别和杀伤能力的一种治疗方法。这种治疗方法对机体正常细胞不产生损坏作用，却能抑制肿瘤的复发和转移，并且由于记忆功能的存在而具有长期免疫的效果，因此受到了广泛关注。

疫苗是通过模仿机体被侵染的过程来激活免疫细胞应答的。疫苗被注射到机体后，固有免疫细胞表面上的模式识别受体(patternrecognitionreceptors,prrs)与疫苗的病原相关分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns,pamps)在注射部位结合，从而上调趋化因子和细胞因子等一系列免疫反应。注射部位的apc数目随之增加，随后通过对抗原的结合、摄取、处理等过程将抗原信息传递给t细胞。b细胞受到辅助性t细胞的活化后分泌抗体。最终，部分t、b细胞分化为记忆细胞为下次侵染做准备。

一些成功的疫苗如黄热病疫苗(yf-17d)的研究表明，经由多种toll样受体(tolllikereceptors,tlrs)有效地激活dcs并增加促炎因子的分泌可以达到免疫系统的有效应答。tlrs是先天性免疫的主要传感器，可以激活一系列的免疫细胞。根据tlrs位置将其细分为两种类型：细胞膜相关受体(tlrs1,2,4,5和6)，主要识别细菌细胞壁成分和内体相关受体(tlrs3,4,7,8和9)，它们对细菌或病毒核酸特别敏感。已有研究表明使用tlr激动剂作为佐剂能显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递。最近，对疫苗递送的进一步研究表明了通过组合多个tlrs触发不同信号传导途径以激活协同免疫应答的重要性。单磷酰磷脂a(monophosphoryllipida,mpla)(位于细胞膜上和内体上的tlr4激动剂)能够诱导强烈的th1-极化免疫应答，同时能够显著降低lps的毒性100-10,000倍。作为第一个被批准作为佐剂使用的tlr激动剂，mpla已成功用于治疗宫颈癌肝炎和疟疾(rts,)等商业疫苗。咪喹莫特(imiquimod,imq)是tlr7的激动剂，是一种很有前景的dcs激活剂，已被fda批准为免疫调节剂。imq的局部给药在几种皮肤病的治疗中已经显示出了有效性。(imq5％乳膏)已被批准用于治疗浅表性基底细胞癌，光化性角化病和hpv介导的外生殖器和肛周疣。

目前，核酸疫苗、蛋白疫苗、亚单位疫苗等疫苗种类的免疫原性较弱，使得疫苗的应用受到了限制同时也应运而生了佐剂的生成和发展。然而，现在批准的佐剂比如铝佐剂等只能有效激活体液免疫而无法活化细胞免疫应答，使得佐剂难以应用于癌症、乙肝、hiv等疾病。同时佐剂的安全性、与抗原的耐受性、大规模生产和制备以及商业价值等也使得疫苗佐剂很少在商业中使用。然而，游离的tlr激动剂在体内容易快速降解和清除，因此妨碍其作为疫苗佐剂的临床表现。同时，游离状态的蛋白质或肽抗原经常被迅速清除且免疫原性较差，因此只能产生短暂和较弱的免疫应答。

树突状细胞(dcs)是最重要、最有效的apcs，它是摄取和处理抗原，启动免疫反应，调节适应性体液和细胞免疫的关键细胞。自从发现dcs作为免疫启动子以来，针对dcs的抗原纳米粒递送疫苗的研究一直蓬勃发展。在纳米粒设计上，apcs高度表达的甘露糖受体(mannosereceptor,mr)赋予了其dcs特异靶向性。免疫过程中，apcs，尤其是dcs，捕获抗原后迁移至次级淋巴器官(如脾和淋巴结)中，通过主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,mhc)i类和ii类呈递抗原从而激活t、b淋巴细胞以及记忆细胞分化。

聚合物纳米粒(nanoparticles,nps)具有良好的灵活性、多样性，高抗原包封率，可进行抗原提呈细胞(antigenpresentingcell,apcs)靶向修饰，抗原与佐剂共传达以实现最佳免疫应答目的等优点。因此，它是一种非常有前景的疫苗载体。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。

本发明提供一种靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂的制备方法，包括步骤：将两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl、阳离子磷脂dotap、tlr7激动剂、tlr4激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，用氮气吹干残余溶剂后干燥；在干燥后的产物中加入溶剂进行水化，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声形成稳定乳液，将稳定乳液过滤，收集滤液，得到负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液(imq-mplananoparticles,imnps)；将负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合后孵育，得到靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂man-imq-mpla-ova-nps(man-ova-imnps)。

还包括将dspe-peg-nh2溶于有机溶剂的步骤；两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与dspe-peg-nh2的质量比为20mg：(0.2-1)mg；将负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和抗原溶液混合前，还包括步骤：在三乙胺的催化下，将负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和甘露糖水溶液混合后搅拌预设时间；优选地，甘露糖水溶液的质量分数为0.25％；优选地，搅拌的时间为2-4h。

两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与阳离子磷脂dotap的质量比为20mg：(0.5-2)mg；两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与tlr7激动剂的质量比为20mg：(50-200)μg；两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与tlr4激动剂的质量比为20mg：(5-20)μg；优选地，tlr7激动剂为咪喹莫特(imq)和/或咪唑喹啉(r848)，tlr4激动剂为mpla。

有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；干燥为真空干燥，干燥的时间为12-24h。

溶剂为水或pbs溶液，水优选为双蒸水；溶剂的体积和两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的质量的比值为(2-10)ml：20mg；水化的温度为65℃，水化的时间为2-12h，超声的时间为5-35min，过滤采用的是0.45μm滤膜。

抗原溶液中的抗原为模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,ova)，也可以是蛋白质和多肽抗原等，包括乙肝表面抗原(hbsag)、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)、肿瘤相关抗原等；抗原溶液中抗原的浓度为1mg/ml，抗原和两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的质量比为(1-3)mg：20mg；孵育的温度为4℃，孵育的时间为0.5-3h，孵育过程伴随缓慢震荡。

两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的分子量为10000-24000，优选为16000，其中peg亲水链段质量百分数大于45％。

本发明还保护根据上述方法制备得到的靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂。其具有聚合物内核-磷脂磷脂壳层的结构，能够通过杂化纳米粒的疏水性内核有效包载tlr7激动剂imq，通过磷脂层包载tlr4激动剂mpla，通过阳离子磷脂进一步负载抗原并在其表面进行靶向分子的连接。

本发明还保护靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂在制备促进dc细胞活化与成熟药物中的应用。

本发明还保护靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂在制备通过不同途径递送抗原在产生长期的体液和细胞免疫应答的药物中的应用，途径包括但不限于皮下、肌肉、皮内注射等。

本发明还保护靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂在制备免疫后对肿瘤预防药物、抗肿瘤免疫疗法中的应用。

需要说明的是，对聚合物纳米粒表面进行修饰是增强佐剂作用和细胞免疫的有效方法。除了聚合物纳米粒的优点，添加带正电荷的1，2-二油酰基-3-三甲铵基-丙烷(1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane，dotap)构成的阳离子磷脂纳米粒还可用作免疫佐剂以提高细胞和体液应答。由于“储库效应”的存在，阳离子磷脂纳米粒延长了在注射部位的抗原暴露时间，从而起到良好的佐剂作用。同时，甘露糖靶向基团的连接提高树突状细胞对抗原的摄取进而增强t细胞、b细胞免疫应答。

本发明是一种具有生物相容性和可生物降解性、稳定性强、同时可靶向dc细胞并高效负载抗原与2种不同tlr激动剂的新型阳离子磷脂-聚合物杂化纳米疫苗佐剂。该疫苗佐剂在聚合物纳米粒疏水性内核包载tlr7激动剂imq，在磷脂壳层负载tlr4激动剂mpla，并通过阳离子磷脂壳层dotap有效吸附模型抗原卵清蛋白(ovalbumin,ova)，实现抗原与2种不同tlr激动剂的共负载与递送。甘露糖靶向基团的连接可以提高树突状细胞对抗原的摄取进而增强细胞和体液免疫应答。本发明的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米疫苗佐剂可显著地提高体外促dcs成熟效果且能诱导产生更多的抗原特异性cd8⁺t细胞，更强的淋巴细胞活化，更有效地交叉提呈以及更多的记忆性t细胞、抗体、颗粒酶b、ifn-γ同时显著延迟小鼠肿瘤的发展。

本发明提供的技术方案，具有如下的有益效果：

(1)本发明制备的甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂对dc细胞有很好的靶向性，能有效将抗原和配体递送至抗原提呈细胞dc细胞外部和内部并引起显著地免疫反应，增强抗原提呈细胞对抗原的摄取，促进抗原提呈细胞的体外成熟，同时有效地诱导dcs向二级淋巴器官进行迁移，活化t细胞，实现交叉提呈，增强记忆性t细胞和抗体反应，并能有效进行肿瘤预防。

(2)本发明利用具有良好生物相容性和可生物降解性的pcl-b-peg-b-pcl两亲性三嵌段共聚物、阳离子磷脂dotap为制备磷脂-聚合物杂化纳米疫苗佐剂的载体材料，通过薄膜-水化-超声-吸附法制备得到粒径均一、具有明显磷脂壳层、可有效共负载模型抗原ova、2种tlr激动剂(tlr7激动剂imq和tlr4激动剂mpla)并同时连接甘露糖靶向分子的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒作为疫苗佐剂。

(3)本发明制备的甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂imq、mpla的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效保护抗原，将抗原和配体递送至抗原提呈细胞外部和内部并引起显著地免疫反应。皮下注射该疫苗佐剂后，能在注射部位形成抗原贮库，具有良好的佐剂作用。

(4)本发明制备的甘露糖靶向并共负载ova抗原和tlr激动剂imq、mpla的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒为可通过肌肉注射、皮下注射、胸腹腔内注射等方式进行免疫的疫苗佐剂，其可引发细胞及体液免疫，具有良好的免疫保护效果，同时其在体内是完全可生物降解的，降解后不产生对生物有害的物质。

(5)本发明的制备过程中无需使用乳化剂或表面活性剂，克服了传统制备药物缓控释系统需要大量使用乳化剂或表面活性剂的不足，避免了使用试剂而造成的对生物体的毒、副作用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例1制备得到的负载模型抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(ova-imnps)的表征图；

图2为本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)对bmdc细胞的毒性，摄取和促成熟的效果图；

图3为本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)与bmdcs共孵育16h后的激光共聚焦图；

图4为小鼠皮下注射罗丹明标记的ova、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps并观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图；

图5为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫小鼠后脾细胞的cd4⁺cd3⁺、cd8⁺cd3⁺细胞群分布图；

图6为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫小鼠后cd4⁺t细胞活化、cd8⁺t细胞活化、b细胞活化、体内交叉提呈及效应性t细胞激活、ifn-γ细胞因子的分泌和granzymeb的分泌图；

图7为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫后效应性与记忆性t细胞的表达图；

图8为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫后的体液免疫效果图；

图9为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫后动物体内接种e.g7ova肿瘤细胞的预防型肿瘤免疫效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明提供一种靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，包括步骤：

s1：将两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl、阳离子磷脂dotap、tlr7激动剂、tlr4激动剂溶于有机溶剂中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12-24h；其中，两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的分子量为10000-24000，优选为16000，其中peg亲水链段质量百分数大于45％，两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl、阳离子磷脂dotap、tlr7激动剂imq和/或r848、tlr4激动剂mpla的质量比为20mg：(0.5-2)mg：(50-200)μg：(5-20)μg；有机溶剂选自乙腈、二氯甲烷和三氯甲烷中的一种或多种的混合物；

优选地，还包括将dspe-peg-nh2溶于有机溶剂的步骤；两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与dspe-peg-nh2的质量比为20mg：(0.2-1)mg；

s2：在干燥后的产物中加入双蒸水或pbs溶液，65℃水化2-12h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声5-35min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液(imq-mpla-nanoparticles,imnps)；其中，溶剂的体积和两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的质量的比值为(2-10)ml：20mg；

优选地，在三乙胺的催化下，将负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和质量分数为0.25％的甘露糖(α-d-mannopyranosylphenyl)水溶液混合后在室温下磁力搅拌2-4h；

s3：将s2得到的澄清且具有乳光的纳米粒溶液和1mg/ml的抗原溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育0.5-3h，得到靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(imq-mpla-ova-lpnp)；其中，抗原和两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的质量比为(1-3)mg：20mg，抗原选自卵清蛋白、乙肝表面抗原、百日咳蛋白、疟疾重组抗原、人类乳头瘤病毒和肿瘤相关抗原中的一种或多种的混合物。

下面结合具体实施例对本发明提供的技术方案作进一步说明。

实施例1

本实施例提供一种共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，制备方法包括步骤：

s1：将20mg两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与1mg阳离子磷脂dotap、100μgtlr7激动剂imq、10μgtlr4激动剂mpla溶于二氯甲烷中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12h；其中，两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的分子量为16000，其中peg亲水链段质量百分数大于45％。

s2：在干燥后的产物中加入10ml双蒸水，65℃水化5h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声10min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒(imq-mpla-nanoparticles,imnps)溶液。

s3：将s2得到的imnps溶液和1.5ml1mg/ml的ova溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育1h，得到共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，即imq-mpla-ova-lpnps(ova-imnps)疫苗佐剂。

将实施例1制备得到的负载模型抗原的ova-imnps疫苗佐剂用tecnaig2f20透射电子显微镜(tem,fei,usa)和原子力显微镜(afm,multimode8,us)对其表面形貌进行表征。

图1为本发明实施例1制备得到的负载模型抗原的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(ova-imnps)的表征图；其中，图a为man-ova-imnps的结构示意图；图b为imnps的tem图像(scalebar＝0.2μm)，表明其具有明显的内核和磷脂层外壳；图c为ova-imnps的tem图像(scalebar＝0.5μm)，表明ova抗原有效地吸附在磷脂层外壳外部；图d为ova-imnps的afm图像(scalebar＝200nm)，表明其具有明显的内核和磷脂层外壳以及ova抗原的吸附；图e为man-ova-imnps的粒径分布，表明粒径较小且分布均一；图f为ova-imnps的体外释放行为，表明具有一定的缓释效果。

如图1b-d所示，tem图像和afm图像表明其具有明显的内核和磷脂层外壳以及ova抗原的吸附。

将实施例1制备得到的负载模型抗原的ova-imnps疫苗佐剂用zetasizernanozs粒径仪(malvern,uk)测定粒径及其分布。如图1e所示，粒径图表明其粒径较小且分布均一。

用透析袋法研究ova释放。将实施例1制备得到的负载模型抗原的ova-imnps疫苗佐剂装入透析袋(mwco300kda)中，在37℃、ph7.4的pbs缓冲溶液中持续震荡3天。在时间点0.5、1、2、4、6、8、18、24、48、72h分别取出透析液，加入新鲜的pbs缓冲溶液并使用pierce^tmbca蛋白检测试剂盒测量透析液的蛋白含量。如图1f所示，表明其具有一定的缓释ova效果。

实施例2

本实施例提供一种甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂(tlr4激动剂mpla、tlr7激动剂imq和抗原ova)的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，制备方法包括步骤：

s1：将20mg两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl与1mg阳离子磷脂dotap、100μgtlr7激动剂imq、10μgtlr4激动剂mpla、0.4mgdspe-peg-nh2溶于二氯甲烷中，然后旋转蒸发除去有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀的薄膜，用氮气吹干残余溶剂，再放入真空干燥箱内，真空干燥12h；其中，两亲性三嵌段共聚物pcl-b-peg-b-pcl的分子量为16000，其中peg亲水链段质量百分数大于45％。

s2：在干燥后的产物中加入10ml双蒸水，65℃水化5h，震荡混匀，然后在冰浴条件下超声10min形成稳定乳液，将稳定乳液采用0.45μm滤膜过滤，收集滤液，得到负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒(imq-mpla-nanoparticles,imnps)溶液；

在三乙胺的催化下，将负载tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒溶液和质量分数为0.25％的甘露糖(α-d-mannopyranosylphenyl)水溶液混合后在室温下磁力搅拌2h。

s3：将s2得到的溶液和1.5ml1mg/ml的ova溶液混合后，4℃缓慢震荡孵育1h，得到甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂，即man-ova-imnps疫苗佐剂。

实施例3

将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)进行促bmdcs成熟及其细胞毒性试验。下述试验中的ova-imnps是实施例1制备得到。

将未成熟的bmdcs用游离ova-agonists、ova-imnps或man-ova-imnps疫苗佐剂刺激24小时。随后，收集bmdcs并在4℃下用100μl稀释了的cy5.5-anti-mousecd11c与pe-anti-mousecd40、fitc-anti-mousecd86、apc-anti-mousecd80共孵育30min。使用流式细胞仪(facs,bdfacscalibur,us)检测cd11c⁺bmdcs细胞上的cd40、cd86、cd80表达。

使用mts试剂(mts，promega，madison，wi)检测游离ova-agonists或含ova的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂共孵育后的bmdcs活力。将培养至第六天的未成熟bmdcs细胞离心(450g，5min)后均匀铺至96孔板，并设置阴性对照组和空白对照组。两小时细胞沉降后，分别将细胞与具有各种纳米颗粒浓度的载ova的imnps在37℃、5％co2浓度的培养箱中共孵育48h。450g离心5min后弃去上清，每孔分别加入20μlmts试剂和100μl新鲜培养基并在37℃继续培养1-4h。最后，通过thermovarioskanflash3001型多功能全波长酶标仪(thermovarioskanflash3001,thermo,finland)在490nm波长测量每孔吸光度。通过下列公式计算bmdcs的细胞存活率并绘制细胞存活率曲线。

图2为本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)对bmdc细胞的毒性，摄取和促成熟的效果图。图a为通过光散射性质和cd11c荧光信号用来区分总细胞群和dc细胞群，表明提取的dc细胞占总细胞比例达到79.3％，用这种提取方法进行细胞实验具有一定的准确性和可信性；图b为采用mtt法进行细胞毒性分析；图c为采用流式细胞术定量分析bmdcs中fitc标记的ova荧光强度；图d-f为bmdcs与游离ova-agonists、ova-imnps和man-ova-imnps共孵育后其表面分子cd86(d)、cd80(e)、cd40(f)的表达。表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂无细胞毒性、能有效促进体外bmdcs成熟及对抗原的摄取。

如图2d-f所示，载ova纳米粒比游离ova-agonists均显著上调了bmdcs表面cd86、cd80、cd40分子的表达。游离ova-agonists进入细胞后经快速代谢只能略微提高共刺激因子的表达。相反，man-ova-imnps由于靶向甘露糖的存在具有最大bmdcs促成熟能力和上调cd86、cd80、cd40表达的能力。图2b表明ova-imnps和man-ova-imnps在与bmdc孵育后细胞存活率约为90％，且不受ova浓度影响，表明制备得到的阳离子脂质纳米疫苗和甘露糖靶向阳离子脂质纳米疫苗具有良好的生物相容性。

实施例4

将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)进行细胞摄取及溶酶体逃逸试验。下述试验中的ova-imnps是实施例1制备得到。

将未成熟的bmdcs与fitc标记的卵清蛋白(ova-fitc)或载ova-fitc的imnps纳米制剂(等量的ova浓度：10μg/ml)在37℃下培养2h。然后用pbs缓冲液(10mm，ph7.4)洗涤细胞两次小心收集细胞悬液并离心(450g，5min)。用稀释了的cy5.5-anti-mousecd11c抗体特异性鉴定dcs细胞群，抗体重悬细胞后在4℃静置30min。离心(450g，5min)，500μlpbs溶液重悬。使用bdfacscalibur流式细胞仪检测门内cd11c⁺细胞上的cd11c⁺fitc-ova⁺细胞的百分比并使用flowjo软件(版本7.6)进行分析。为了进一步确定抗原被细胞吞噬后的位置，将未成熟的bmdcs与游离或imnps包载的ova-fitc在37℃下培养16h。然后，用pbs溶液轻柔洗涤细胞三次并用溶酶体红色荧光探针染色液lysotrackerreddnd-99(invitrogen，ca，usa)在37℃共孵育2h。再用冰冷的pbs溶液轻柔洗涤细胞，加入1ml免疫染色固定液室温下固定20min。细胞核用dapi标记5min并用pbs溶液轻柔洗涤细胞后，使用激光共聚焦扫描显微镜(zeisslsm710,carlzeissmeditecag)记录荧光图像。

图3为本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)与bmdcs共孵育16h后的激光共聚焦图；其中，绿色为用fitc标记的抗原，红色为用lysotrackerreddnd-99染色的溶酶体，蓝色为用dapi染色的细胞核。表明bmdcs对游离ova-agonists的吞噬量较少，且无溶酶体逃逸现象；载ova的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒能有效促进bmdcs对抗原的吞噬，并促进溶酶体逃逸。甘露糖靶向分子的连接更是将这一优势显著提高。

共聚焦图像表明bmdcs摄取的fitc-ova-nps比fitc-ova-agonists更多(图3)。更重要的是，man-ova-imnps的荧光标记抗原ova更多的在bmdcs细胞质中发现，表明有效地促进溶酶体逃逸。而被bmdcs摄取的fitc-ova-imnps只有较少部分发生溶酶体逃逸，更多地荧光信号与溶酶体荧光重叠。然而，被bmdcs摄取的fitc-ova-agonists荧光信号基本上都与溶酶体共定位，说明难以发生溶酶体逃逸。溶酶体是抗原加工和提呈的关键细胞器，外源性抗原只有在溶酶体逃逸后才能呈递给mhci分子并激活cd8⁺t细胞以引发强烈的ctl反应。流式细胞仪结果显示fitc-ova-imnps与fitc-ova-agonists相比显著增加ova抗原的摄取至4-5倍。同时，man-fitc-ova-imnps由于靶向配体的作用，bmdcs对其摄取更是增加了2-3倍(图2c)。体外细胞摄取结果表明man-fitc-ova-imnps能有效促进bmdcs对于载抗原纳米粒的摄取并完成溶酶体逃逸，为激活cd8⁺t细胞引发的ctl反应提供了可能。

实施例5

将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)进行体内追踪试验。下述试验中的ova-imnps是实施例1制备得到。

为了实时可视化不同纳米粒体内注射后的行为，ova-罗丹明代替ova包裹在靶向和非靶向纳米粒。在小鼠注射部位和两侧腹股沟引流淋巴结处实时观测纳米粒荧光强度的淋巴结迁移。使用crimaestro成像系统(cri，ma，usa)定量检测皮下注射后不同时间点0.5、3、6、9、24、48、96、144、216、336h注射部位的荧光强度来表示疫苗动力学。注射后24h，分离腹股沟淋巴结进行离体荧光成像。获得的图像由crimaestro分析软件进行分析。荧光信号由每个时间点的荧光强度值与最大值的百分比表示。

图4为小鼠皮下注射罗丹明标记的ova、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps并观察注射部位的抗原储库效应和向引流淋巴结的迁移图；其中，图a为man-ova-rhodamine-imnps注射24h后引流至淋巴结的图像；图b为离体淋巴结的成像。表明甘露糖配体的连接能有效地促进外周dc细胞迁移至次级淋巴结处从而引发强烈的免疫反应；图c-d为注射部位ova抗原的定量荧光强度分析。游离ova-agonists皮下注射后，注射部位荧光信号迅速下降；而注射ova-imnps336h后也可以在注射部位检测到强烈的荧光信号，表明其具有良好的储存效应；注射man-ova-imnps后，由于man-ova-imnps快速递送至次级淋巴结处使得其荧光信号强度在注射部位较低。图e-h为免疫小鼠7天后次级淋巴结处dc细胞表面分子cd40(e)、cd86(f)、mhci(g)、mhcii(h)的表达，表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效促进体内dc细胞的成熟。

淋巴结是免疫细胞聚集和引发免疫的部位。因此，检测纳米粒迁移到引流淋巴结并诱导免疫应答的能力是有必要的。为了清楚区分注射部位和淋巴结荧光信号，我们选择在特异性引流至腹股沟淋巴结的尾巴根注射罗丹明荧光标记的纳米粒。man-rhodamine-ova-imnps在注射6h后即在腹股沟淋巴结发现荧光信号，而rhodamine-ova-imnlps、rhodamine-ova-agonists分别在注射9h和24h后才在腹股沟淋巴结发现荧光信号。图4a为皮下注射后24h引流到腹股沟淋巴结的man-rhodamine-ova-imnps图像，表明其可有效地将抗原递送至淋巴结。9d后，当难以监测到体内腹股沟淋巴结上的荧光信号时，取出引流淋巴结成像。可以看到，各淋巴结荧光信号强弱结果与体外结果一致，man-rhodamine-ova-imnps在腹股沟引流淋巴结上的荧光强度高于rhodamine-ova-imnps并远高于rhodamine-ova-agonists(图4b)。以上结果表明，载ova纳米粒比游离ova-agonists具有更强的从外周组织迁移到淋巴细胞引发免疫反应的腹股沟淋巴结的能力。而man-rhodamine-ova-imnps在这个方面更是有着较好的优势。图4c-d为注射部位不同剂型的代谢情况。大部分的游离ova-agonists荧光信号迅速代谢在24h内消失，rhodamine-ova-imnps由于储库效应的存在更多的保留在注射部位直至336h(第14天)。而man-rhodamine-ova-imnps也快速迁移至腹股沟淋巴结，注射部位荧光信号在144h，即第六天后消失。

实施例6

将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)进行体内促成熟效果试验。下述试验中的ova-imnps是实施例1制备得到。

将6至8周龄的雌性c57bl/6小鼠随机分成4组，并皮下注射相同体积和ova相同剂量(每只小鼠25μg)的游离ova-agonists、ova-imnps、man-ova-imnps。7天后，分离腹股沟淋巴结并研磨成细胞悬液，离心(450g，5min)后分别与cy5.5-anti-mousecd11c,pe-anti-mousecd40,fitc-anti-mousecd86,apc-anti-mousemhcclassi,fitc-anti-mousemhcclassii(ebiosciences,ca,usa)在4℃共孵育30min。pbs溶液重悬后，通过流式细胞仪facs评估dcs表面标记的表达。

图4e-h为不同剂型处理后淋巴结内dc细胞群cd40、cd86、mhci类、mhcii类表面分子的表达。可以看到，cd40、cd86结果与体外结果一致。同时man-ova-imnps刺激后的小鼠也是高表达mhci类、mhcii类分子，显示出了诱导dc成熟的优势。

实施例7

将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)进行体内免疫效果试验。下述试验中的ova-imnps是实施例1制备得到。

将6至8周龄的雌性c57bl/6小鼠随机分成4组，并皮下注射100μl的游离ova-agonists、ova-imnps、man-ova-imnps和pbs。每组注射相同剂量的抗原ova，即每只小鼠25μg。14天后，皮下注射相同剂量的ova(25μg/只)加强免疫效果。免疫21天后，脱颈处死小鼠并将脾脏研磨后收集。将脾细胞加入至六孔板中放置于37℃培养箱培养并通过50μg/ml的游离ova溶液体外再刺激。72h后，离心(450g，5min)，收集上清液，用elisa试剂盒定量分析细胞因子ifn-γ和颗粒酶b的分泌。离心收集到的脾细胞与荧光抗体cd3,cd4,cd8,cd19,cd69,siinfekl-mhci,cd44,cd62l共孵育30min，并通过流式细胞仪检测阳性分子的表达。在免疫后7、14、21天后分别通过眼眦取血的方法收集血液，4℃放置过夜后离心(3000rpm，10min)。收集上清，放置于-80℃等待检测。通过elisa试剂盒测定ova特异性igg和igg同种型(igg1和igg2a)的分泌。

图5为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫小鼠后脾细胞的cd4⁺cd3⁺、cd8⁺cd3⁺细胞群分布图；表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效促进cd4⁺和cd8⁺细胞活化。

图5结果显示man-ova-imnps能够引起th和ctl细胞的有效增殖。以th(cd3⁺cd4⁺)细胞为例，man-ova-imnps处理后的小鼠脾细胞中双阳性细胞占总细胞的百分比达到35.5％，而pbs组仅为20.5％，游离ova-agonists、ova-imnps组分别为28.0％、31.2％(图5a)。同时，与pbs、游离ova-agonists、ova-imnps组相比，man-ova-imnps将ctl细胞百分比提高至24.0％，而另三组分别为13.8％、18.8％、19.6％(图5b)。通过检测t淋巴细胞的激活证实了甘露糖靶向的阳离子纳米疫苗在提高免疫应答的优势。

图6为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫小鼠后cd4⁺t细胞活化、cd8⁺t细胞活化、b细胞活化、体内交叉提呈及效应性t细胞激活、ifn-γ细胞因子的分泌和granzymeb的分泌图；其中，(a)cd4⁺t细胞活化；(b)cd8⁺t细胞活化；(c)b细胞活化；(d)体内交叉提呈及效应性t细胞激活；(e)ifn-γ细胞因子的分泌；(f)granzymeb的分泌。图6表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效促进淋巴细胞、效应性t细胞的激活和细胞因子的分泌。

通过检测cd69，一种t淋巴细胞和b淋巴细胞早期活化的表面标志物以评估效应免疫细胞的活化。man-ova-imnps显著增强了cd8⁺t细胞的活化至25.94％，分别是pbs、游离ova-agonists、ova-imnps组的4.95、1.85、1.40倍(图6b)。同时man-ova-imnps免疫后的cd4⁺t细胞和b细胞的活化也显著高于ova-imnps和游离ova-agonists(图6a，c)，证明了man-ova-imnps制剂能显著激活效应免疫细胞的反应。

siinfekl-mhci(h-2kb)五聚体能标记出与特异性交叉提呈肽段siinfekl结合的cd8⁺t细胞，这部分cd8+t细胞可发挥出强烈的ctl效应。facs数据为免疫后小鼠脾细胞中siinfekl-mhci⁺cd8⁺与总cd8⁺t细胞百分比。结果显示，与pbs(24.32％)、游离ova-agonists(31.23％)、ova-imnps(58.57％)组相比，man-ova-imnps诱导了最强的抗原特异性cd8⁺t细胞比例为79.41％。这表明与游离药物相比，纳米粒包裹的抗原和佐剂能有效诱导抗原特异性cd8⁺t细胞的应答，且man-ova-imnps具有显著地诱导交叉提呈能力和最强的抗原特异性cd8⁺t细胞刺激能力(图6d)。

此外，本发明进一步分析了脾细胞体外刺激72h后上清液中细胞因子的分泌。图6e、f显示，与游离ova-agonists、pbs组相比，纳米粒子ova-imnps和man-ova-imnps组分泌的颗粒酶b以及ifn-γ显著增加。特别的是，man-ova-imnps组的颗粒酶b分别比pbs、游离ova-agonists、ova-imnps组提高了5.65、3.98、2.59倍。上清中细胞因子的检测表明了t细胞从初始cd8⁺t细胞分化成ctl细胞并分泌颗粒酶b进而杀伤受侵染的细胞。同时初始cd4⁺th0细胞也成功分化成cd4⁺th1细胞并分泌ifn-γ因子进而对抗胞内病原体感染。

图7为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫后效应性与记忆性t细胞的表达图；其中，图(a)和(b)为效应(cd44^hicd62l^low)和中央(cd44^hicd62l^hi)记忆cd4⁺t细胞中的比例；图(c)和(d)为效应(cd44^hicd62l^low)和中央(cd44^hicd62l^hi)记忆cd8⁺t细胞中的比例；图e为每组记忆性t细胞平均值的代表图。表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效促进记忆性t细胞免疫应答。

一般而言，再次感染时，初次感染后产生的记忆性t细胞会迅速引发一系列的免疫应答。记忆t细胞分为两类：cd44^hicd62l^low的效应记忆性t细胞(tem)、cd44^hicd62l^hi的中央记忆性t细胞(tcm)。tem引发即时效应t细胞，而tcm对机体提供长期保护。因此我们评估了两次免疫后的小鼠脾细胞cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞的tem、tcm表达。含ova的免疫制剂都提高了tem在cd4⁺,cd8⁺t的百分比，并且man-ova-imnps比ova-imnps和游离ova-agonists有着更强的优势。tcm，一种起到长期保护作用的细胞，和tem有着相同的组间趋势(图7)。总之，man-ova-imnps可以引起有效的记忆t细胞免疫应答，并在再次感染时对机体提供有力的保护。

图8为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫后的体液免疫效果图；其中，图a为初次免疫14、21d后抗原特异性igg滴度；图b为由igg2a/igg1比值检测th1极化。表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效增加抗体产生并促进th1极化。

进一步，对免疫小鼠的血清中抗原特异性igg进行了测定以评价甘露糖靶向阳离子磷脂-聚合物杂化纳米疫苗佐剂对体液免疫的影响。在一免后7、14、21天分别通过elisa测量了ova纳米粒疫苗和游离ova-agonists诱导的抗体应答。一免后第7天，所有样品组的滴度值均在检测下限。随着时间的延长，14天后，除pbs组外所有含ova制剂igg滴度均显著增加。由于强大的佐剂和靶向作用，man-ova-imnps组的igg滴度增高至3.31(log10)。ova-imnps组的igg滴度也增加至2.30，游离ova-agonists几乎低于检测下限。21天后，也就是二次免疫后的第7天，含ova制剂的igg滴度有了再一步地有效提高。man-ova-imnps(3.90)相对于游离ova-agonists(2.75)、ova-imnps(3.70)仍然存在着较大优势(图8a)。pbs组滴度值未能检测到。th细胞是igg亚型的重要调节剂。一般来说，igg1是由th2细胞引导的，igg2a主要由th1细胞引导的。我们通过elisa试剂盒评估了igg2a与igg1的比值(igg2a/igg1)来表示th1的极化。图8b表示man-ova-imnps具有最大诱导th1极化的能力。将抗原和佐剂共组装和递送后也可显著提高th1极化。因此，man-ova-imnps不仅能够增加抗体的产生，也可以促进th1极化。

实施例8

将本发明实施例2制备得到的甘露糖靶向共载抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂(man-ova-imnps)进行肿瘤预防效果试验。下述试验中的ova-imnps是实施例1制备得到。

图9为小鼠在第0天和第14天分别用游离ova-agonists、本发明实施例1制备得到的ova-imnps或本发明实施例2制备得到的man-ova-imnps免疫后动物体内接种e.g7ova肿瘤细胞的预防型肿瘤免疫效果图；其中，图a为免疫方案；图b为接种e.g7ova后每组小鼠的单独肿瘤生长曲线；图c为无肿瘤小鼠的百分比；图d为荷瘤小鼠的存活率。表明甘露糖靶向并载ova抗原和tlr激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂能有效预防肿瘤的生成并抑制肿瘤的生长。

为了评估甘露糖靶向载ova抗原并载imq、mpla佐剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米疫苗的预防效果，用脂质聚合物纳米疫苗以两周一次的频率免疫c57bl/6小鼠两次。第二次接种后7天，将e.g7ova肿瘤细胞接种至小鼠皮下，使用电子游标卡尺实时监测肿瘤生长。图9a为免疫方案。图9b显示接种e.g7ova后，所有对照组小鼠(注射无菌pbs溶液)均在第5天出现肿瘤，游离ova-agonists组延迟至7天。然而，man-ova-imnps组在第41天仍有16.7％的小鼠没有出现肿瘤。令人欣喜的是，这部分小鼠观测至第100天仍没有肿瘤的出现(图9c)。与pbs组和游离ova-agonists组相比，用ova-imnps和man-ova-imnps提前免疫后的小鼠的肿瘤生长得到了显著抑制(图9b)。最后，游离ova-agonists组和pbs组的小鼠均在接种肿瘤细胞25天后死亡，而ova-imnps组延迟至38天。41天后，用man-ova-imnps免疫后小鼠的存活率高达66.7％(图9d)。说明man-ova-imnps能有效诱导抗原特异性记忆细胞免疫应答并防止疾病的再次感染。因此，将抗原和佐剂共包载于纳米粒中并连接靶向分子是一个有前景的疫苗设计策略。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。