吡啶硫酮盐在避孕药物中的应用及其制备的避孕药物的制作方法

本发明涉及生物化学
技术领域：
，更具体地说是涉及一种吡啶硫酮盐在避孕药物中的应用及其制备的避孕药物。
背景技术：
：意外怀孕会对女性的心理、生理造成严重的不良影响，并伴随着生殖健康风险的增加。外用避孕药是女性自主使用的阴道用避孕药，在阴道内将精子杀死或使精子失去活动能力从而达到避孕的目的。因其具有有效、可逆，使用方便，兼具有预防性传播感染等优势，非激素类外用避孕药物在青少年、未婚人群和性传播感染高危人群中的需求越来越大。目前的杀精剂如：壬苯醇醚、辛苯醇醚和苯扎氯铵等，通过降低精子表面张力，导致精子质膜破裂，而起到快速杀灭精子的目的。但是这些杀精剂具有明显的细胞毒性，可造成阴道粘膜上皮细胞损伤，引起阴道溃疡等严重的局部毒性作用，对人体造成不可逆的伤害；吡啶硫酮(也称为1羟基-2-吡啶硫酮；2-吡啶硫醇-1-氧化物；2-巯基吡啶-n-氧化物和吡啶硫酮-n-氧化物)的多价金属盐是一种亲脂性弱螯合剂，可通过氧硫中心螯合金属离子。作为高效的离子载体，吡啶硫酮盐在中性或酸性条件下将k+带出细胞，h+带入细胞；在碱性条件下将k+或mg2+带出、na+带入细胞。胞内离子平衡被打破，酶的活性被抑制，并影响细胞新陈代谢，从而导致细胞死亡。吡啶硫酮盐可升高细胞内金属离子水平，破坏铁硫蛋白簇，有效抑制细菌以及霉菌的生长，并广泛用作杀真菌剂和杀菌剂。吡啶硫酮盐还可以kcnq钾离子通道相关蛋白结合，增大通道开放概率，导致m电流异常。另有报道，吡啶硫酮盐对病毒的复制具有抑制作用，目前尚未见关于吡啶硫酮盐抗生育作用的相关报道。因此，如何提供一种吡啶硫酮盐在避孕药物中的应用及其制备的避孕药物是本领域技术人员亟需解决的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种避孕药物，利用吡啶硫酮盐作为主要杀精成分，吡啶硫酮盐能以较低的浓度快速杀灭精子，对阴道粘膜上皮细胞的刺激性较低，安全性高，并且具有一定的抗菌作用。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种吡啶硫酮盐在避孕药物中的应用。一种杀精避孕药物，所述药物包括如式i或如式ii所示的吡啶硫酮盐；其中式i所示化合物中r1代表钠；r2代表锌或铜。可选的，所述吡啶硫酮盐包括吡啶硫酮钠、吡啶硫酮锌或吡啶硫酮铜中的一种或多种。可选的，所述药物的剂型包括：栓剂、膜剂、凝胶剂、乳膏剂、泡腾片剂或缓释剂。本发明药物的使用方法为：本品制剂通常装入单次施放器中，在性生活前使用，将施放器前端插入阴道深处，推入全部组分后，抽出施放器即可进行性生活。在性生活后再次使用可以获得更有效的避孕保护。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种杀精避孕药物及吡啶硫酮盐在杀精避孕药物中的应用，达到的技术效果是：1)首次发现吡啶硫酮盐可用于阴道杀精避孕药物，是避孕药物研究中的新发现；2)吡啶硫酮盐用于阴道杀精避孕有效剂量低，而且能保证用药安全。3)吡啶硫酮盐可以显著抑制人精子运动，且对阴道粘膜上皮细胞毒性较低。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为吡啶硫酮锌对精子活性的抑制作用；图2附图为吡啶硫酮锌对阴道上皮细胞vk2的细胞毒性；图3附图为吡啶硫酮锌对阴道上皮细胞vk2的细胞膜损伤。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1验证吡啶硫酮锌对精子运动的抑制作用本发明中的吡啶硫酮锌购自sigma公司，分子式是c10h8n2o2s2zn，分子量为317.70，cas登录号为13463-41-7。实验方法为：人类精子样本来源于自愿的已生育男性捐赠者，禁欲3-7天，自慰法采集精液至精液收集皿中，37℃静置30min待其完全液化备用；参照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》中精子上游法筛选出高活力精子；用ebss(1％bsa)将高活力精子样本调整至适当密度，37℃培养箱孵育。将吡啶硫酮锌溶于dmso制成50mmol/l储备液，将吡啶硫酮锌储备液用ebss依次稀释至10、30、50、70和90μmol/l；将等量的精子上游液分别与不同浓度的吡啶硫酮锌储备液混合均匀，吸取3μl，加到提前预温37℃的精子计数板样品槽中进行casa分析。记录精子的活率和运动参数值：总活动率(totalmotility，tm)，前向运动率(progressivemotility，pm)，平均路径速率(velocityofaveragepathway，vap)，直线运动速率(straightlinevelocity，vsl)，曲线运动速率(curvilinearvelocity，vcl)；计算20sec制动精子的最低有效浓度(minimumeffectiveconcentration，mec)和半数有效浓度(medianeffectiveconcentration，ec50)。实验结果参见图1，结果显示，当暴露时间为20sec时，随着吡啶硫酮锌浓度升高tm、pm、vap、vsl和vcl均呈现降低趋势，表明精子运动活力和运动速度受到明显抑制，且呈现剂量依赖效应。此时，吡啶硫酮锌对人类精子的100％抑精浓度(mec)值为45μmol/l，50％抑精浓度(ec50)值为16.58μmol/l。提示吡啶硫酮锌具有较强的抑制人精子运动的作用，在>45μmol/l浓度时可以使精子完全失去活动能力，从而抑制精子和卵子的结合，起到避孕的作用。实施例2精子复动试验实验方法将人精子暴露于50μmol/l吡啶硫酮锌储备液中，ebss洗涤2次，重悬后置于37℃培养箱孵育30min。相差显微镜下观察制动后精子活动的恢复和形态变化。制动后的精子出现振荡运动既被认为复动。实验结果吡啶硫酮锌制动后的精子经ebss洗涤后，精子培养基孵育30min后不能恢复其活力。提示吡啶硫酮锌具有较强的抑制人精子运动的作用，且该作用不可逆。实施例3吡啶硫酮锌对家兔的抗生育作用实验方法将50mmol/l的吡啶硫酮锌储备液加入凝胶(12-20wt％聚氧乙烯聚氧丙烯聚合物、0.5-10wt％聚二甲基硅氧烷、1.0-2.5wt％酸性缓冲剂和甘油)混匀，制成透明均一的150μmol/l吡啶硫酮锌凝胶。将18只性成熟日本大耳兔雌兔分为3组，第1组为对照组给予空白凝胶基质，第2组给予2.5ml吡啶硫酮锌凝胶，第3组给予2.5ml、40mg/mln-9凝胶，10min后与有生育能力的雄兔1：1交配，经阴道涂片检查到死精或活精子视为交配成功。妊娠20天后，耳缘静脉注入空气将雌兔处死，解剖后检查妊娠结果。表1吡啶硫酮锌凝胶对家兔的抗生育作用组别n妊娠数妊娠率对照组66100％吡啶硫酮锌凝胶600n-9凝胶600实验结果显示，对照组家兔妊娠率为100％，吡啶硫酮锌凝胶组家兔未妊娠，n-9凝胶组家兔妊娠率为0，提示吡啶硫酮锌凝胶较n-9凝胶具有良好的抗生育作用，且吡啶硫酮锌凝胶抗生育作用明显。实施例4吡啶硫酮锌对阴道粘膜上皮vk2/e6e7细胞的细胞毒性实验方法取对数生长期的vk2/e6e7细胞接种于96孔培养板中，0.5-1×104细胞/孔，置于co2细胞培养箱37℃预培养过夜；每孔分别加入不同浓度吡啶硫酮锌溶液，使其终浓度分别为15、25、35、45、55、65和75μmol/l，以definedkeratinocyte-sfm(购自上海北诺生物科技有限公司)为空白对照，以壬苯醇醚溶液为现有市售药物对照。作用4小时后，各孔更换新鲜培养基，并加入10μl、浓度为5mg/mlmtt溶液置于co2细胞培养箱37℃继续培养4小时；去除培养液，每孔加入100μldmso溶液将细胞裂解，用酶标仪测定各孔在570nm波长处的光密度值，计算细胞活力：实验结果参见图2，结果显示，不同浓度的吡啶硫酮锌作用4h后，其对vk2/e6e7细胞活力的抑制率分别为8.63％、9.78％、11.08％、15.18％、17.32％、18.32％和20.97％，其细胞半数致死量cc50为147.32μmol/l，选择指数ti(cc50/ec50)>8。现有药物壬苯醇醚在100％抑制精子运动的浓度下，对vk2/e6e7细胞活力的抑制率可达80％。提示吡啶硫酮锌对人类阴道上皮细胞毒性小，具有研发成为阴道内杀精避孕药物的潜力。实施例5吡啶硫酮锌对阴道粘膜上皮vk2/e6e7细胞质膜的损伤实验方法取对数生长期的vk2/e6e7细胞接种于24孔培养板中，0.5-1×105细胞/孔，置于co2细胞培养箱37℃预培养过夜；每孔分别加入不同浓度吡啶硫酮锌储备液，使其终浓度分别为5、15、25、35和45μmol/l，以definedkeratinocyte-sfm为空白对照。作用4小时后，加入sybr-14和pi各2.5μl，并使其终浓度分别达到100nm和12nm，混匀后将混合液放在37℃，5％co2培养箱中孵育20min，在荧光显微镜下观察。实验结果参见图3，对照组vk2/e6e7细胞因质膜保持完整，pi不能通过完整的细胞膜，sybr-14可使细胞呈绿色荧光；吡啶硫酮锌处理组绝大部分细胞呈绿色荧光，仅个别细胞因质膜被破坏，pi进入细胞内与dna结合而呈红色荧光。可见，吡啶硫酮锌对阴道粘膜上皮vk2/e6e7细胞质膜的损伤比较轻微。而n-9处理组只呈现细胞核结构的红色荧光，表明细胞膜损伤严重，细胞结构不完整。总结：当吡啶硫酮铜在完全抑制精子运动的浓度下，可基本保持精子质膜的完整性，不会引起精子质膜的损伤，提示其灭活精子的机制并非破坏精子质膜，而是可能通过影响精子线粒体功能或离子通道而起到抑制精子运动的作用。而市售杀精子剂壬苯醇醚n-9的灭活精子的机制主要是破坏精子质膜，该机制可导致其对阴道粘膜损伤的副作用。因此运用吡啶硫酮铜制备阴道内杀精避孕药物时，其副作用可望小于目前市售的以n-9为活性成分的阴道内杀精子剂。本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。当前第1页12