本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法。
背景技术：
肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年攀升，早期诊断及早治疗是改善患者预后的关键，但是肺癌患者在病变早期往往无明显症状，就诊时大多为中晚期，丧失了治疗的最佳时机。因此从肺癌发生的“起源”着手，探寻高效、特异的早期诊断及治疗的新方法，将会对肺癌的预防、诊断及治疗产生深远的影响。
肿瘤干细胞理论认为在肿瘤组织细胞中存在一群数量极少的肿瘤细胞，称为肿瘤干细胞，所有的肿瘤细胞都是由肿瘤干细胞分化来的。微小rna(mirna，microrna)在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，检测nsclc干细胞相关的mirnas是肺癌早期诊断和治疗的一个重要策略。研究表明常见的不同肿瘤类型呈现特征性的mirnas表达谱，这将为肿瘤的组织来源和诊断提供依据，特征性的mirna表达谱可以作为肿瘤早期诊断和治疗的分子标志物，也可判断不同肿瘤的预后、预测治疗效果。多项研究显示mir-155在nsclc中高表达，检测肺组织内的mir-155表达水平能区分肺癌患者与非肺癌患者，而且检测肿瘤组织内的mir-155表达水平能预测患者的肿瘤复发和不良预后风险，肺癌干细胞中mir-155表达高于普通肺癌细胞。如果能够直接携带荧光物质或化疗药物靶定肺癌细胞甚至肺癌干细胞，将有望最终达到早期诊断和根治肺癌的目的。分子信标(molecularbeacon，mb)是基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,fret)原理设计的一种高灵敏性和高特异性检测工具，实际上是一种呈茎环结构的双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对。未结合目标链时，位于其末端的荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，荧光被淬灭；当分子信标与目标链结合时，分子信标的空间构象发生改变，荧光基团远离猝灭基团，荧光信号恢复，因此分子信标是一种特异性检测dna和rna靶向序列的发夹型核酸探针，可被用来进行核酸-核酸和活细胞内可视化研究。
常规分子信标本身易被核酸酶或核结合蛋白降解，存在稳定性差、细胞摄取困难等缺点。而用锁核酸(1ockednucleicacid，lna)修饰碱基，由于几何和立体性质改变，其在较高温度的环境中能稳定存在，抗核酸酶降解的能力显著增强，具有与dna/rna强大的杂交亲和力。利用分子信标的关键是如何获得理想的转运载体，既可有效地保护免于被降解，又可高效地将分子信标递送入宿主细胞发挥靶向识别核酸序列的功能。壳聚糖(chitosan，cs)纳米为天然阳离子多糖，体外及体内实验均证实了壳聚糖作为转移载体的安全性及有效性，其主要特点有：①组织相容性好、免疫原性低，毒性小；②荷正电，易与dna分子自组装结合成纳米复合物，形成稳定的核壳结构，且对dna有保护作用；③制作过程简单、温和，对dna、抗体等生物大分子理化性质影响小；④壳聚糖纳米表面密集的活性氨基基团便于大分子修饰和耦联。
目前，多肽类受体作为恶性肿瘤诊断和治疗的分子靶点已成为研究的热点，其中生长抑素受体(sstr)就是其中的典型代表，许多肿瘤及其转移灶组织都有sstr的表达，较正常组织明显增高，大多以表达sstr2为主，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、内分泌胰腺癌、垂体瘤、淋巴瘤、脑膜瘤以及结肠、直肠、乳腺和前列腺肿瘤等。目前人工合成的sstr类似物(ssa)经过修饰后可选择性增强和延长其生物学活性，半衰期长，作用强大，如奥曲肽(octreotide,oct)、兰瑞肽(lanreotide)、伐普肽(vapreotide)等。ssa在体内不仅可以与肿瘤组织表达的sstr特异性结合，而且也可以与肿瘤血管内皮细胞上的sstr结合，进而达到双重靶向肿瘤组织的目的。除此之外，奥曲肽本身在治疗方面已被批准用于神经内分泌肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌等具有神经内分泌性质的恶性肿瘤，表现出了良好的抗肿瘤活性。
在现有技术中，已有研究表示奥曲肽(oct)可作为药物递送系统的主动靶向基团，可以将抗肿瘤药物递送到肿瘤部位；也有报道奥曲肽放射性核素标记物被fda批准作为肿瘤的诊断及治疗试剂。但现有技术中的分子信标或者奥曲肽等复合物制备方法复杂，工艺条件苛刻，且这些复合物只能用于诊断和治疗肺癌的中、晚期，这会使肺癌患者错过最佳治疗时间，影响肺癌患者的治疗，同时这些复合物在用于诊断肺癌的靶向性、特异性或稳定性等方面中至少有一方面效果不佳，因此急需一种制备方法简便且可获得靶向性强、特异性高、稳定性好的新思路、新方法的诊断肺癌的试剂，尤其是早期可以诊断肺癌优良试剂。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法，解决现有技术中用于肺癌诊断和治疗的药物或试剂的制备方法复杂、工艺条件苛刻且其靶向性、特异性或稳定性不佳以及只能诊断中、晚期肺癌的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法，包括下述步骤：
a、将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在ph6.0-7.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；
b、在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加0.5％～2.0％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为900：1～1300：1，通过第一次搅拌混合进行反应1h～2h，第一次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h～2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为120：1～80：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h～6h，第二次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析11h～15h去除未结合的奥曲肽，得到用于肺癌诊断和治疗的靶向奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，所述纳米壳聚糖的粒径≤300nm。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，所述纳米壳聚糖与所述分子信标的质量比为7：1。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，所述pbs缓冲液的ph为6.0。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，漩涡震荡时间为60s。
在本发明的制备方法中，在步骤b中，所述戊二醛溶液的浓度为1.0％，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1000：1。
在本发明的制备方法中，在步骤b中，所述奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为100：1。
在本发明的制备方法中，在步骤b中，第一次搅拌混合反应时间为1.5h，第一次搅拌速度为150rpm。
在本发明的制备方法中，在步骤b中，第二次搅拌混合反应时间为4h，第一次搅拌速度为150rpm。
在本发明的制备方法中，在步骤b中，第一次透析时间为1h；第二次透析时间为12h。
实施本发明的用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物的制备方法，具有以下有益效果：本发明的用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽(oct)偶联的纳米壳聚糖(cs)分子信标(mb)复合物，通过用自组装法合成纳米壳聚糖分子信标复合物，然后通过化学反应以戊二醛为交联剂合成奥曲肽偶联的纳米壳聚糖mir-155(microrna-155)分子信标复合物，该制备方法简便易行且方便工业化生产，所制得的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，同时奥曲肽本身或此复合物通过与肿瘤细胞高表达的mir-155结合进一步抑制mir-155的表达，从而达到抑瘤目的，可应用于肺癌细胞、肺癌裸鼠移植瘤及早期肺癌转基因小鼠模型活体动物成像，具有靶向性强、转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低等特点，将为肺癌的诊断和治疗提供新思路、新方法和新技术，尤其是针对肺癌的早期诊断和治疗；另外目前研究关于细胞和动物活体成像方面，主要是在蛋白方面研究，而本研究是利用高表达的基因进行成像和治疗，国内外报道几乎没有，属于首创。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法的具体实现作进一步说明：
本发明涉及一种将壳聚糖纳米与分子信标结合，奥曲肽偶联，通过识别肺癌细胞或肺癌干细胞内mir-155的表达来识别癌细胞，并同时抑制mir-155的表达抑制肿瘤生长，通过荧光成像实现对肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞的识别功能，达到肺癌诊断和治疗的目的。为此本发明提供的一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其具体实施例如下，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1-7为用于肺癌基因诊断和治疗奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备。其中纳米壳聚糖只要为纳米级别均在本发明的保护范围之内，优选为≤300nm，更优选为≤200nm，这样的纳米壳聚糖制备的纳米壳聚糖分子信标复合物更有利于进一步制备稳定性高、靶向性强的靶向奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标。
实施例1：
将纳米壳聚糖与分子信标按照质量比7：1的比例在ph6.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加1.0％的戊二醛溶液，戊二醛溶液与纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为1000：1，通过第一次搅拌混合进行反应1.5h，第一次搅拌速度为150rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析1h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为100：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应4h，第二次搅拌速度为150rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析12h去除未结合的奥曲肽，得到粒径40nm～90nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例2：与实施例1不同之处在于，壳聚糖纳米与分子信标按照质量比为10：1，最终得到粒径40nm～80nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例3：与实施例1不同之处在于，壳聚糖纳米与分子信标按照质量比为8：1，最终得到粒径45nm～60nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例4：与实施例1不同之处在于，纳米壳聚糖与分子信标按照质量比为9：1，最终得到粒径40nm～60nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例5：
将纳米壳聚糖与分子信标按照质量比9：1的比例在ph6.5的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡40s，在室温下静置100min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加0.5％的戊二醛溶液，戊二醛溶液与纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为1300：1，通过第一次搅拌混合进行反应2h，第一次搅拌速度为100rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析1.5h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为80：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h，第二次搅拌速度为100rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析11h去除未结合的奥曲肽，得到粒径30nm～50nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例6：
将纳米壳聚糖与分子信标按照质量比8：1的比例在ph7.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡120s，在室温下静置120min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加2.0％的戊二醛溶液，戊二醛溶液与纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为900：1，通过第一次搅拌混合进行反应1h，第一次搅拌速度为300rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为120：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应5h，第二次搅拌速度为250rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析15h去除未结合的奥曲肽，得到粒径45nm～65nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例7：
将纳米壳聚糖与分子信标按照质量比10：1的比例在ph6.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡120s，在室温下静置40min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加1.5％的戊二醛溶液，戊二醛溶液与纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为1200：1，通过第一次搅拌混合进行反应1.8h，第一次搅拌速度为200rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为110：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应6h，第二次搅拌速度为200rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析14h去除未结合的奥曲肽，得到粒径50nm～70nm的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。
实施例8-18为奥曲肽偶联的壳聚糖分子信标纳米复合物用于诊断和治疗肺癌的相关实验。
实施例8：液相分子杂交实验
液相分子杂交实验验证设计分子信标序列的正确性和特异性。
根据人的mir-155序列设计并合成锁核酸修饰的mir-155分子信标，同时设计不与任何靶基因结合的随机分子信标序列(randomsequence,rs-mb)作为阴性对照。
其中mir-155mb:
5’-cy5-cc+agcg-acc+cct+atca+cgat+tagcattaa-cgctgg-bhq2-3’；
rsmb：
5’-cy5-cc+agcg-ac+gcca+atg+acc+tta+agcattaa-cgctgg-bhq2-3’。
+n表示碱基由锁核酸结构修饰，cy5代表荧光基团，bhq2代表淬灭基团，划线部分表示分子信标的茎干机构；由上海生物工程公司合成。
配制杂交缓冲液，其中含10mmkcl、5mmmgcl2和10mmtris-hcl。将同浓度的分子信标与靶向序列在杂交缓冲液中充分混合，加入到96孔黑板中，每孔体积250μl，分子信标终浓度为100nmol/l，以杂交缓冲液调零，varioskanflash多功能酶标仪检测每孔的荧光强度，设置激发波长649nm，发射波长670nm，狭缝5nm，检测每组荧光强度。当只有分子信标存在的时候，荧光信号非常低；当靶向序列存在的时候，分子信标茎环结构打开，产生强烈的荧光信号，约为单独分子信标组的50倍，差异具有统计学意义；当有不互补序列基因存在的情况下，分子信标仍保持茎环结构，表明分子信标合成的特异性、灵敏性。
实施例9：凝胶阻滞分析
将壳聚糖纳米和mir-155mb于pbs缓冲溶液(ph6.0)中，按不同的质量比(wcs：wmir-155mb)进行混合，wmir-155mb固定质量为2μg并迅速漩涡振荡60s，室温放置60min，利用凝胶电泳分析。随着壳聚糖纳米质量的增加，mir-155mb的量逐渐减少，当质量比为7:1和10:1时，壳聚糖与mir-155mb基本上完全结合。
实施例10：包封率测定
将纳米壳聚糖和mir-155分子信标于pbs缓冲溶液中，按不同的质量比(wcs：wmir-155mb)进行混合，总体积为300μl，mir-155mb终浓度为200nm，并迅速漩涡振荡60s，室温放置60min，于高速离心机上20000rpm离心60分钟，取上清在紫外分光光度计上检测mir-155mb的浓度，并计算包封率。计算公式为：包封率ee％＝(w总-w游)/w总×100％。随着壳聚糖质量的增加，包封率逐渐增强，在质量比为7:1和10:1时达到最大，约为95％左右，这与凝胶阻滞分析结果较一致。
实施例11：荧光屏蔽实验
由上海生工公司合成mir-155cy5probes:5，-cy5-ttaatgctaatcgtgataggggt-3’，用同样的方法将不同质量比的纳米壳聚糖和mir-155-cy5(2μg)荧光探针进行自组装，酶标仪检测荧光强度。随着纳米壳聚糖质量的增加，荧光强度逐渐减弱，在质量比为7:1和10:1时荧光强度最低，表明壳聚糖可以包裹mir-155-cy5探针，与dna结合形成核壳结构，可以有效的保护dna免受外界的干扰，并与凝胶阻滞分析、包封率测定结果较一致。
实施例12：奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标理化性质分析
用同样的方法制备奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标，将奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物分别滴在铜片上，室温静止10分钟，2％磷钨酸染色1分钟，通过透射电镜检测奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标，用纳米粒度分析仪检测奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标粒径(malvern3000hs，uk)(tem,philipstecnai10)，并通过dnasei实验验证合成奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的稳定性，按照dnasei试剂盒(碧云天)操作，分子信标的终浓度为100nm。在反应液中，37℃10分钟后，加入edta，65℃，10分钟终止反应，酶标仪测定各孔荧光强度。
透射电镜表明奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标粒径较小，分布均匀，大小分别约为80nm，与纳米粒度分析仪结果较一致。dnasei实验表明纳米壳聚糖分子信标复合物在酶的作用下呈现非常低的荧光信号，表明奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物稳定性极佳，能够抵抗核酸酶的降解。
实施例13：商品化的siport脂质体转染试剂(ambion,usa)转染分子信标检测肺癌（nsclc）细胞（a549、spc-a1、h446）及肺癌干细胞（lcsc）mir-155的表达
将细胞接种至细胞培养皿(激光共聚焦显微镜专用)中，细胞贴壁后用pbs充分漂洗，3min×3次，充分去除碎片和死亡细胞；siport转染试剂按照说明书操作，用optimemi培养基稀释(1:20稀释)，每个培养皿取5µl的siport转染试剂稀释，室温孵育10min；用optimemi培养基配制400nm的mir-155分子信标和随机序列分子信标；取等体积稀释后的siport转染试剂和稀释后的mir-155分子信标和随机序列分子信标（阴性对照），mir-155分子信标和随机序列分子信标的终浓度为200nm，各培养皿中均加200µl上述稀释后的mir-155分子信标和随机序列分子信标；细胞培养箱内孵育120min；pbs漂洗3min×3次；各培养皿中加300µl的hoechst33342染色液复染20min；pbs漂洗3min×3次，各培养皿中加入适量pbs后在激光共聚焦显微镜下检测拍照。拍完照片后用1mlripa裂解液裂解细胞，取100ul加入到96孔板中，每组细胞6个复孔，酶标仪检测荧光强度。以表达人mir-155的前列腺癌（pc-3）细胞作为阳性对照，同时以不表达人mir-155的非洲绿猴肾细胞vero细胞、小鼠结肠癌ct-26细胞作为阴性对照，以cd133、cd338做为肺癌干细胞的表面标志物，流式细胞仪从a549细胞中分选cd133和cd338的双阳性细胞为肺癌干细胞（cd133+cd338+），同时采用qrt-pcr的方法检测肺癌细胞及肺癌干细胞（cd133+cd338+）内mir-155的表达。表明在表达mir-155的肺癌细胞及肺癌干细胞中可以看到红色荧光，且在干细胞内荧光信号更高，定位在细胞浆，而在不表达mir-155的vero细胞、ct-26细胞未检测到红色荧光，且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，综上表明设计合成的mir-155分子信标能够很好的检测高表达mir-155的癌细胞。
实施例14：纳米壳聚糖分子信标复合物（cs-mb）检测肺癌细胞及lcsc细胞mir-155的表达
按前述方法合成的纳米cs-mb复合物，同样的细胞贴壁后用pbs充分漂洗，3min×3次，每个细胞培养皿内加入optimemi培养基稀释的cs-mb纳米复合物，终浓度为200nm。37℃孵育120min，pbs漂洗3min×3次；各培养皿中加300µlhoechst33342染色液复染20min；pbs漂洗3min×3次，各培养皿中加入适量pbs后在激光共聚焦显微镜下检测拍照，拍完照片后用酶标仪检测荧光强度。以表达mir-155的pc-3细胞作为阳性对照，同时以不表达人mir-155的非洲绿猴肾细胞vero细胞、小鼠结肠癌ct-26细胞作为阴性对照。实验结果表明在表达mir-155的肺癌细胞及肺癌干细胞中可以看到较强的红色荧光，且在干细胞内荧光信号更高，定位在细胞浆，而不表达mir-155的vero细胞、ct-26细胞未检测到红色荧光，实验结果同siport脂质体转染结果。且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，并和商品化的siport脂质体转染试剂相比，荧光信号强度更高。
实施例15：细胞免疫荧光技术检测sstr2在肺癌细胞及组织内的表达
细胞爬片，密度约为70-80%；吸取培养基后，用1毫升4%多聚甲醛固定15min；pbs漂洗，3×3min；5%bsa室温封闭20min；.加入pbs稀释的一抗sstr2，1:200（satacruz），于4℃冰箱孵育过夜；pbs作为阴性对照。pbs漂洗，3×3min；加入1:200稀释后的的二抗，于37℃孵育30分钟；（此步骤及以后步骤注意避光处理）pbs漂洗，3×3min；滴加50ul的dapi染色5min；pbs漂洗，3×3min；抗淬灭封片剂封片。建立皮下移植瘤模型，制作冰冻切片，同样方法检测肿瘤组织中sstr2的表达，可见到sstr2在细胞膜表达，组织中在细胞膜和细胞浆表达，因此可以用奥曲肽进行靶向，在干细胞水平未检测到sstr2的表达。
实施例16：奥曲肽(oct)偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物(cs-mb-oct)以及fitc修饰的奥曲肽(oct)偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物(cs-mb-oct-fitc)检测肺癌细胞内mir-155的表达
制备奥曲肽偶联的壳聚糖分子信标复合物(200nm)和fitc修饰的奥曲肽偶联的壳聚糖分子信标纳米复合物(200nm)，分别用同样的方法和分子信标浓度转染(200nm)肺癌细胞，1小时后在肺癌细胞细胞浆就可以看到更强的红色荧光信号，绿色荧光在细胞的周边，表明奥曲肽和生长抑素受体进行了结合，进而导致更多的纳米复合物进入细胞内，导致mir-155分子信标和细胞浆内的mir-155结合。实验结果表明在表达mir-155的肺癌细胞中可以看到较强的红色荧光，定位在细胞浆，而且时间缩短为1小时，而不表达mir-155的vero细胞、ct-26细胞未检测到红色荧光，实验结果同siport脂质体转染结果。且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，并和商品化的siport脂质体转染试剂和纳米壳聚糖分子信标复合物相比，表现出了更高的荧光信号强度。
通过实施例13、14、16进行荧光强度分析：三种材料即商品化siport脂质体转染试剂、纳米壳聚糖分子信标复合物及奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物相比，荧光信号强度逐渐增强，且靶向性修饰的纳米材料孵育时间更短，为1小时。用同样的方法，三种材料转染肺癌细胞后，流式细胞仪分析细胞的转染效率，同样表明奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物表现了更高的转染效率。综上表明奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物不仅显示了更强的荧光强度，而且转染效率更高，且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，表明可以通过分子信标识别癌细胞高表达的mir-155，达到早期识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的。
实施例17：奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标检测对肺癌细胞内抑瘤作用
mtt实验检测奥曲肽偶联的纳米壳聚糖复合物(cs-oct)对spc-a1及a549细胞的杀伤作用，以空白壳聚糖纳米作为对照。取对数生长期a549、spc-a1、h446细胞一瓶，常规接种于96孔培养皿内，于37℃、5％co2孵箱中孵育24小时后可见细胞贴壁生长，以等体积完全培养液代替壳聚糖纳米或壳聚糖分子信标纳米复合物作为空白对照。37℃、5％co2孵箱中孵育48小时；培养48小时后吸取旧的培养液，mtt实验检测细胞抑制率，抑制率＝1-od490(实验组-空白组)/od490(对照组-空白组)×100％，计算各组细胞的抑制率。研究表明cs-oct能够显著抑制a549、spc-a1、h446肺癌细胞的生长，表面oct本身作为药物可以抑制肿瘤的生长。
实施例18：奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标检测对肺癌细胞内抑瘤作用
mtt实验检测奥曲肽偶联的纳米壳聚糖复合物(cs-mir-155mb-oct)对spc-a1及a549、h446细胞的杀伤作用，以cs-rsmb-oct作为阴性对照，以空白壳聚糖纳米作为对照。取对数生长期a549、spc-a1细胞一瓶，常规接种于96孔培养皿内，于37℃、5％co2孵箱中孵育24小时后可见细胞贴壁生长，以等体积完全培养液代替壳聚糖纳米作为空白对照。37℃、5％co2孵箱中孵育48小时；培养48小时后吸取旧的培养液，mtt实验检测细胞抑制率，抑制率＝1-od490(实验组-空白组)/od490(对照组-空白组)×100％，计算各组细胞的抑制率。研究表明cs-oct组及cs-rsmb-oct组相比，cs-oct组及cs-rsmb-oct组抑瘤率相当，表面为奥曲肽抑瘤作用导致。cs-mir-155mb组和cs-rsmb组相比，cs-mir-155mb组能够发挥抑瘤作用，表明mir-155mb可以和细胞内的mir-155结合，抑制mir-155的表达，从而达到抑瘤目的。和cs-oct组、cs-rsmb-oct组、cs-mir-155mb组相比，cs-mir-155mb-oct组抑瘤率最强，表面mir-155mb和奥曲肽共同发挥作用，从而达到更大的抑瘤作用，能够显著抑制a549、spc-a1、h446肺癌细胞的生长。
实施例19：裸鼠动物水平尾静脉注射纳米壳聚糖分子信标复合物(cs-mb)及奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物(cs-mb-oct)纳米复合物检测其对肺癌细胞的识别、诊断作用
通过尾静脉注射a549肺癌细胞建立肺移植瘤动物模型，尾静脉注射cs-mb(浓度2μm，体积300ul)或相同分子信标浓度的cs-mb-oct，活体成像检查对肺内肿瘤的识别情况，1小时后可以看到在肺部产生明亮的荧光信号，而对照组未见荧光信号。同时将肺组织取出，冰冻切片观察，可以发现cs-mb-oct纳米复合物表现出更强的荧光信号，同时也可以观察到肺组织内较多癌结节形成，荧光信号来自肺组织内的癌结节，表明cs-mb-oct可以通过与细胞内的mir-155的结合达到更好地识别肿瘤细胞的目的，并表明可以通过识别癌细胞或癌干细胞高表达的mir-155，达到识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的。
实施例20：转基因动物模型水平尾静脉注射纳米壳聚糖分子信标复合物(cs-mb)及奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物(cs-mb-oct)纳米复合物检测其对肺癌细胞的识别、诊断作用
本研究所引进的lox-stop-loxk-rasg12d(lslk-rasg12d)小鼠可以在成年后诱导引发肺腺癌的发生，动态展示肺腺癌的发生、发展，特别是从正常肺组织到非典型增生、原位癌、腺癌、伴有远处转移肺腺癌的动态展示，从而很好地模拟人类肺腺癌的发生、发展过程。转基因小鼠出生8周后，通过鼻腔缓慢滴入分泌cre酶的5×109pfu腺病毒，分别在滴入腺病毒后的4周，6周，8周，12周处死小鼠，建立不同病变时期肺腺癌模型。he染色检测发现在滴入腺病毒后的4、6、8、12周后在肺组织内可出现肺的非典型增生、腺瘤、原位癌及肺腺癌的不同病变过程，表明构建模型成功。免疫组化进一步表明病变组织均表达sstr2，可以用oct与sstr2靶向特异性结合这一特点靶向肿瘤细胞，达到识别肿瘤细胞、显像的目的。rt-pcr检测发现lslk-rasg12d模型不同病变时期中均有mir-155的表达，且随着肺癌病变进展，mir-155表达依次增加，在4周、6周及12周中比较mir-155的表达差异，差异具有统计学意义。表明肺癌发生发展中存在mir-155的表达，可以作为靶标进行示踪、检测。同样的方法尾静脉注射cs-mb-oct(浓度2μm，体积100μl)后，lslk-rasg12d小鼠肺组织内可检测到强弱不等的荧光信号，且随着病变的进展，荧光信号逐渐增强。将肺组织取出后，发现荧光信号来自肺组织，将肺组织制作冰冻切片后，激光共聚焦检测发现荧光信号来自肿瘤细胞。实现了通过荧光强度差别动态监测肺癌的发生、发展，从而为肺癌的早期诊断提供新思路、新方法和新技术。
需要说明的是，实施例1-7制备奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的方法不仅适用于生长抑素类似物奥曲肽，同样适用于fitc修饰的生长抑素类似物奥曲肽。
需要说明的是，在实施例中出现的浓度单位“mm”表示“mmol/l”；“nm”表示“nmol/l”；“μm”表示“μmol/l”。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。