一种血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球及其制备方法和应用与流程

文档序号：18230955发布日期：2019-07-20 01:20阅读：324来源：国知局

本发明属于医用制剂技术领域，具体涉及一种血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球及其制备方法和应用。

背景技术：

高强度聚焦超声(high-intensityfocusedultrasound,hifu)是通过物理方法无创治疗肿瘤等病变的技术，通过一定的方法将低能量的超声波聚焦在治疗靶区，通过靶区的空化效应及机械效应等使细胞坏死，达到治疗病灶的目的，其对实体肿瘤及非肿瘤性疾病治疗方面的安全性及有效性已得到广泛认可。但是，实际治疗中超声波在生物组织传播过程中却具有衰减特性，能量会随距离增加呈指数衰减，并且组织的血液流动亦会带走部分能量，削弱靶区能量积聚，极大地降低了hifu治疗效率。学者们希望通过增大治疗功率，延长治疗时间等来提高hifu治疗效率，但如此容易引起一系列并发症，如皮肤灼伤、声通道及周围组织损伤等，因此hifu增效剂研究应运而生。增效剂是一类通过增加超声的空化作用、改变靶区组织的声环境等增加hifu治疗时靶区能量沉积的物质，从研究最深入的微泡造影剂到各种新型制剂，研究者们一直在不断地探索。然而，微泡等可影响hifu声束在组织中的聚焦，从而降低组织的消融体积；而有的有机造影剂粒径大且稳定性低，很难渗入肿瘤组织，降低了治疗效果；无机纳米颗粒由于其毒性和较低的生物相容性与降解性，很难在临床实践中使用。

声动力化学疗法(sonodynamicchemistrytherapy,sdt)是指利用超声和某些化学物质的联合效应，用一定频率和强度的超声波辐照肿瘤部位，激活肿瘤部位富集并潴留的声敏剂，促使肿瘤细胞发生不可逆性损伤，从而达到治疗肿瘤目的的方法。血卟啉单甲醚(hematoporphyrinmonomethylether,hmme)是一种具有脂水两亲性的卟啉类声敏剂,具有组成单一、单态氧产量高、肿瘤选择性摄入率高等优点，在临床上可用于多种肿瘤的诊断以及脑胶质瘤等的治疗。但是hmme在水中易团聚，影响了其生物利用率和对光的吸收，限制了在临床上的应用。

因此急需一种既能有效增强hifu消融的治疗效果，又能增强体内外超声/光声成像效果的多功能制剂。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球的制备方法；目的之二在于提供一种血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球；目的之三在于提供该血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为声动力化学疗法中声敏药物的应用；目的之四在于提供该血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为高强度聚焦超声疗法中增效剂的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球的制备方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将血卟啉单甲醚和分子量为20000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶于三氯甲烷中，然后加入内水相，超声处理后获得w/o型乳状液；

(2)向步骤(1)中获得w/o型乳状液中加入聚乙烯醇水溶液，经高速分散均质机处理后，获得w/o/w型乳状液；

(3)去除步骤(2)中获得的w/o/w型乳状液中的三氯甲烷后离心获得沉淀，以水将所述沉淀离心洗涤后冷冻干燥，制得血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。

优选地，步骤(1)中，所述血卟啉单甲醚、聚乳酸-羟基乙酸共聚物和内水相的质量体积比为2:25:2，所述质量体积比的单位为mg:mg:ml；步骤(2)中，所述w/o/w型乳状液中血卟啉单甲醚和聚乙烯醇的质量比为2:125。

优选地，步骤(1)中，所述内水相为双蒸水。

优选地，步骤(1)中，所述超声处理为在超声功率为80w下超声45s。

优选地，步骤(2)中，所述高速分散均质机处理时的速度为8000r/min，处理时间为5-8min。

优选地，步骤(3)中，以80-100r/min的速度搅拌2-3h去除步骤(2)中获得的w/o/w型乳状液中的三氯甲烷。

优选地，步骤(3)中，所述离心的速度均为4000-5000r/min，离心的时间均为5-8min，所述离心洗涤的次数为3-5次。

优选地，步骤(3)中，步骤(3)中，所述冷冻干燥具体为在真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后充入c3f8气体。

2、由所述的方法制备的血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球。

3、所述的血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为声动力化学疗法中声敏药物的应用。

4、所述的血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球作为高强度聚焦超声疗法中增效剂的应用。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球及其制备方法和应用，该方法中采用双乳化法和冷冻干燥法，以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)为载体，将血卟啉单甲醚(hmme)装载到plga微球的壳膜中，制备出hmme/plga微球，该微球具有组织选择性好、治疗后避光时间短、生物相容性好和可降解性等优点。该微球不但具有超声/光声双模态显像功能，能够增强体内外超声/光声成像效果，还可以用作hifu增效剂，增强体内外hifu治疗的效果。该微球制备工艺简单，易操作，适合扩大化生产。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例1中制备的hmme/plga微球的光学显微镜图；

图2为实施例1中制备的hmme/plga微球的扫描电镜图；

图3为实施例1中制备的hmme/plga微球的透射电镜图；

图4为实施例1中制备的hmme/plga微球的激光共聚焦显微镜图；

图5为实施例1中制备的hmme/plga微球的粒径分布图；

图6为实施例1中制备的hmme/plga微球的表面电位测试结果图；

图7为实施例6中输出声功率为120w，消融时间为10s的增效hifu实验结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1

制备血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球

(1)将2mg血卟啉单甲醚(hmme)和25mg分子量为20000的聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)溶于2ml三氯甲烷中，然后加入2ml内水相(双蒸水)，在超声功率为80w下超声45s后获得w/o型乳状液；

(2)向步骤(1)中获得w/o型乳状液中加入2.5ml质量分数为5％的聚乙烯醇水溶液，通过高速分散均质机以8000r/min的速度处理5min后，获得w/o/w型乳状液；

(3)以80r/min的速度搅拌2h去除步骤(2)中获得的w/o/w型乳状液中的三氯甲烷后以5000r/min的速度离心5min获得沉淀，以双蒸水将该沉淀再以5000r/min的速度离心洗涤3-5次后，在真空冷冻干燥机中冷冻干燥48h后充入c3f8气体，制得血卟啉单甲醚/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米微球(hmme/plga微球)。

利用光学显微镜对实施例1中制备的hmme/plga微球进行检测，检测结果如图1所示，利用扫描电镜对实施例1中制备的hmme/plga微球进行检测，检测结果如图2所示，由图1和图2可知，hmme/plga呈球形，形态规则，大小较均匀。

利用透射电镜对实施例1中制备的hmme/plga微球进行检测，检测结果如图3所示，由图3可知，较多黑色的hmme颗粒分布于外壳结构中。

利用激光共聚焦显微镜对实施例1中制备的hmme/plga微球进行检测，检测结果如图4所示，由图4可知，hmme/plga微球表现出强烈的红色荧光。

利用malvern激光测径仪对实施例1中制备的hmme/plga微球进行检测，其粒径检测结果如图5所示，由图5可知，hmme/plga微球平均直径为357±0.72nm(pdi＝0.932)，其电位检测结果如图6所示，由图6可知，hmme/plga微球的表面电位为-7.89mv。

对比实施例

与实施例1的区别在于，步骤(1)中未加入2mg血卟啉单甲醚(hmme)，最终制得plga微球。

实施例2

利用紫外-可见分光光度仪检测及计算实施例1中制备的hmme/plga微球的吸收光谱及包封率、载药量，具体方法如下：

(1)标准曲线的绘制：将2mghmme用200μldmso溶解后，稀释配制浓度分别为0.5μg/ml，1.0μg/ml，1.5μg/ml，2.0μg/ml，3.0μg/ml的溶液。用紫外分光光度仪于波长401nm处分别测吸光度值，每个样本测三次，作浓度-吸光度标准曲线。

(2)取实施例1中制备的hmme/plga微球2.5mg，配制2mlhmme/plga溶液，将2mlhmme/plga溶液加入2mldmso中，使plga外壳充分破裂，然后将含有hmme/plga微球的dmso溶液稀释至步骤(1)中标准曲线范围内，用紫外分光光度仪于波长401nm处测试吸光值，然后根据标准曲线，计算得出实施例1中制备的hmme/plga微球中hmme的含量为1.17mg，再依据以下公式计算出实施例1中制备的hmme/plga微球的包封率为58.33±0.95％，载药量为4.73±0.15％。

包封率(％)＝(wi/ct)×100％；

载药量(％)＝(wi/wt)×100％

式中，wi为hmme/plga微球内hmme的含量，ct为制备时投入的hmme总量,wt为hmme/plga重量。

实施例3

细胞毒性-增值实验

(1)细胞复苏及培养

取出skvo3细胞预热融化，制备细胞悬浮液，将细胞悬液与培养液混合后离心，接种于培养瓶后培养，当细胞生长达对数生长期时进行实验。

(2)cck8法检测细胞存活率

实验原理：cck试剂盒是一种基于wst-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2h-四唑单钠盐)的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。本实验中以酶标仪测定的od值可间接反映活细胞数量。

方法：将对数生长期的裸鼠卵巢癌skov3细胞配成细胞浓度为5×10⁴个的细胞悬液。实验分为5组：(i)单纯细胞悬液(对照组),(ii)超声+细胞悬液，(iii)超声+plga+细胞悬液(该组中plga的浓度为20μg/ml)，(iv)超声+hmme+细胞悬液(该组中hmme的浓度为20μg/ml)，(ⅴ)超声+hmme/plga微球+细胞悬液(该组中hmme/plga微球的浓度为20μg/ml)。其中，分别取2ml(ii)-(ⅴ)组中的细胞悬液于去底的50ml离心管内，使用cgzz型超声基因转染仪从底部声透膜向上辐照各细胞悬液(超声辐照声强0.50w/cm²,频率1mhz)，辐照时间分别为0s，10s，30s，60和90s，(i)组不做任何处理。将各组经超声处理后的细胞悬液及(i)组单纯细胞悬液分别移入96孔培养板中(100μl/孔)，然后以10μl/孔加入cck8试剂，再于37℃，5％co2恒温孵箱内培养3-4h后，以紫外分光光度仪于波长490nm处测定各孔光吸收值od。本实验重复3次。利用以下公式计算出(ii)-(ⅴ)组的细胞存活率，结果见表1至表4：

细胞存活率(％)＝(加药处理组的od值－空白组od值/对照组od值－空白组od值)×100％，空白组od值指只含培养液而没有细胞组的吸光度值。

表1第ⅱ组中不同处理时间对裸鼠卵巢癌skvo3细胞存活率的影响

注：^*p<0.05vs0s，^#p<0.05vs其余各组

表2第ⅲ组中不同处理时间对裸鼠卵巢癌skvo3细胞存活率的影响

注：^*p<0.05vs0s，^#p<0.05vs其余各组

表3第ⅳ组中不同处理时间对裸鼠卵巢癌skvo3细胞存活率的影响

注：^*p<0.05vs0s，^#p<0.05vs其余各组

表4第ⅴ组中不同处理时间对裸鼠卵巢癌skvo3细胞存活率的影响

注：^*p<0.05vs0s，^#p<0.05vs其余各组

由表1至表4可知，各组中细胞的存活率随超声处理时间的增加而下降，说明细胞的存活率与超声处理时间具有一定的关系。在各时间点，对照组第ⅰ组的细胞存活率最高，第ⅱ-ⅴ组的细胞存活率均有所降低，其中降低幅度最大的是第ⅴ组(p<0.05)，其次是第ⅳ组，第ⅱ组和第iii组没有显著差别(p>0.05)。

(3)cck8法检测细胞增值率

(i)-(ⅴ)组中的细胞悬液参照实验(2)的方法进行处理，将各组经超声处理后的细胞悬液及(i)组单纯细胞悬液分别移入96孔培养板中(100μl/孔)，然后分别于12h，24h，36h，48h四个时间点分别加入cck8试剂(10μl/孔)，孵育3h后，以紫外分光光度仪于波长490nm处测定各孔光吸收值od。实验重复3次。测试结果见表5。

表5各组od值测试结果

注：^*p<0.05vs0s，^#p<0.05vs其余各组

由表5可知，第ⅰ组的od值增长最快，第ⅱ-ⅴ组od值增长较慢，其中最慢的是第ⅴ组(p<0.05)，其次是第ⅳ组，第ⅱ组和第iii组od值没有显著差别(p>0.05)。

实施例4

超声成像

(1)以琼脂糖凝胶制备超声显像的孔洞模型，将pbs缓冲液(浓度为0.5mg/ml)、plga(plga的浓度为0.5mg/ml)、hmme溶液(hmme浓度的为0.5mg/ml)及hmme/plga微球溶液(hmme/plga微球的浓度为0.5mg/ml)分别装入该模型中进行超声显像。采用vivo2100光声成像仪以21mhz线阵探头，基波成像模式，扫查声束与孔洞长轴垂直，采集各孔中的超声图像，分析各孔超声图像可知，加入了hmme/plga微球溶液孔所呈现的图像灰度值最大(p＜0.05)，加入了hmme溶液和plga溶液孔所呈现的图像灰度值相似(p＞0.05)，加入了pbs缓冲液孔所呈现的图像灰度值最小(p＜0.05)。以dfy型超声图像定量分析诊断仪分析4种溶液的超声强度值，结果如表6所示。

表64种溶液的超声回声强度比较

注：^*p<0.05vs其余各组，^#p<0.05vspbs

由表6可知，hmme/plga微球溶液的超声回声强度最大。

(2)配制hmme/plga微球浓度分别为0.25mg/ml，0.5mg/ml，1.00mg/ml的hmme/plga微球溶液，分别装入实验(1)中制备的模型中进行超声显像。采用vivo2100光声成像仪以21mhz线阵探头，基波成像模式，扫查声束与孔洞长轴垂直，分别采集各孔中的超声图像，分析各孔超声图像可知，hmme/plga微球浓度最大者(1.00mg/ml)灰度值最大(p＜0.05)，浓度最小者(0.25mg/ml)灰度值最小(p＜0.05)。即随着hmme/plga微球浓度的增加，hmme/plga的超声信号强度明显增加。以dfy型超声图像定量分析诊断仪分析3种溶液的超声强度值，结果如表7所示。

表7不同hmme/plga微球浓度超声回声强度比较

注：^*p<0.05vs其余各组，^#p<0.05vs(0.25mg/ml)组

由表7可知，超声回声强度随着hmme/plga微球浓度的增大而增大。

实施例5

光声成像

(1)以琼脂糖凝胶制备光声显像的孔洞模型，将pbs缓冲液(浓度为0.5mg/ml)、plga(plga的浓度为0.5mg/ml)、hmme溶液(hmme浓度的为0.5mg/ml)及hmme/plga微球溶液(hmme/plga微球的浓度为0.5mg/ml)分别装入该模型中进行光声显像。采用vivo2100光声成像仪以690nm的脉冲激光辐照3分钟，分别采集各孔中的光声图像，分析各孔光声图像可知，加入了hmme/plga微球溶液孔的图像光声值最大(p＜0.05)，加入了hmme溶液孔的图像光声值次之，加入了plga溶液和pbs缓冲液孔的图像光声值为0(p＜0.05)。以光声仪自带的软件记录4种溶液的光声值，结果如表8所示。

表84种溶液的光声信号强度比较

注：^*p<0.05vs其余各组，^#p<0.05vspbs、plga

由表8可知，hmme/plga微球溶液的光声信号强度最大。

(2)配制hmme/plga微球浓度分别为0.25mg/ml，0.5mg/ml，1.00mg/ml的hmme/plga微球溶液，分别装入实验(1)中制备的模型中进行光声成像。采用vivo2100光声成像仪以690nm的脉冲激光辐照3分钟，分别采集各孔中的光声图像，分别采集各孔中的超声图像，分析各孔光声图像可知，hmme/plga微球浓度最大者(1.00mg/ml)光声值最大(p＜0.05)，浓度最小者(0.25mg/ml)光声值最小(p＜0.05)。即随着hmme/plga微球浓度的增加，hmme/plga的光声信号强度明显增加。以dfy型超声图像定量分析诊断仪分析3种溶液的超声强度值，结果如表9所示。

表9不同hmme/plga微球浓度光声信号强度比较

注：^*p<0.05vs其余各组，^#p<0.05vs(0.25mg/ml)组

由表9可知，光声信号强度随着hmme/plga微球浓度的增大而增大。

实施例6

增效hifu实验

以新鲜离体牛肝(大小约10cm×10cm×8cm)作为模型，生理盐水复温脱气约30min后置于容器中进行实验。实验分为(i)pbs缓冲液(浓度为1.00mg/ml)，(ii)plga溶液(plga的浓度为1.00mg/ml)，(iii)hmme溶液(hmme浓度为1.00mg/ml)和(iv)hmme/plga微球溶液(hmme/plga微球浓度分别为0.25mg/ml，0.5mg/ml，1.00mg/ml)四组。将200μl各组样品的注入新鲜离体牛肝中，分别于注入点给予hifu定点辐照，实验时采用单次辐照方式，选择120w，150w和180w三种不同的输出声功率，每个声功率下完成3次不同时间的消融，依次为3s，5s和10s，各样品在相同声功率，相同辐照时间重复消融3次，消融点间距离≥1cm，其中输出声功率为120w，消融时间为10s的增效hifu实验结果如图7所示。

观测指标：辐照前后于监测屏上先肉眼观察靶区超声灰度值的变化，辐照后手工勾画灰度变化的范围，同时应用jc-200型聚焦超声肿瘤治疗系统自带的grayval1.0软件计算靶区辐照前后的灰度变化值。实验结束后测量牛肝最大损伤点，并根据以下公式分别计算得出(i)-(iv)的消融区凝固性坏死体积(v)和能效因子eef(energyefficiencyfactor)。

v(mm³)＝(π/6)×l×w×d

式中：l为长度，w为宽度，d为厚度。

eef(j/mm³)[6]＝ηpt/v

式中：η为hifu换能器聚焦系数，反映hifu换能器对超声能量汇聚的能力，该实验中所用仪器的η取0.7，p为hifu源总声功率，t为治疗总时间，v为消融区凝固性坏死体积。(1)第i组到第iv组中靶区灰度变化情况见表10至表13：

表10各组在不同hifu输出声功率下消融牛肝灰度变化值比较(3s)