茄科植物提取的杂环化合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用及药物的制作方法

本发明涉及生物医学技术领域，尤其是涉及一种茄科植物提取的杂环化合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用及药物。

背景技术：

多发性硬化症，是一种青年的中枢神经脱髓鞘的疾病，其主要表现在白质炎性脱髓鞘斑。由于此病病变较为广泛和弥散，所引发的症状也极为复杂，例如可表现为神经炎、肢体瘫痪以及精神症状等。多发性硬化症的病理机制主要被认为是由免疫系统t细胞和b细胞诱导的髓鞘损伤、神经炎症和神经退行性疾病。研究显示少突胶质细胞损伤被认为是多发性硬化症的主要诱发因素，但是该疾病的病因尚不清楚。

目前从神经炎症方向已经研发出肿瘤坏死因子在多发性硬化症上起着很重要的作用。研究发现在多发性硬化症的小鼠模型上神经胶质细胞释放肿瘤坏死因子要显著地高于正常小鼠的神经胶质细胞产生的肿瘤坏死因子，由此可推出肿瘤坏死因子的高水平的表达可是多发性硬化症疾病的一个重要病理机制。然后科学家们针对肿瘤坏死因子研究出其抑制剂，发现肿瘤坏死因子抑制剂可显著的改善多发性硬化症小鼠的病症。自此，经过多方面研究，将肿瘤坏死因子抑制剂应用于临床治疗多发性硬化症，只是病人的病症减轻。但是，服用该药的多发性硬化症的病人多半会头晕，头疼，甚至还有报道肿瘤坏死因子抑制剂导致了多发性硬化症患者死亡案例。由此可见，科学家们对多发性硬化症的病理机制以及有效治疗药物的研究还任重道远。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一个目的在于提供茄科植物提取的杂环化合物在制备治疗多发性硬化症的药物中的应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。

本发明的第二个目的在于提供一种药物，该药物能够有效治疗多发性硬化症。

本发明提供了茄科植物提取的杂环化合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

进一步地，所述茄科植物包括枸杞、茄子、辣椒或西红柿中的一种或多种。

进一步地，所述茄科植物提取的杂环化合物包括尼古丁。

另外，本发明还提供了一种治疗多发性硬化症的药物，所述药物的活性成分为茄科植物提取的杂环化合物。

进一步地，所述茄科植物包括枸杞、茄子、辣椒或西红柿中的一种或多种。

进一步地，所述茄科植物提取的杂环化合物包括尼古丁。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

进一步地，所述药物剂型包括口服制剂或注射制剂。

进一步地，所述口服制剂包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂；

优选地，所述注射制剂包括注射液或粉针剂。

进一步地，所述药物的有效给药剂量为2-5μm/kg/天。

本发明通过建模等大量的实验证实，茄科植物提取的杂环化合物能够显著抑制活性氧诱导的氧化应激，从而保护神经元不受损伤，说明茄科植物提取的杂环化合物能够通过对氧化应激的抑制作用，对临床神经疾病多发性硬化症具有潜在的预防和/或治疗作用。本发明通过将茄科植物提取的杂环化合物应用在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中，能够对多发性硬化症起到有效的预防和/或治疗作用，从而减少多发性硬化症的发病率和/或大大提高多发性硬化症的治疗效果，为临床实验提供依据，也为新药的研发提供新途径。

本发明提供的治疗多发性硬化症的药物，该药物的活性成分为茄科植物提取的杂环化合物，因此，能够通过抑制氧化应激有效抑制多发性硬化症，对多发性硬化症起到明显的预防和/或治疗作用，同时还具有副作用小的优点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1提供的ht-22细胞经不同浓度的过氧化氢处理24小时后的细胞形态结果图；

图2为本发明实施例1提供的ht-22细胞经不同浓度的过氧化氢处理24小时后的细胞活性检测结果图；

图3为本发明实施例2提供的t-22细胞经不同浓度的尼古丁处理24小时，再经过600μm氧化氢处理24小时后的细胞形态结果图；

图4为本发明实施例2提供的t-22细胞经不同浓度的尼古丁处理24小时，再经过600μm氧化氢处理24小时后的细胞活性检测结果图；

图5为本发明实施例3提供的尼古丁抑制h2o2在ht-22细胞内活性氧ros检测水平的结果图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是：

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

根据本发明的一个方面，提供了茄科植物提取的杂环化合物在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中的应用。

茄科植物提取的杂环化合物是吡咯烷等杂环化合物。本发明中的茄科植物提取的杂环化合物，既可以为实验室制备得到的，也可以是市售直接购得的。

多发性硬化症属于神经性疾病，脑组织需氧量高，对缺氧敏感，因其含丰富的多不饱和脂肪酸但抗氧化物酶含量低，当自由基过度产生和/或无法及时清除时，脑内氧化与抗氧化作用失衡，神经组织和细胞就易受氧化损伤。因此，氧化应激在多发性硬化症中起着关键作用。

本发明通过建模等大量的实验证实，茄科植物提取的杂环化合物能够显著抑制活性氧诱导的氧化应激，从而保护神经元不受损伤，说明茄科植物提取的杂环化合物能够通过对氧化应激的抑制作用，对临床神经疾病多发性硬化症具有潜在的预防和/或治疗作用。本发明通过将茄科植物提取的杂环化合物应用在制备预防和/或治疗多发性硬化症的药物中，能够对多发性硬化症起到有效的预防和/或治疗作用，从而减少多发性硬化症的发病率和/或大大提高多发性硬化症的治疗效果，为临床实验提供依据，也为新药的研发提供新途径。

需要说明的是，在本发明中所述的多发性硬化症，包括复发缓解型多发性硬化症、继发进展型多发性硬化症、原发进展型多发性硬化症和进展复发型多发性硬化症等多种类型的多发性硬化症，凡是临床上判定属于多发性硬化症的疾病，均在本发明的保护范围内。

可以理解的是，“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如预防和/或治疗包括预防和治疗，以及预防或治疗。

在一些优选的实施方式中，所述茄科植物包括枸杞、茄子、辣椒或西红柿中的一种或多种。例如，茄科植物可以为枸杞、可以为茄子、可以为辣椒、可以为西红柿、可以为枸杞和西红柿、可以为茄子和辣椒、也可以为枸杞、茄子、辣椒和西红柿的组合。

在一些优选的实施方式中，所述茄科植物提取的杂环化合物包括尼古丁(1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷)。

尼古丁，俗称烟碱，是一种存在于茄科植物中的生物碱，是烟碱型乙酰胆碱受体激动剂。目前已知尼古丁的烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinicacetylcholinereceptors，nachrs)广泛分布于体内，负责调节中枢及外周神经系统、心血管系统、免疫系统等的功能，本发明通过实验发现，尼古丁还可通过降低氧应激来改善多发性硬化症。

根据本发明的另一方面，提供了一种治疗多发性硬化症的药物，所述药物的活性成分为茄科植物提取的杂环化合物。

本发明提供的治疗多发性硬化症的药物，该药物的活性成分为茄科植物提取的杂环化合物，因此，能够通过抑制氧化应激有效抑制多发性硬化症，对多发性硬化症起到明显的预防和/或治疗作用，同时还具有安全无毒、副作用小的优点。

在一些优选的实施方式中，所述茄科植物包括枸杞、茄子、辣椒或西红柿中的一种或多种。例如，茄科植物可以为枸杞、可以为茄子、可以为辣椒、可以为西红柿、可以为枸杞和西红柿、可以为茄子和辣椒、也可以为枸杞、茄子、辣椒和西红柿的组合。

在一些优选的实施方式中，所述茄科植物提取的杂环化合物包括包括尼古丁。

在一些优选的实施方式中，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

药学上可接受的辅料是指生产药品和调配处方时，使用的的赋形剂和附加剂，是指除活性成分外，在安全性方面已进行了合理的评估，并且包含在药物制剂中的物质。同一药用辅料可用于不同给药途径的药物制剂，且有不同的作用和用途。在本发明提供的药物中添加的药学上可接受的辅料，能够起到赋型、充当载体或提高稳定性的作用，此外，还具有增溶、助溶或缓控释等重要功能。

典型但非限制性的药学上可接受的辅料包括：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、湿润剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏着剂、抗氧剂、螯合剂、渗透促进剂、ph调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂或释放阻滞剂中的一种或多种。

在一个优选的实施方式中，药物的剂型包括口服制剂或注射制剂。

当口服用药时，上述药物可制成任意口服可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、糖浆剂、口服溶液剂、口服混悬剂或口服乳剂。

其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。口服混悬剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。

任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。

当以注射的形式给药时，上述药物可制成任意注射可接受的制剂形式，例如可以为，但不限于注射液或粉针剂。

其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。

在一些优选的实施方式中，所述药物的有效给药剂量为2-5μm/kg/天，例如可以为，但不限于2μm/kg/天、3μm/kg/天、4μm/kg/天或5μm/kg/天。

在一个优选的实施方式中，给药频率例如可以为，但不限于每天两次、每天一次、每两天一次、每周一次或每月一次给药。或者，可以以缓释制剂的形式给予本发明提供的药物，在这种情况下，需要较少的给药频率。

给药剂量和频率根据制剂在用药者体内的半衰期而不同，此外，也可以根据是预防性处理还是治疗性处理而不同。在预防性应用中，以相对低频率的间隔长期给予相对低的剂量，例如2μm/kg/天。在治疗性应用中，有时需要以相对短的间隔给予相对高的剂量，例如5μm/kg/天，直至疾病的进展被延缓或停止，并优选地直至个体表现出疾病症状的部分或完全改善，在此之后，可以给予患者预防方案。

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本发明实施例中用到的主要试剂信息如下：

尼古丁1-甲基-2-(3-吡啶基)吡咯烷(sigma)，cellcountingkit-8(cck8,jindo,japan),过氧化氢(sigma),dmem培养基(gibco),胎牛血清fbs(gibco),pbs(hyclone),链霉素双抗(gibco),dcfh-da检测试剂盒(碧云天)。

如无特殊说明，本发明实施例中的ht-22细胞培养于dmem培养基(含1％青霉素、链霉素双抗和10％胎牛血清)的培养瓶中，放置于37℃、5％co2的培养箱中进行培养。

本发明实施例中，cck8检测细胞活性包括如下步骤：

1、取适量cck8试剂原液，用等量的pbs以1:1等体积混合得cck8稀释液；

2、取适量cck8稀释液，与培养基以1:9的比例混合，配得工作液；

3、从co2培养箱中取出96孔板，吸走培养基，每个孔中各加入约100μl的工作液；

4、将96孔板放于co2培养箱中，孵育40min-1.5h；

5、使用酶标仪，测定450nm下的吸光度，获得数据。

实施例1过氧化氢诱导ht-22细胞损伤

将ht-22细胞(海马神经元细胞)分别在一系列浓度(200、400、600、800μm)的h2o2溶液中孵育24小时后，用倒置显微镜拍摄细胞形态，结果如图1所示：随着h2o2浓度的增加，活细胞密度下降，数量减少；用cellcountingkit8(cck8)试剂盒进行ht-22细胞的活性检测，结果如图2所示，细胞活性随h2o2浓度升高而下降。本实施例的数据显示h2o2在ht-22细胞中诱导剂量依赖的细胞毒性，其中600μmh2o2组细胞活性约为50％(加入pbs的对照组细胞存活率100％)。

实施例2尼古丁对过氧化氢诱导的ht-22细胞损伤的保护作用

根据本发明实施例1中得到的h2o2梯度引起细胞损伤的结果，选择引起近半数细胞死亡的600μmh2o2浓度进行以下实验。用尼古丁的不同浓度(1、2、5、10μm)处理ht-22细胞孵育24小时后，再在浓度600μm的h2o2溶液中共同孵育24小时，然后用倒置显微镜拍摄细胞形态，如图3所示，对比pbs对照组，h2o2组的细胞密度低，数量少；对比h2o2组，不同浓度尼古丁各组细胞数量有较为明显地增加。用cck8检测细胞活性，如图4所示，1、2、5、10μm的尼古丁显著地抑制了h2o2对ht-22细胞的损伤。当尼古丁达到10μm时，尼古丁对ht-22细胞神经保护作用明显减少。从以上结论可以得出，低浓度的尼古丁可以显著地抑制h2o2诱导海马神经元细胞死亡。

实施例3尼古丁通过抑制ros形成而保护ht-22细胞

将ht-22细胞加入不同浓度尼古丁中(1、2、5和10μm)孵育24小时后，再在浓度600μm的h2o2中孵育24小时，为验证尼古丁保护作用与氧化应激的联系，本实施例检测了细胞内活性氧ros的水平，结果如图5所示，相比pbs对照组，h2o2组的活性氧水平明显升高；对比h2o2组，不同浓度尼古丁各组的活性氧(ros)水平均降低，5μm尼古丁可使ros水平降至最低。从上述实验可以说明，尼古丁能够通过抑制ros形成，有效地保护ht-22细胞。

其中，细胞活性氧检测试包括如下步骤：

1、ht-22细胞以1×10⁵/ml的浓度培养在12孔板中，每孔含1ml细胞悬液，培养24h后，用不同浓度的尼古丁或pbs预处理细胞，并孵育24h，之后加适当浓度的h2o2或梯度浓度h2o2到培养的细胞中，继续孵育24h；

2、从co2培养箱中取出12孔板，吸走培养基，每个孔中各加入约500μl的1×磷酸盐缓冲溶液(pbs)清洗细胞层，可重复1-2次，完成后吸走pbs，尽量吸净。

3、每孔加入约500μl的0.25％的无edta-胰酶消化液消化贴壁细胞2-4min。然后加约500μl的1×pbs或培养基终止细胞消化，将消化下的细胞收集在ep管里，室温5000rpm离心30s-1min，离心后小心去除上层的液体；

4、dcfh-da(10mm)和无血清的细胞培养液以1：1000的比例稀释成10μm/l浓度的工作液，每个ep管加入500μl工作液，放于37℃细胞培养箱内孵育20min，每隔3-5min颠倒混匀一下(使探针dcfh-da和细胞充分接触)；

5、孵育结束后，使用离心机室温5000rpm离心30s-1min，使细胞沉淀并去除上液；

6、ep管中加入1ml无血清的细胞培养液,轻轻吹打重悬细胞(洗涤细胞)，之后室温5000rpm离心30s-1min，使细胞沉淀并去除上液，重复该步骤，一共用无血清的细胞培养液洗涤细胞三次；

7、最后，用适量无血清的细胞培养液重悬细胞并用流式细胞仪检测dcf的荧光，获得数据并进行后续分析。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。