本发明涉及一种脱细胞人源角膜基质的制备方法。
背景技术：
中国角膜病致盲者约500万左右，仅次于白内障，居眼科致盲疾病的第二位，约80％的患者可通过角膜移植来避免致盲。但我国由于受到传统观念和眼库条件的限制，角膜捐献者数量很有限，治疗成本昂贵。近代组织工程角膜研究的兴起和发展为寻找角膜替代材料开辟了另一个方向，随后也出现了合成材料和天然生物材料的角膜替代物，这些材料虽然具有良好的生物相容性，移植后可维持眼球的完整，并能在一定程度上恢复角膜的透明度，但由于其缺少天然角膜的结构，依然存在很多不足，例如透明度不高，移植后降解过快，生物力学强度较差，不能耐受缝线切割等，使其临床应用较为局限。随着科研的发展，近年来人们将焦点集中在天然的动物角膜材料。利用脱细胞的方法去除异种角膜的外源细胞及抗原物质，从而获得异种无细胞的角膜细胞外基质材料，应用于人角膜疾病的治疗。但异种动物来源角膜在临床使用上仍存在一些难以规避的问题，例如人和动物之间存在着种族差异，如果细胞脱除不彻底，将产生强烈的免疫排斥反应。
自2011年，随着全飞秒激光角膜屈光手术的发展和普及，角膜基质透镜这一手术“副产品”的出现为我们构建组织工程角膜基质提供了新的选择。据不完全统计我国每年完成的手术约100万例以上，在手术中角膜基质透镜被完整地取出，产生了庞大数量的角膜透镜“副产品”，从而引发学者们近几年致力于“变废为宝”对透镜再利用的研究，结果表明取下的角膜透镜可以重新应用于多种角膜疾病的治疗，这无疑为拓宽角膜移植供体来源、缓解角膜供体不足又提供了新方法。
来源于全飞秒激光手术，与动物角膜基质相比优势在于同种异体来源，组织结构更为相似，生物相容性及生物安全性好，且来源广泛、取材方便。然而，尽管角膜是免疫赦免组织，但同种异体角膜基质移植仍有可能发生免疫排斥反应，且研究发现供体中残留的细胞成分会影响供体与受体的整合，可能会导致免疫排斥反应，因此也需要进行脱细胞处理。现有的脱细胞处理方法对角膜基质的破坏性大。在脱细胞过程中反复冻融或超声破碎细胞极易对角膜微观结构产生破坏，造成胶原断裂，损伤角膜基质的张力，影响角膜基质的光学性能和力学性能，从而导致移植后透明度恢复不好，影响患者视力；而且一些脱细胞方法中加入了表面活性剂等化学试剂，后期处理不好会有较大的毒性残留。这些因素都决定角膜材料在临床上能否成功移植，影响手术效果。
技术实现要素：
针对上述存在的问题，本发明提供一种脱细胞人源角膜基质的制备方法，该脱细胞处理方法采用渗透压破碎细胞，并采用核酸酶处理去除细胞的dna成分，相对于动物角膜的脱细胞处理要更为安全温和有效，避免了反复冻融和高静压超声破碎细胞以及表面活性剂的加入带来的弊端。具体技术方案如下：
一种脱细胞人源角膜基质的制备方法，包括步骤如下：
1）脱细胞前处理：将来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于配制好的洗涤液中清洗，进行脱细胞前处理；
2）细胞破碎处理：采用渗透压冲击法使人角膜基质材料上残留细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的核酸物质，包括dna和rna成分；
3）酶消化处理：采用dna酶和rna酶的联合作用，去除细胞破裂释放的dna及rna成分；
4）漂洗与修复：采用配制好的修复液对人角膜基质材料进行漂洗，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口；
5）灭菌：采用钴-60或电子束辐照对人角膜基质材料进行灭菌处理，完成制备，获得脱细胞人源角膜基质。
作为优选的技术方案的，步骤1）中，所述脱细胞前处理，人角膜基质材料于洗涤液中清洗的次数为2～3次；冲洗时间为每次1～3min。
进一步优选的，所述洗涤液为含1％（v/v）青霉素-链霉素-两性霉素b(100×三抗)混合溶液的pbs或hbss缓冲液。
作为优选的技术方案的，步骤2）中，所述渗透压冲击法为高渗液-低渗液冲击法，即将人角膜基质材料先置于高渗液中，浸泡2～6h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入低渗液中浸泡3～5h，使细胞快速溶胀，细胞膜和核膜破裂。
进一步优选的，所述高渗液为1.5mol/l的nacl溶液；所述低渗液为三蒸水。
作为优选的技术方案的，步骤3）中，所述酶消化处理为使用含有dna酶和rna酶的pbs或hbss缓冲液，处理的温度为25～35℃，处理时间为1h。
进一步优选的，所述缓冲液中dna酶和rna酶的浓度均为500～1000u/ml。
作为优选的技术方案的，步骤4）中，所述漂洗与修复，漂洗的次数为2～3次，漂洗时间为每次2～5h。
进一步优选的，所述漂洗修复所用的修复液的溶剂为三蒸水，修复液的组分中含有0.8～2%（m/m）的透明质酸、1.0～2.5%（m/m）的硫酸软骨素和0.5～2.5%（m/m）的低分子量右旋糖酐。
作为优选的技术方案的，步骤5）中，所述灭菌，采用钴-60或电子束辐照的剂量为15～25kgy。
本发明的有益效果：
本发明角膜基质材料来源于全飞秒激光屈光矫正手术取出的人角膜，相对于合成材料以及猪角膜来说，同种异体间角膜移植再利用无论从生物相容性还是伦理学上都具有优越性。
本发明的制备方法脱细胞完全，对角膜基质胶原无损伤，可最大程度保护角膜基质的生物学特性并有效地去除基质细胞。首先，改进传统脱细胞方法的不足，采用渗透压冲击法破碎细胞，使细胞溶胀破裂的同时，能够很好地保持角膜基质的组织生理结构及胶原纤维的形态，避免了反复冻融或高静压超声破碎所造成胶原断裂而损伤组织张力；其次，采用核酸酶处理，有效的去除细胞的dna和rna成分，使脱细胞处理安全彻底，避免了使用表面活性剂等化学试剂脱细胞时对组织造成的毒性作用；另外，本发明在人源角膜基质脱细胞前处理阶段使用的pbs或hbss缓冲液中含1％（v/v）青霉素-链霉素-两性霉素b(100×三抗)混合溶液，可以有效杀灭细菌和真菌，防止操作过程中细菌和真菌的污染；最后，脱细胞的最后环节采用修复液进行漂洗加修复，在清洗角膜细胞残留的同时，对角膜胶原纤维具有保护作用，可以使角膜去水肿，促进角膜创口的自我修复，更有利于保持角膜基质的原始微观结构和透明度，能更好的满足临床需要，并且保护角膜基质有助于角膜组织的湿态保存。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例为制备脱细胞人源角膜基质，包括步骤如下：
1）脱细胞前处理：将收集的来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于配制好的洗涤液中清洗2次；每次冲洗时间为3min；所述洗涤液为含1％（(v/v)）青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液（100×三抗）的pbs缓冲液，其可洗去飞秒激光手术来源的角膜基质材料表面的宿主细胞，同时可以抑制细菌、真菌的滋生，避免处理过程中的污染几率。
2）细胞破碎处理：采用高渗液-低渗液的渗透压冲击法使人角膜基质材料上残留的细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的dna及rna成分；即将人角膜基质材料先置于高渗液中，浸泡3h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入低渗液中浸泡3h，使细胞快速溶胀，细胞膜和核膜破裂。本实施例中所用的高渗液为1.5mol/l的nacl溶液；所用的低渗液为三蒸水。这种方法避免了反复冻融或高静压超声破碎所造成胶原断裂而损伤组织张力，也避免了使用表面活性剂等化学试剂脱细胞时对组织造成的毒性作用。
3）酶消化处理：采用dna酶和rna酶的联合作用，去除细胞破裂释放的dna及rna成分。本实施例中，使用含有dna酶和rna酶的hbss缓冲液对细胞破碎处理后的人角膜基质材料进行酶消化处理，处理的温度为30℃，处理时间为1h。缓冲液中dna酶和rna酶的浓度均为800u/ml，可以更充分有效的去除细胞的dna及rna成分，达到脱细胞的目的。
4）漂洗与修复：采用配制好的修复液对人角膜基质材料进行漂洗，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口；所述修复液的组分中含有1%（m/m）的透明质酸、1.5%（m/m）的硫酸软骨素和2%（m/m）的低分子量右旋糖酐，其溶剂为三蒸水，在清洗角膜细胞残留的同时，透明质酸、硫酸软骨素及低分子量右旋糖酐对角膜胶原纤维具有保护作用，可以使角膜去水肿，促进角膜创口的自我修复，更有利于保持角膜基质的原始微观结构和透明度，能更好的满足临床需要，并且保护角膜基质有助于角膜组织的湿态保存。所述漂洗的次数为2次，漂洗时间为每次3h。
5）灭菌：采用钴-60或电子束辐照对人角膜基质材料进行灭菌处理，辐照的剂量为20kgy，完成制备，获得脱细胞人源角膜基质。
实施例2
本实施例也是制备脱细胞人源角膜基质，操作如下：
将收集的来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于配制好的洗涤液中进行脱细胞前处理；该洗涤液为含1％（v/v）青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液（100×三抗）的pbs缓冲液，清洗次数为3次；每次冲洗时间为2min。
然后采用渗透压冲击法对人角膜基质材料进行细胞破碎处理，使其上残留的细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的dna及rna成分；将人角膜基质材料先置于高渗液中，浸泡5h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入低渗液中浸泡5h，使细胞快速溶胀，细胞膜和核膜破裂。本实施例中，所述高渗液也为1.5mol/l的nacl溶液，所述低渗液为三蒸水，但不限于三蒸水。
然后采用dna酶和rna酶的联合作用对人角膜基质材料进行酶消化处理，去除细胞破裂释放的dna及rna成分。本实施例中采用600u/ml的dna酶和900u/ml的rna酶的pbs缓冲液对细胞破碎处理后的人角膜基质材料进行酶消化处理，处理的温度为32℃，处理时间为1h。
接着进行漂洗修复，采用配制好的修复液对人角膜基质材料进行漂洗。所述修复液中含有1.5%（m/m）的透明质酸、1.5%（m/m）的硫酸软骨素和1.5%（m/m）的低分子量右旋糖酐，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口。漂洗次数为2次，漂洗时间为每次4h，至此已经获得了完整的脱细胞人源角膜基质。为了进一步保证该脱细胞人源角膜基质的使用或长期保存的安全性，本实施例还对该脱细胞人源角膜基质采用钴-60或电子束辐照进行灭菌处理，辐照的剂量为18kgy，最后完成制备过程，获得脱细胞人源角膜基质。
实施例3
将收集的来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于含1％（v/v）青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液（100×三抗）的hbss缓冲液中，清洗3次；每次冲洗2min。然后将人角膜基质材料先置于1.5mol/l的nacl高渗液中浸泡2h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入三蒸水低渗液中浸泡3h，使人角膜基质材料上残留细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的dna及rna成分。然后采用含有1000u/mldna酶和500u/mlrna酶的pbs缓冲液对人角膜基质材料进行酶消化处理，温度为25℃，处理时间为1h，去除细胞破裂释放的dna及rna成分。接着将人角膜基质材料放入修复液进行漂洗修复，漂洗次数为3次，漂洗时间为每次5h。所述修复液中含有2%（m/m）的透明质酸、2.5%（m/m）的硫酸软骨素和2.5%（m/m）的低分子量右旋糖酐，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口。最后将人角膜基质材料于钴-60或电子束辐照下进行灭菌处理，辐照的剂量为25kgy，完成制备过程，获得脱细胞人源角膜基质。
实施例4
将收集的来源于全飞秒激光屈光矫正手术的人角膜基质材料置于含1％（v/v）青霉素-链霉素-两性霉素b混合溶液（100×三抗）的hbss缓冲液中，清洗2次；每次冲洗3min。然后将人角膜基质材料先置于1.5mol/l的nacl高渗液中浸泡6h，待细胞内外渗透压达到平衡后移入三蒸水低渗液中浸泡5h，使人角膜基质材料上残留细胞的细胞膜和核膜破裂，释放出其含有的dna及rna成分。然后采用含有500u/mldna酶和1000u/mlrna酶的hbss缓冲液对人角膜基质材料进行酶消化处理，温度为35℃，处理时间为1h，去除细胞破裂释放的dna及rna成分。接着将人角膜基质材料放入修复液进行漂洗修复，漂洗次数为3次，漂洗时间为每次2h。所述修复液中含有0.8%（m/m）的透明质酸、1.0%（m/m）的硫酸软骨素和0.5%（m/m）的低分子量右旋糖酐，清除破碎细胞的残留组织同时修复人角膜基质材料的创口。最后将人角膜基质材料于钴-60或电子束辐照下进行灭菌处理，辐照的剂量为15kgy，完成制备过程，获得脱细胞人源角膜基质。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。