专利名称：稳定的冻干聚血卟啉醚/酯组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种在光动力疗法中有用的含有对肿瘤选择性的卟啉化合物的冻干组合物。更具体地说，本发明涉及一种含有如已知的PHOTOFRIMⅡ 的聚血卟啉醚/酯制剂的冻干的组合及其冻干制剂的生产方法。
采用卟啉及有关化合物的光动力疗法，若干年代已在此领域为人们所熟知。早在本世纪四十年代，人们就已知卟啉在肿瘤组织中具有发萤光的能力。卟啉看来能定位在肿瘤组织之中，在哪里被照光时，它们能吸收一定波长的光线，从而提供了一种通过荧光的定位而探测肿瘤的手段。因此，含有此类卟啉的制剂，对于诊断和检查这种肿瘤组织是很有用的。而且，当以适当波长光照射时，此卟啉化合物还可能破坏肿瘤组织，这可能是通过单氧(SingletOxygen)的生成。(Weishaupt，K.R.，etal.，CancerResearch(1976)pp.2326-2329)。
在对肿瘤进行全身性的治疗时，这些吸收光线的化合物，尤其是与卟啉相关的化合物已广泛被用作为肿瘤治疗的一个方面。这些化合物的实用性是取决于它们在瘤组织中的定位能力，而这种组织与周围的正常组织界限分明(参见Dougherty，T.J.etal.，“Cancer∶PrineiplesandPracticeofOncology”(1982).V.T.deVita，Jr.etal.，eds.，pp.(1836-1844)。
除了全身性地用于肿瘤治疗之外，更多的新的出版物详述了卟啉化合物的另一些用途。例如，美国专利第4，753，958号叙述了在治疗皮肤病中的卟啉的用途。美国专利4，727，027号揭示了，用对光敏感的化合物对含有诸如细菌和病毒的传染性有机体的生物样本进行灭菌处理方法，其中，光敏剂有呋喃香豆素(farocumarin)及其衍生物。如美国专利4，512，762号和4，574，682号所述，光敏卟啉对检查和治疗动脉粥样硬化斑是很有用的。此外，美国专利4，500，507号和4，485，806号中还描述了采用放射性示踪的卟啉化合物用于肿瘤成像。
一种被广泛应用于早期阶段的肿瘤检查和治疗的光动力疗法的光敏制剂是一种血卟啉的粗制衍生物，也叫血卟啉衍生物HpD或如Lipson等人在J.Natl.CancerInst(1962)26∶1-8中所述制备的Lipson衍生物。采用这种制剂已进行了大量的研究，同时采用这种衍生物治疗恶性肿瘤也已作了广泛地报道(CancerRes.(1978)38∶2628-2635;J.Natl.CancerInst.(1979)62∶231-237)。
Dougherty和他的合作者制备了一个更有效形式的血卟啉衍生物，它是通过HpD的超滤作用以减低分子量分子的含量而制得。这项工作是美国专利4，649，151号的主题，我们特此通过参考形式引入本发明。本发明进一步详细描述了采用那些所描述的组合物，以光疗治疗患者的方法。这种形式的药物实际上是一种由醚键(Doughterty，T.J.etal.，Adv，Exp.Med.Biol.(1983)160∶3-13)和酯键(Kessel，D.etal.，Photochem.Photobiol.(1987)36∶463-568)连接的卟啉单位的复杂混合物。这个复杂混和物，此处称为聚血卟啉醚/酯(“PHE”)，已在商标名称PHOTOFRINⅡ下上市，它是本发明的主题。
目前，所提供的PHE是在正常的生理盐水中含有PHE的2.5mg/ml或5mg/ml的溶液中，这种PHE受热时迅速降介，因而在室温下相对来说是不稳定的。从而，此溶液必须保持冷冻状态以维持其效力。而且，在较高温度下，此溶液倾向于显示出大量粒子形成，除非被保持在冷冻并在使用之前随时溶解，这种较高的温度使此溶液变得不适于用作注射制剂。
然而，此种冷冻溶液的应用有许多缺点。因为，此冷冻液必须被保持冷冻状态，并必须以冷冻状态才能被装运和储存，因而需要一个特殊的冷冻条件。例如，此产品必须放在使用诸如干冰之类物作为冷冻剂的特殊的容器里被装运，这是一主要的缺点，它增加了使用此产品的成本和后勤工作量。在使用温度上，冷冻的溶液须被贮存于-20℃，而此温度低于某些冷藏箱的操作温度，因而需要一个特殊的致冷设备。另外，此冷冻产品必须经过一个溶解阶段，因而不可能立即用于患者。
这样，人们就需要一个PHE的配方，它在室温下可长期保持稳定，无须保持冷冻，从而无须特殊的运输和贮藏的条件。
该领域技术人员知道，冻干一个在水溶液中相对不稳定的制品将能得到一个稳定的，因而其货架寿命比水溶液更长的制品。从而，一个冻干制品的优点超过粉状产品，因为它在注射服用之前可迅速溶解，并容易于重新构成。冻干在水溶液中不稳定的制品的又一个优点是，它能够以液态被加工并被灌入剂量容器内，在低温下干燥，从而消除不利的热效应，并可在干燥状态(在那里可能更稳定的)被储存。(见Remirgtio'sPharmaceuticalSeiences，Isfhedition.，pp.1483-1485(1975)。因此，冻干法将是一种取得在室温下具有所需要的稳定性，因而无须冷冻保藏的PHE配方的理想方法。
Weinstein等人在美国专利第4，753，958号中揭示了一个治疗牛皮癣和其它皮肤疾病所用的血卟啉衍生物的典型配方，它是通过由冻干PHE的5mg/ml盐水溶液，并在一个适当的典型载体中重新构成而制备的。
尽管冷冻干燥此冷冻PHE盐水溶液可能对制取适用于典型应用的制品是有用的，本发明者发现，在冷冻干燥此盐水溶液时会遇到一些问题。这些问题使配方很困难，所得的产品难于接受为注射用。当试图冷冻干燥一种含有15mg/mlPHE和5.4%氯化钠的浓缩盐水溶液时(此氯化钠数量需要在与水重构成产生一种等渗溶液，用于注射用的2.5mg/mlPHE溶液)，会发生PHE活性组分的部分沉淀(盐析)。另外，作为沉淀的结果，浓缩物的过滤极为困难，需要经常调换过滤器。同样，一些活性组分在过滤器上被除去。这样，此冻干制品是不同质的，它包括了分离的氯化钠和PHE相。这两个相可能由于差速结晶作用而在冷冻过程之中产生分离。
再者，一种包含2.5mg/mlPHE的盐水溶液可被冷冻干燥，而此冷冻干燥过程将相当长，因为有较多的水要除去，且，由于溶液中存在氯化钠，同样会遇到过滤和沉淀中的问题。
因而，很明显，这里需要提供一个在室温下长期很稳定，从而无须冷冻的PHE配方，但它能够克服冻干此盐水溶液所伴随的问题。
本发明的目的之一是提供一种配制在水溶液中相对不稳定的PHE的方法，以致生产出一种在室温下可长期稳定的产品。
本发明的另一目的是，提供一种PHE制剂，它是同质的，且适用于注射。
本发明的再一目的是，提供一个冷冻干燥PHE溶液的方法，它可以避免在冷冻干燥PHE盐水溶液中所伴随的问题。
由以下实施例可见，本发明的这些和其他目的和优点，对于此领域技术人员将是显而易见的。
本发明在于发现了一个PHE光敏剂组合物，它在室温下是长期稳定的，并可以通过冷冻干燥法获得。本发明还基于下列的发现与冷冻干燥PHE盐水溶液相关的问题可由以下措施避免即从此溶液中除去氯化钠和从此水溶液中冷冻干燥PHE，然后与非盐水稀释液如5%葡萄糖注射液重新组合。
人们惊奇地发现，一个可在室温下长期稳定的聚血卟啉醚/酯制剂，可以通过从一种非盐水溶液中冷冻干燥此光敏剂和与一种非盐稀释液重组冷冻干燥制品而配方制得。本发明提供了一种制备冷冻干燥PHE的方法，由于其起始量较小而可快速完成，并避免了PHE成分的沉淀，最终导致产生一种物质的制品。
本发明的PHE活性组分及其制备方法的详细描述可见于上述美国专利4，649，151号。
根据本发明，冷冻干燥的PHE制剂是从一种在水中含约15mg/ml的PHE的浓缩物制得。这个浓缩物然后经过冷冻干燥处理，所得到的产品适于储存和运输。此冷冻干燥制品在使用前，与足够的非盐稀释液，如5%的葡萄糖注射液重新组合，以提供一2.5mg/ml等渗溶液，用于患者的诊断与治疗。
在本发明的一个最佳实施例中，约5ml的约15mg/ml的PHE浓缩物，被放于适于冷冻干燥的管形瓶之中。这样，每个管形瓶带有每瓶有75mg聚血卟啉醚/酯标签。接着每个5ml管形瓶被放进一个冷冻干燥室冷冻足够的时间，至使产品温度保持-35℃或更低，以完成此制品的冷冻。然后，此制品放在一升高的棚架温度下冷冻干燥，直至获得一种具有令人满意的含水量的制品，随之冷冻干燥室恢复到正常气压，然后对管形瓶进行密封。由于初始装瓶量很小(5ml)此制品通常在24小时内被迅速冷冻干燥。与冷冻干燥大量的稀释溶液来说，这就大大地降低了成本。这种所得到的制品可在室温下保存6个月以上而不会产生任何效力的降低。在用于给患者治疗前，此冷冻干燥制品用30ml5%的葡萄糖注射液重新组合，以提供一种25mg/ml等渗溶液。
用于重组冷冻干燥制品的稀释液最好是5%葡萄糖注射液，但其他非盐稀释液，如用于注射的消毒水也可应用。
此冷冻干燥制品与通常的盐水重组并用0.2μm的滤器过滤时，在光学显微镜下可观察到大量的无益的微粒。当此制品与葡萄糖注射液重组时，也观察不到有明显的粒子形成。因而，人们希望应用一种非盐稀释液。
在本发明的此制品的形成中，可以期望包括其他的组分。按照需要，这些组分可能包括有，影响溶液pH值的缓冲剂，湿润剂或乳化剂，抗菌剂或防腐剂。非电介的填充剂，如甘露糖醇或葡萄糖也可包括在内并被用于改善冷冻干燥饼状制品的特性。根据前面的详细说明，对上述的组分连同其他合适的载体进行各种改进对于此领域的技术人员来说是能够联想到的。所有这样的明显改进都是属于附属权利要求的范围之内。
以下的实施例子显示出此冷冻干燥制剂和与现用的冷冻溶液作了比较。这些例子并不被解释为对本发明权利要求中所述的范围的限定。
实施例1按照Dougherty在美国专利4，649，151号中所描述方法，可以制备一种含约15mg/ml聚血卟啉醚/酯的浓缩的PHE水溶液。对此浓缩液冷冻保存，并在冷冻干燥前以3℃(±2℃)的冷水浴使其缓慢溶解。然后对此溶解的浓缩液进行称量、并倒进一个已称出皮重的避免光照的玻璃混合容器。然后对这种溶液进行混合直至均质。
一旦获得均质的混合液，如有必要，可测出溶解的批量浓缩物的pH值，并以5%的盐酸或5%的氢氧化钠水溶液将其pH值调节至pH7.2-7.8。然后，此浓缩液用二阶段过滤法进行灭菌过滤，这二阶段过滤法包括一个0.45μm的聚偏二氟乙烯预滤器，随后用一个0.2μm的同样型号的灭菌过滤器。
在浓缩液的过滤完成之后，按瓶签每瓶75mg的量，装入30ml的管形瓶中。然后，这些管形瓶被放入冷冻干燥室。对此灭菌浓缩液冷冻至少2小时使产品温度为-35℃或更低。然后，在棚架温度为+35℃下被冷冻干燥，直至此制品温度达+20℃-+25℃，此温度保持5小时。然后，以脱水氮排气使冷冻干燥恢复至大气压温度，对管形瓶加上盖子，并从冷冻干燥室取出封口。
在给患者作光动力疗法之前，管形瓶内容物与30ml的5%葡萄糖重组，以备注射用。
实施例2在KarlFischer测定法中所测定含水量小于1%的冷冻干燥PHE是根据实施例1的方法，并再加上一个步骤制得的，即，在此制品保持在+20℃-25℃5小时后，再提高此制品温度到33℃-37℃，并保持制品在此温度6-10小时。然后，此冷冻干燥室如实施例1所述恢复到大气压，接着对管形瓶加上塞子并密封。
实施例3按照实施例1方法制备冷冻干燥PHE。然后在一个变化的温度和时间间隔下，用高压液相色谱法(HPLC)，在下述条件下，测试此制品的稳定性。
流动相A四氢呋喃、甲醇、含0.02%冰醋酸的水的1∶1∶1的混合液，用NaOH将其pH调节为5.0-5.1。
流动相B含90%的四氢呋喃的水溶液。
柱超球体ODS，5微米微粒，尺寸150×4.6mm(Beckman)。
温度环境温度(室温)流速1.0ml/分注射量20mcl检测方式在410nm紫外线吸收溶解程序一100%流动相A，直至原卟啉峰被完全洗脱(约9.5
-13分钟)。
-与100%流动相B线性相关1分钟。
-100%流动相B，直至PHE被完全洗脱(约16-25分钟)。
-与100%流动相A线性相关3分钟。
-注射之间，用100%流动相A至少平衡5分钟。
其结果列于表(1)表1冷冻干燥PHEPHE含量，HPLC面积百分比条件批量一批量二批量三批量四批量五始初量100.00100.00100.00100.00100.00-20℃，6摩尔95.295.698.7--3℃，3摩尔95.295.6100..9101.0100.2\3℃，6摩尔93.992.898.9--23℃，1摩尔95.293.798.996.596.6\23℃，3摩尔93.493.393.594.794.7\23℃，6摩尔93.093.793.0--37℃，1摩尔93.292.793.693.492.6\37℃，3摩尔90.189.989.792.491.4\在相似条件下，PHE冷冻溶液的HPLC稳定性测试数据，展示了表(2)所列结果表2冷冻干燥PHEPHE含量，HPLC面积百分比条件批量一批量二批量三初始量100100100-20℃，6摩尔92.9101.3-+5℃，3摩尔83.293.485.25℃，6摩尔81.486.984.15℃，9摩尔77.181.977.925℃，3摩尔82.491.283.825℃，6摩尔86.493.987.825℃，9摩尔77.191.588.8对表(1)和表(2))所列的数据进行的检验表明，本发明的冷冻干燥PHE组合物显示了比冷冻液具有更大、更长久的稳定性，在室温下，其效力至少可保持6个月之久。
实施例4根据实施例1制备的冻冷冻干燥PHE，并以一个HIAC计数器测试其粒子数。获得下列结果。
表3冷冻干燥PHE粒子分析＊每个容器(30ml)的粒子数稳定性批号条件批量一批量二批量三批量四批量五初始量---2003003℃，3摩尔---4003003℃，6摩尔46001400500--23℃，3摩尔---40040023℃，6摩尔57001500600--所有粒子数量代表粒子≥10μ＊由PIAC仪器所测定以电阻率法血液计数器对冷冻溶液进行颗粒分析列于表(4)。
表4冷冻干燥PHE粒子分析＊每个容器(30ml)的粒子数稳定性批号条件批量一批量二批量三初始量-1163--20℃，6摩尔20394184605+5℃，3摩尔63721666445555℃，6摩尔9565287687160
5℃，9摩尔19406427302110425℃，3摩尔14059184571051925℃，6摩尔102115332974225℃，9摩尔321971433823501＊以Coulter计数器(电阻率法血液计数器)进行测定对上述数据进行检查显示了，冷冻干燥制品将把颗粒形成水平保持低于可注射的USP规格之下即每个容器不超过10000个粒子，其粒径大于或等于10微米。而冷冻溶液则显示了温度在-20℃之上，时间间隔低到3个月，有大量粒子形成。
实施例5根据实施例1所制得的冷冻干燥PHE是用T.Dougherty等在《J.N.Canier Inst》55∶115所揭示方法作生物活性试验。根据此方法，由“供应者”DBA/2HA小鼠取得的SMT-F肿瘤可被植入到DBA/2HA小鼠作试验。在肿瘤植入后，带肿块尺寸为4×4mm至6mm×6mm的10只小鼠被选出，并以用冷冻干燥PHE与5%葡萄糖水液重组而制得的PHE溶液(4.2mg/ml)注射入其腹膜内。注射后24小时，用氙弧灯，在相当于光强度为157.5mw/cm2的距离，以630纳米红光照射此肿瘤30分钟，光强度可由测光强计测得。经过结果说明照射后7天、10天试验鼠中有一半或更多的鼠无肉眼可见的或可触摸到的肿瘤。采用重组的冷冻干燥PHE进行生物测定结果列于表(5)。
表5冷冻干燥PHE生物测定数据生物测定结果稳定性批号批量一批量二批量三批量四批量五初始量通过通过通过通过通过-20℃，6摩尔通过通过---3℃，3摩尔通过通过-通过通过3℃，6摩尔通过通过通过--23℃，1摩尔通过通过通过通过通过23℃，3摩尔通过通过-通过通过23℃，6摩尔通过通过通过--37℃，1摩尔通过通过通过通过通过37℃，3摩尔通过通过-通过通过使用如上述同样方法，PHE冷冻干燥溶液的生物测定结果列于表(6)。
表6PHE冷冻溶液粒子分析几批生物测定结果条件批量一批量二批量三初始量通过通过-
-20℃，3摩尔--通过-20℃，6摩尔失败通过--20℃，9摩尔失败通过失败5℃，3摩尔通过通过失败5℃，6摩尔失败失败失败5℃，9摩尔通过失败通过25℃，3摩尔失败通过通过25℃，6摩尔失败失败失败25℃，9摩尔通过失败失败从表5和表6的结果比较可见，本发明的冷冻干燥PHE在室温下，至少有6个月的间隔，在活体内试验中保持其生物活性，而在同样条件下，冷冻溶液则显示了其生物活性相当大的变化。
实施例6含有甘露糖醇作为填充剂的冷冻干燥PHE，是根据实施例1步骤，再加上一个量相当于PHE重量的甘露糖醇于玻璃混合容器的溶解浓缩物而制得。
实施例7含有葡萄糖作为填充剂的冷冻干燥PHE是可按实施例6的方法，并以葡萄糖替代甘露糖醇而制得。
权利要求
1.一种药学组合物，其特征在于它包括一种对肿瘤组织具光毒性的，血卟啉衍生物成分的冷冻干燥制剂，其中，所说的冷冻干燥制剂不含有氯化钠。
2.权利要求1所述的组合物，其特征在于，其中所说的血卟啉衍生物成分是血卟啉醚和酯的混和物。
3.一种发荧光的，对光敏感的，比起在正常组织来，能够较长时间集中和滞留在肿瘤组织之中的生物活性冷冻干燥组合物，其特征在于，它包括两个或更多的共价键连系的卟啉分子，其中，所说的分子至少有一些包含一个或更多的乙烯基基团，而且所说的冷冻干燥组分不包括氯化钠。
4.根据权利要求1所述的基本上由冷冻干燥组合物所组成的药学组合物，其特征在于，此冷冻干燥组合物作为活性组分与药学上可接受的赋形剂相结合。
5.根据权利要求1所述的冷冻干燥药学组合物，其特征在于，其中含有小于1%的残余水。
6.一种生产用于患者的光动力疗法或诊断的冷冻干燥组合物的方法，其特征在于，它包括，制备一种对肿瘤组织具有光毒性的血卟啉衍生物的组份的水溶液，其中，所说的水溶液不包含氯化钠，及对所说的水溶液进行冷冻干燥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，其中，所说的血卟啉衍生物组份是由卟啉醚和酯的混合物组成。
8.一种制取用于患者的光动力疗法或诊断的冷冻干燥组合物的方法，其特征在于，它包括下列步骤(a)制备一种不包含氯化钠的聚血卟啉水溶液;(b)降低所说的水溶液的温度，直至所说的溶液完全冷冻，并(c)在一个升高的温度下冷冻干燥此冷冻溶液，直至获得具有满意的残余水含量的产品。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中，所说的冷冻溶液在大约+35℃的升高温度下被冷冻干燥，直至获得温度大约为+20℃-+25℃的制品，然后，将此制品的温度保持约5小时。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，其中，冷冻干燥组合物含水量＜1%，该方法包括一个附加步骤，即在保持此制品温度在约+20℃-+25℃约5小时之后，提高此制品温度为约+33℃-37℃，并保持所说制品的温度约6-10个小时。
全文摘要
本发明涉及对肿瘤选择性的可应用于光动力疗法的卟啉化合物的稳定冷冻干燥组合物，以及制备该组合物的方法。
文档编号A61K9/14GK1047973SQ9010436
公开日1990年12月26日 申请日期1990年6月5日 优先权日1989年6月14日
发明者B·E·黑格, J·R·劳脱, V·H·纳林格里克, M·C·克苛罗 申请人:夸特拉逻辑技术有限公司