专利名称：联合用药的雌激素－雄激素－孕激素口服避孕药的制作方法
技术领域：
本发明涉及本发明广义地涉及了药物制剂领域并且特别涉及到口服避孕药的领域。具体而言，本发明涉及年轻的口服避孕药使用者中峰骨质(peak bonemass)的自然增长。
2．现有技术在美国，由于十三岁到十九岁年龄段的受孕率相对较高，所以有关儿科及青春期妇科专家经常建议年轻妇女采取一些避孕方式来预防意外妊娠(避孕报告，1995)。青少年中最常见的避孕方法是口服避孕药，这占性行为群体的近46％。因此，几乎半数的绝经前女性(＜44岁)在她们骨胳仍处于成熟且未达到峰骨质之前就可能已服用了口服避孕药，峰骨质是在大约30-35岁时出现。峰骨质是一项用于描述骨密度所能及的最高点的术语。就妇女而言，她们的骨密度在约30-35岁前不断增加但在其余生却缓慢减少。该峰值被当作峰骨质。由于骨密度在晚年降低，所以更容易发生骨质疏松症或骨折。因此，尽可能达到较高的峰(骨质)值对于预先防止上述问题的发生很重要。
在绝经前妇女中，雌激素虽然是维持骨密度所必需的，但雄激素的作用或它们的联用效果是不确定的。通常认为，低剂量雌激素在少女体内是有效的骨胳生长促进剂并且可能提供主要的生长刺激，而在少男中，雌激素可以和睾酮一起参与快速生长(Kulin,1991)。然而，某些近期的迹象表明，雄激素在女性及男性中对骨骼的构筑及维持都起重要作用。在青春期期间，雄激素影响骨骼的生长及峰骨质，但在青春期以后、青春期期间以及成年早期，雄激素也参与骨质的维持。峰骨质直至30-35岁才能达到(Recker等人，1992)，但成人身高的15％及骨骼质量的48％是在青春期时期达到的。
不幸的是，口服避孕药疗法(如卵巢切除术)会导致雄激素水平的急剧降低，因此口服避孕药通常用来治疗妇女多毛症(Carr等人，1995)。患有雄激素过多症(hyperandrogenemia)的年轻妇女表现为促黄体素(LH)的升高以及游离睾丸素/总睾丸素比值(fT/T)的增高，以及性激素-结合球蛋白(SHBG)血清水平的降低。低剂量口服避孕药可减轻激素失调及雄激素过多症(Yamamoto和Okada,1994；Rosenfield和Lucky,1993)。令人感兴趣的是，口服避孕药疗法不仅降低雄激素过多症妇女的血清A、T及fT，并且口服避孕药疗法中的雌激素(E2)水平也显著降低。
在用于抑制排卵的首批口服活性类固醇中，一些本来就具有雌激素活性而随后发现某些孕酮制剂与雌激素有染。这表明，雌激素提高了孕激素的抑制活性从而导致了两者混合物的普遍应用。Rock、Pincus和Garcia最先就通过使用孕激素药来抑制排卵进行了综合性调查。研究表明，只要需要就可以令排卵停止并且这具有极强的规律性(Rock等人，1957；Pincus,1960)。所用化合物是从19-去甲睾酮衍生的，这些化合物是在月经第5至25天口服给药。
最常见类型的口服避孕药是联用制剂，这种联用制剂中同时含有雌激素和孕激素。这些制剂的应用经验表明它们中99-100％有效。因此，这种可逆避孕法最有效并且仍在开发中。其它有关类固醇避孕法的改进也已尝试成功。顺序用制剂在作为口服避孕药时已能够达到约98-99％的成功率，在顺序用制剂中，雌激素需摄入14-16天并在其后摄取5或6天的雌激素与孕激素的混合物。但是，由于有报导认为子宫内膜瘤发生率的增加以及较低的有效性，此类顺序用制剂业已从市场上消失。取而代之的是含有雌激素及在月经周期内可改变的相对低剂量的孕激素的产品。在表1中列出了二期及三期顺序用的口服避孕药制剂。人们正在试图研制激素给予量更低的此类制剂，从而降低副作用的发生率及严重性。
已有许多人体研究验证了口服避孕药的使用与骨骼健康之间的关系。Tuppurainen等人(1994)用BMD(骨无机物密度)来研究口服避孕药对绝经中的妇女(48-60岁)的影响。29％的妇女是口服避孕药的曾经使用者。口服避孕药的使用者(n=939)比未用药者(n=2283)具有略微高(但呈统计学显著性)的腰BMD。在1968至1990年间进行了涉及更多受试对象的研究(皇家学院普通开业医师对口服避孕的研究，n=46,000妇女)并对口服避孕药的应用与随后首次骨折的发生率(包括头骨骨折、肋骨骨折及多发性骨折)之间的关系进行验证，受试对象是已婚或同居妇女(Cooper等人，1993)。在对年龄、经产状况、吸烟及社会经济阶层进行调整后发现，曾服用口服避孕药的妇女比从未使用过口服避孕药的妇女相比，她们继发骨折的危险性极高(相对危险率1.20)，因此，这种极其前瞻性的研究建议，口服避孕药的使用并不能长期促进骨骼健康，而且甚至会受到骨折风险的危害。
当多数人体内研究已深入到绝经后妇女人群中时，一些研究对“更年轻”女性表现出关注，这些人群还未达到峰骨质。在对156位绝经前女性(年龄在20-30间)的纵深研究中，Recker等人(1992)发现口服避孕药的使用与全身骨质之间存在正性关系，但与腰椎(L2-L4)或前臂的骨质无关。Lindsay等人(1986)报导了从2个横切片(cross-sectional)试验中取得的结果，其中一个试验涉及57位年龄在25-35岁间的健康绝经前妇女，其中的24人已服用了不止6个月的口服避孕药(30或50mg炔雌醇和炔诺孕酮)。在研究期间受试对象无一摄入口服避孕药。先前的口服避孕药使用与腰椎内BMD的增加有关，但与挠骨的无关。第2个横切片试验表明，与24个年龄相当的参照对象相比，在14位绝经后妇女中口服避孕药的使用与腰椎BMD无关。
在对60位24-35岁间的妇女进行的横切片研究中，Kanders等人(1984)发现，口服避孕药的使用者(使用多于5个月)比未使用者具有显著高的腰椎BMD。Goldsmith和Johnston(1975)于1969至1970年期间在一个大型横切片试验中对不同妇女群体就口服避孕药的使用与挠骨远侧无机物之间的联系进行了试验，那时，多数年龄为20-29岁间的口服避孕药使用者服用美雌醇(n=219)而相对较少的对象服用炔雌醇(n=47)。高剂量美雌醇的应用(＞100mg/天)与挠骨质量的增加有关，而炔雌醇(50或100mg/天)的使用与挠骨质量之间的关系在白种女性(n=65)中表现为无关而在黑人女性(n=11)中呈负性相关。
Stevenson等人(1989)发现在112位年龄为21-52岁(中间年龄=34.1)的绝经前妇女中，在某些位置口服避孕药的使用与骨密度无关，其中包括腰椎。但是，在172位年龄在28-68(中间年龄=53.4)的绝经后妇女中，这些相同位置的骨密度与口服避孕药的使用呈正性相关。Mazess和Barden(1991)在对200-300位年龄在20-39岁间健康妇女的研究中发现，口服避孕药的使用与脊柱、挠骨或股骨颈的BMD无关。近期，Hansen(1994)研究了249位年龄在21-51岁(17位小于30岁)间的绝经前健康妇女并报导说，口服避孕药的使用与骨骼多处位置的骨密度无关，但是可观测到，口服避孕药的当前使用者与从未用药者相比其BGP显著降低(＜32％)。
在最近的研究中，使用口服避孕药的年轻女性在超限时间仍未达到脊柱骨密度(Carr等人，1995)。根据他们的报导年龄(平均年龄26±1s岁)并利用Recker等人(1992)提出的回归线，研究中多数女性的骨密度应在研究期间已经增加，并且止于正平衡。此外，Teegarden等人(1995)调查了口服避孕药的使用与年龄在18-31岁间的妇女的运动间的相互作用，令人惊奇地是，6个月后，运动并使用口服避孕药的妇女损失大量的脊柱骨无机物密度(BMD)，而不运动但口服避孕药的妇女却获得显著量的脊柱BMD。但没有关于激素的血清内浓度的报导(Teegarden等人，1995)。上述结果提出了严重后果。若年轻女性进行运动并服用口服避孕药则无法在其青春期和成年早期(15-30岁)生长骨骼，她们将仅达到比预期值低的峰骨质。因此，有关年龄段的及绝经后的骨损失将对骨质造成极大影响，同时骨折阈值在其一生中可能会较早地到来。
因此，特别是十三岁到二十几岁间的女性急需那些可以有效防止意外妊娠并仍能保证达到正常峰骨质的口服避孕药。
发明概述本发明将全面描述用于口服避孕的新组合物及方法。本发明的这些组合物及方法提供了超过以往口服避孕方法的改善作用，其中，雄激素被包含在确定的制剂中，目的是减少口服避孕药的年轻使用者骨骼自然增长的降低。本发明人着重认为，含雌激素口服避孕药的年轻使用者不能获得如同她们在未服用口服避孕药时所能达到的处于峰骨质(约30-35岁)的高骨矿化水平。这种影响将产生例如骨质疏松症或以后生活中的骨折的问题。本发明人还认为，这种作用可以通过在口服避孕药制剂中添加雄激素来进行拮抗，尤其是在那些用于未达到峰骨质女性的制剂中。但是，任何年龄的口服避孕药使用者都可以用这此类制剂来恢复更自然的雌激素/雄激素平衡。
本发明可以从广义的角度来描述作为避孕药的制剂，该制剂包含有效量的雌激素和孕激素和雄激素而且用于减少口服避孕药使用者骨质增加的损失。雄激素可以是任何已知的适合在口服避孕药制剂中采用的雄激素，优选是睾丸素(睾酮)，更优选甲基睾丸素。常见的代表性雄激素如表2所示。应理解的是，任何适合口服避孕药的上述制剂都在本发明的实施中有效。还应明白，含雄激素的雌激素/孕激素避孕药的应用可以以任何其它的形式给药，例如作为植入剂或大量浓注用的注射剂也属于所附权利要求书的范围。
剂量应取决于给药对象对节育制剂中雄激素存在的生理反应，并应由处方医师来监控。例如，特定对象(例如运动员)可能需要她们的血清睾丸素水平不受到影响。因此，医师应在约每三个月的时期监控血清睾丸素，以确定例如口服避孕药制剂中含有恰当的睾丸素水平。此外，我们考虑避孕制剂可以有三种或更多种的雄激素水平，因此医师应根据口服避孕药使用者体内血清睾丸素水平的变化来开出较高或较低的雄激素制剂处方。本发明人发现，青春期直至约30-35岁年龄的女性在使用含有雌激素和孕激素口服避孕药时将出现骨自然增长的某些降低。本发明组合物将提高骨的自然增长，换言之，将减轻与此年龄组女性使用口服避孕药有关的副作用。无论是所述的提高作用还是减轻作用都是对现有技术的改进，即使未达到正常峰骨质。然而，本发明的目的是使口服避孕药的使用者恢复接近正常或等于正常的骨骼自然增长及同等程度的峰骨质。
本发明的某些制剂中将在每个日剂量中含有约0.2mg-约1.5mg的甲基睾丸素。例如，制剂可以含有0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5mg/日剂量。用术语“约”0.2-1.5mg表示略微超出该范围的剂量也是有效和安全的，并且此类制剂也属于本发明权利要求的范围内。含有甲基睾丸素的制剂优选在月经周期的第8-13天间给药，以与月经周期中自然出现的睾丸素水平增加相吻合。例如，已知在正常月经周期的该阶段睾丸素和雌激素水平都会增加。含有雄激素或睾丸素的组合物还优选含有雌激素及孕激素用于避孕。优选在每个日剂量中孕激素是以约0.050mg浓度存在的左炔诺孕酮并且所述雌激素是以约0.03mg浓度存在的炔雌醇。
本发明的一个实施方案可被描述成一种口服避孕药制剂，该制剂包含第一组合物并且该第一组合物含有在月经周期第8天至约第13天每天给药的甲基睾丸素与左炔诺孕酮和炔雌醇。该避孕药制剂还包含第二组合物并且该第二组合物含有在第一组合物给药完毕后的第14天至约第18天每天给药的左炔诺孕酮和炔雌醇。上述制剂还可以被规定成包含第三组合物的制剂，而且该第三组合物含有在第二组合物给药完毕后月经周期的约第19天至约第28天每天给药的左炔诺孕酮和炔雌醇。该制剂可以进一步包含在月经周期第1-7天服用的安慰剂组合物。应认为，优选在第8-13天服用第一组合物，在第14-18天服用第二组合物并在第19-28天服用第三组合物。但是，应将该给药时间理解为这些制剂的最佳给药时间，而对该给药时间进行略微的改变也不违反本发明的范围及宗旨。第一组合物可以进一步被定义成在其每个日剂量中含有约0.2mg-1.5mg甲基睾丸素和约0.05mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇。优选将第二组合物定义成为约0.075mg左炔诺孕酮和约0.04mg炔雌醇/日剂量。可以进一步将第三制剂规定为约0.125mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇/日剂量。
本发明还在某些实施方案中公开了含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.05mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇/日剂量的口服避孕药组合物。在特定的实施方案中，本发明为配制如下的28片的口服避孕药组合物6片含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.05mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮和约0.04mg炔雌醇的片剂；和，10片含有约0.125mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇的片剂；并且组合物还可以含有约7片的安慰剂片剂。应理解的是，任何在此描述的组合物的安慰片剂可以含有铁、钙、维生素、无机物或其他有益添加物，目的在于增加口服避孕药使用者的营养。
本发明的一个实施方案中还提供一种提高受试者骨自然增长的方法，其中该受试者服用含雌激素的口服避孕药并且未达到峰骨质。该方法包括向服用口服避孕药的受试者给予雄激素。在该方法的优选实施方案中，雄激素在月经周期第8-13天的每天中以约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素的量给药。本发明还提供一种避孕方法。该方法包括给予受试者一种制剂，该制剂含有在月经周期第8-13天服用的约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.05mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇；此后，在月经周期第14-18天服用的约0.05mg左炔诺孕酮和约0.04mg炔雌醇；和在月经周期第19-28天使用的约0.125mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇。
本发明的一个实施方案中公开了一种口服避孕药的整月用包装，该包装内包含7片第一组合物，该片剂含有在月经周期第1-7天时每天使用的安慰剂组合物。该整月用口服避孕药包装还包含6片第二组合物，该第二组合物片剂含有在月经周期第8-13天每天使用的约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.05mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇。该整月用口服避孕药包装还可以包含5片第三组合物，该第三组合物片剂含有在月经周期第14-18天每天使用的约0.075mg左炔诺孕酮和约0.040mg炔雌醇。该包装还可以包含10片第四组合物，该第四组合物片剂含有在月经周期第19-28天每天使用的约0.125mg左炔诺孕酮和约0.030mg炔雌醇。该整月用包装还包括带有28个隔室的分配器，每个隔室内包含一个口服避孕药组合物。典型的分配器内应包括28粒药，它们按预定顺序每天使用1粒。分配器的例子是在美国专利4,165,709、美国专利4,807,757、美国专利3,678,884或美国专利3,651,927中公开的那些(这些文献在此引入作为参考)。
本发明的另一实施方案中公开了一种整月用口服避孕药包装，该包装内包含7片第一组合物，该片剂含有在月经周期第1-7天时每天使用的安慰剂组合物。该整月用口服避孕药包装还包含6片第二组合物，该第二组合物片剂含有在月经周期第8-13天使用的约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.05mg左炔诺孕酮和约0.03mg炔雌醇。该整月用口服避孕药包装还可以包含5片第三组合物，该第三组合物片剂含有在月经周期第14-18天每天使用的约0.075mg左炔诺孕酮、约0.04mg炔雌醇和约0.2mg-约0.5mg甲基睾丸素。该包装还可以包含10片第四组合物，该第四组合物片剂含有在月经周期第19-28天每天使用的约0.125mg左炔诺孕酮、约0.030mg炔雌醇和约0.2mg-约0.5mg甲基睾丸素。该整月用包装还包括带有28个隔室的分配器，每个隔室内包含一个口服避孕药组合物。
除非另有说明，在此所用的技术和科学术语都具有本发明所属领域技术人员所能理解的常规含义。虽然，任何类似或等同于本文所述方法和材料的都可以在本发明的实施及试验中采用，但优选的方法和材料将在此说明。
发明详述本发明为年轻的避孕药使用者提供了用于预防意外妊娠并保证骨质正常自然增长的口服避孕药，从而使那些使用者能够获得最佳峰骨质。因此，本发明是一种可防止某些与雌激素/孕激素口服避孕药有关的副作用发生的安全口服避孕药，所述副作用包括使用者在其余生由较低峰骨质导致的易于患骨质疏松症的危险性，而这种较低的峰骨质是由于未达到峰骨质前已使用雌激素/孕激素口服避孕药造成的。本发明提供的组合物是最适宜30岁以下用户使用的口服避孕药，但本发明组合物也可以有效预防所有绝经前妇女的妊娠。
本发明源自下列发现口服避孕药阻碍非人类的年轻雌性灵长类骨骼的正常自然增长，并且这种阻碍作用归因于内源性雄激素水平的受抑制。该动物试验强有力地说明在年轻妇女(15-30岁)中也可产生同样的副作用并具有相同的机理(雄激素水平的抑制)。骨骼自然增长的减弱妨碍了最大峰骨质的获得，因此导致骨质疏松症在使用者余生中的高危性。年轻女性中存在的骨质低自然增长问题是由于目前含有雌激素和孕激素的标准口服避孕药制剂引起的。本发明组合物除含有雌激素和孕激素外还另外含有雄激素，从而本发明组合物表现出特有的使骨骼正常自然增长并达到正常峰骨质的有益作用。雌激素/孕激素口服避孕药的制剂和剂量表1列出目前仍用作口服避孕药的一些制剂。所列的联合制剂类含有0.02-0.05mg炔雌醇或美雌醇以及不同含量的孕激素，而且此类制剂需服用21天。下一疗程在末剂量使用后的7天后或行经开始后的5天后开始。应注意，炔雌醇的有效性几乎是美雌醇的两倍。
顺序用制剂被配制成在两个(二阶段)或三个(三阶段)连续阶段内服用的制剂。二阶段制剂中，需服用10天剂量固定的雌激素与孕激素的混合物，随后再服用11天不同固定剂量的雌激素与孕激素的混合物。药粒在周期性给药重新开始前中断7天。三阶段制剂在其中的三组片剂中含有相同量或不同量的雌激素以及可变量的孕激素。每组片剂需服用5-10天，这取决于具体的制剂。给药21天后，药物在周期性给药重新开始前需中断7天。
表1一些口服避孕药的组成及剂量雌激素(mg)孕激素1(mg) 代表性商品名联合用制剂20.02炔雌醇1.0乙酸炔诺酮LOESTRIN 1/200.03炔雌醇0.3炔诺孕酮 LO/OVRAL0.03炔雌醇1.5乙酸炔诺酮LOESTRIN 1.5/300.03炔雌醇0.15乙酸炔诺酮 NORDETTE0.035炔雌醇 0.4炔诺酮OVCON 350.035炔雌醇 0.5炔诺酮BREVICON0.035炔雌醇 1.0双醋炔诺醇DEMULEN 1/350.035炔雌醇 1.0炔诺酮ORHTO-NOVUM 1/350.05美雌醇1.0炔诺酮ORTHO-NOVUM 1/500.05炔雌醇0.5炔诺孕酮 OVRAL0.05炔雌醇1.0双醋炔诺醇DEMULEN 1/500.05炔雌醇1.0炔诺酮OVCON 500.05炔雌醇1.0乙酸炔诺酮NORLESTRIN 1/500.05炔雌醇2.5乙酸炔诺酮NORLESTRIN 2.5/50顺序用制剂30.03,0.04,0.03炔雌醇0.05,0.075,0.125左炔诺孕酮TRI-LEVLEN0.035炔雌醇 0.5,1.0,0.5炔诺酮 TRI-NORINYL0.035炔雌醇 0.5,0.75,1.0炔诺酮ORTHO-NOVUM 7/7/70.035炔雌醇 0.5,1.0炔诺酮 ORTHO-NOVUM 10/11微丸4-- 0.35炔诺酮MICRONOR-- 0.075炔诺孕酮 OVRETTE交媾后用药物5己烯雌酚1在所用的孕激素中，炔诺孕酮略呈雄激素活性，而其他孕激素具有极小的雄激素活性。2联合用片剂需服用21天并中止服用7天。这些制剂按照雌激素量增加的次序列出。3此类制剂包含剂量固定的片剂并且这些片剂具有相同量或不同量的雌激素以及可变量的孕激素。对于二阶段制剂，第一组片剂需服用10天并且第二组片剂服用11天，随后中止服药7天。对于三阶段制剂，各组片剂按照三个顺序阶段分别服用5-10天，随后停药7天。4“微丸”连续每天服用。5己烯雌酚在交媾后72小时内以25mg的剂量每日服用2次并连续5天。
许多避孕制剂是分配在常规的日程表式容器内以协助使用者计算天数。有时为了排除计数的需要，可以将7片空白药粒掺入到包装内，从而提供3周的治疗及1周的非治疗。无论月经何时开始或停止需每日服用1丸。一些制剂的“空白”粒中含有铁。
“微丸”(例如MICRONOR和NOR-QD，含有0.35mg炔诺酮；及OVRETTE，含有75μg炔诺孕酮)需连续每天使用。由于有效性较低而且在给药期间仍可能怀孕，患者应在经闭若持续45-60天以上时中止服用“微丸”，同时应去检测是否妊娠。此外，如果患者遗忘了服用一个或数个药粒并已停经45天以上，它们同样应检测是否妊娠。雄激素的制剂及剂量表2概括了一些临床使用的雄激素肠胃外制剂和口服制剂。雄激素疗法已主要应用于改善和/或维持第二性征。雄激素已可通过肌肉内制剂给药，此外还可以口服。本发明的雄激素包括但不限于是表2列出适用于口服避孕药组合物的那些。
表2非标准名称 商品名实例剂型和常用剂量睾丸素 Testoject-50TM肌肉内使用的含水悬浮液10-50mg，每周三次丙酸睾丸素 TestexTM肌肉内使用的油溶液10-25mg，每周2-3次庚酸睾丸素 Delatestyl 肌肉内使用的油溶液每2-4周50-400mg，环戊丙酸睾丸素 Depo- 肌肉内使用的油溶液每2-4周50-Testosterone 400mg癸酸南诺龙 Deca- 肌肉内使用的油溶液每3-4周50-Durabolin 100mg苯丙酸南诺龙 Durabolin 肌肉内使用的油溶液每周50-100mg，用于治疗乳腺癌炔睾醇 Danocrine 胶囊每日200-800mg氟羟甲睾酮 Halotestin 片剂每日2.5-20mg去氢甲基睾丸素Dianabol 片剂每日2.5-5mg，用于骨质疏松症甲基睾丸素 Metandren，片剂和胶囊剂每日10-50mg；Oreton Methyl 口腔片每日5-25mg氧甲氢龙 Anavar 片剂每日2.5-20mg羟甲睾丸素 Anadrol-50 片剂1-5mg/kg·每天用于贫血症吡唑甲基睾丸素winstrol 片剂每日6mg睾内酯 Teslac 片剂250mg，每日四次，用于乳腺癌雄激素对骨骼的作用不受任何特定理论的限制，口服避孕药使年轻女性峰骨质降低的机理基于下列考虑。由卵巢产生的初级甾类物质是雄甾烯二酮(A)，睾丸素(T)和雌二醇(E2)是它在周边的衍生物。循环内高比例的雄激素可能来自于卵巢，这是由于卵巢切除术后血清T和A降低(50％),(Adashi,1994；Hughes等人1991)。a)体外细胞的证据雄激素受体是在成骨细胞类细胞内被识别(Colvard等人1989,；Wiren等人，1995)并且可以在骨细胞内调节钙通道(Takeuchi和Guggino,1995)。此外，雄激素还刺激成骨细胞的分化及增殖(Kasperk等人，1990)。b)雄激素作用于动物模型骨骼的证据据信，不论对于女性还是男性，雄性激素在构建和维持骨骼方面都起一定作用。抗雄性激素药物，氟他胺，抑制了对生殖腺及肾上腺雄激素的应答。在完整雌性大鼠中给予氟他胺(口服15mg/kg/d)会诱发骨质稀少。有完整卵巢的雌性大鼠中的骨更新也受到影响，通过检测骨骼45Ca的变化发现，氟他胺-介导的雄激素不足型骨薄化主要是由骨形成减少引起(Goulding和Gold,1993)。近期，上述发现被在完整雌性大鼠体内再现，其中，雌性大鼠每天给予非甾类抗雄激素纯品(Casodex)并持续3周。干骺端的骨体积以及骨的纵向发育都与赋形剂处理的完整雌鼠类似。但是，动力学组织形态法(histophometry)表明，Casodex处理的大鼠中的骨形成速率明显降低(Flanagan等人，1995)。
雄激素对骨骼的直接影响发生在卵巢切除大鼠接受雄甾烯二酮的情况下并通过减少骨的更新来预防卵巢切除术诱发的骨质稀少。在老龄卵巢切除大鼠中进行二氢睾丸素(DHT)的测试，这是由于DHT与睾丸素类似并都与雄激素受体结合，但与睾丸素不同的是，DHT并不使雌激素芳香化。在老龄卵巢切除大鼠中，DHT与雌二醇都具有拮抗卵巢切除术诱发型骨质稀少的防护作用。
在白尾鹿鹿茸脱落后立即将甾类抗雄激素环丙孕酮进行肌肉内给药，这可以诱发(a)血浆内睾丸素水平的戏剧性减少，(b)雄鹿中伴随鹿角彻底矿化的早熟灌制(casting)，和(c)在矿化不完全的鹿角内骨重建活性发生更新，因此阻断了灌制(Bubenik等人，1987)。
雌猴中进行的激素处理对其机体组成及骨无机物状态都产生影响(Jayo等人，1989)。在采用以硅橡胶作为植入物的激素疗法1年后，全体安慰剂组的猴子与全体接受(A+雌酮(E1))的猴子或接受睾丸素的猴子相比，它们在腰椎骨质和全身骨骼方面都要低。和另外两组猴子相比，睾丸素处理组猴子的体重增加得最明显，但雄激素处理组的胫骨强度和皮质密度显著提高(Kasra和Grynpas,1995)。c)雄激素作用于妇女骨骼的证据根据近期在西班牙报导的一位妇女患有雄激素感觉迟钝症的一个病例中，显示出女性骨状态中需要适当雄激素刺激的直接证据。该年龄为17岁的女性具有不良的骨密度及水平增高的雄激素。医师用雌激素治疗该少女，但她对雌激素疗法缺乏反应，由此推断出雄激素刺激甚至在青春期以后都很重要(Munoz-Torres等人，1995)。Daniel等人(1992)研究了吸烟对20-35岁年轻妇女(25位吸烟者，27位非吸烟者)的影响。两组间的骨无机物密度没有区别，但两组的SHBG及游离雄激素指数(T/SHBG)都在骨密度变化中发挥出有效作用(P＜0.05)。
青春期黑人妇女比青春期白种妇女具有更高的骨密度及更高水平的血清睾丸素(Wright等人，1995)。在对老龄黑人妇女的研究中发现，她们的骨质比老龄白人妇女要高。在该老龄组，体重指数(kg/m2)及E1与骨质有关，而雄激素则无关。在各种族中，骨质随血清E1浓度的增高而呈线性增加(Cauley等人，1994)。此外，老龄白种妇女体内游离睾丸素水平(fT)而不是总的T水平与她们脊柱、髋部及腕部的骨密度相关(Greendale等人，1995)。所以，生物活性物fT的水平是随年龄而越密切地与骨质相关。
在早期的研究中，21-48年龄段内的妇女的小梁骨密度仅仅与血清A密切相关(Buchanan等人，1988)。在具有正常血清雄激素水平的妇女中，皮质骨密度与血清总T及生物活性物fT有关。理论上，这种皮质质量的提高应有助于防止余生骨折的发生。内源性雄激素对骨密度产生合成作用同时在雄激素过量的妇女体内小梁骨密度(脊柱)明显增高(Buchanan等人，1988)。绝经前妇女体内性激素-结合球蛋白(SHBG)、硫酸二氢表雄甾酮(dihydroepiandrosterone sulfate)(DHEAS)、雄激素类与骨质之间的相互关系业已被发现(Johnston等人，1993)。游离睾丸素是在全部被测位置与骨质关系最密切的雄激素。d)口服避孕药作用于绝经前的猴子和妇女骨骼的作用的证据为测定口服避孕药疗法对骨密度及骨代谢血清标记的影响，本发明人对年轻的成年雌性cynomoglus猴进行了纵向预见性研究。将207只完好的猴子分成两组并用不含药物(对照)或含有三阶段口服避孕药试剂盒(Triphasil)的致动脉粥样化的食物饲养。
对骨密度及血清骨生物标记物在处理前和处理后定期检测。预处理数据变量中没有明显差别。两组动物的骨无机物密度(BMD)在试验中皆有增加，这表明它们未曾达到它们的峰骨质。在整个试验过程中Triphasil-处理的动物与对照动物相比，其腰椎骨无机物的增加较少，导致其腰椎骨无机物密度在20个月后与对照组差别显著。对纵向数据的重复测量分析表明，经10和20个月的处理后，Triphasil-处理组动物的全身骨无机物含量(BMC)以及脊椎的BMC和密度比未处理的完好对照组动物明显降低。
Triphasil处理组的血清碱性磷酸酶(ALP)显著降低，同时其血清酸性磷酸酶(ACP)及钙虽然降低但程度较小。该结果表示，以三阶段口服避孕药处理未达到峰骨质的年轻成年雌猴将因降低其骨更新速率而抑制骨的净自然增长，该作用的结果是使这些动物的峰骨质较低。
用于解释上述发现的一种机理是骨吸收与骨形成之间的平衡被改变，由此骨形成弱于骨吸收。事实上，口服避孕药疗法中引起40％骨形成(血清ALP)标记物的减少而对骨吸收标记物仅引起极小的变化(ACP降低10-15％且对TRAP的作用极其微弱)。因此，口服避孕药疗法可使骨形成减少的程度比骨吸收的要大，结果是经处理年轻动物的骨净自然增长比月经周期未经处理的雌性动物低。
该理论的另一解释是骨更新率存在一个最佳区间(optimumwindow)，高于或低于该最佳范围时将不足以维持骨骼。所以卵巢切除的cynomolgus猴表现为骨更新率提高。如同妇女，与未处理对照动物相比，用雌激素替代疗法(使用或不使用醋酸甲羟孕酮)处理的卵巢切除动物会因此发生骨吸收和骨形成标记物的减少以及脊椎BMC和BMD的增加。
本发明人进行的口服避孕药研究揭示出在不同情况下，未达到峰骨质的年轻猴子在骨更新减弱的同时还平行发生骨无机物自然增长的降低。绝经中及绝经后妇女可能遭受骨损失，这符合增高的骨更新率，而雌激素替代疗法通过降低骨更新率来抑制这种骨损失。
绝经期妇女在接受口服避孕药时，虽然血清骨钙蛋白(骨gla蛋白[BGP])并未变化，但羟脯氨酸尿排泄物减少而同时椎骨BMD显著(p＜0.001)增加(Gambacciani等人，1994)。但是，与正常状态相比，健康的绝经前青春期妇女及动物中骨更新率的降低可能伴随有骨无机物净自然增长的降低，这将最终导致峰骨质的降低。
在持续1年的预见性研究中，以年龄在20-30岁间的19位妇女为对象就口服避孕药对骨代谢的影响进行了研究，所用口服避孕药含有20μg炔雌醇+0.150mg去氧孕酮。在试验结束时，骨密度仅表现出轻微的而非明显的增加。尿内羟脯氨酸/肌酸酐的比例及血清ALP水平都显著降低。该结果揭示出虽然使用了口服避孕药的年轻女性的远端挠骨骨密度并未显著增加，但骨吸收已减弱(Maris等人，1993)。
上述试验开始时所采用的动物的平均年龄据牙列估算已为6岁龄。这约是此类物种生长板(growth plate)闭合的时间，但该年龄还未达到峰骨质的9岁龄(Jayo等人，1994)。虽然女性在少年期已达到性成熟，但由峰骨质反映的骨骼成熟期并未达到直至约30岁(Recker等人，1992)。在骨骼成熟方面，上述年龄的猴相应于15-30岁龄的女性。所以，上述结果揭示出口服避孕药对接近成熟的骨骼的影响，但已达到峰骨质的情况不包括在内。但是，骨更新的抑制与骨无机物自然增长之间的关系不可能仅与动物仍处于生长期的原因有关，因为处理组的躯干长度数据并未明显改变。药物组合物应了解，本发明配制的药丸可以含有作为填充剂、粘合剂及用于编号着色的成份。这些成份是现行口服避孕药制剂中常用的，其中包括但不限于乳糖、玉米淀粉、磷酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、硬脂酸、胶态二氧化硅、羟丙甲基纤维素、聚乙二醇以及一种或多种下列染料FD&C蓝No.1色淀、FD&C蓝No.2铝色淀、D&C绿No.5、D&C黄No.10、FD&C黄No.6或FD&C红No.3。当然这些仅仅是填充剂和染料的例子，该领域专业人员应了解其他适用于本发明制剂的制备的惰性成份。
雄激素副作用在较高剂量条件下可能会显现。患者和医师很容易发现并检测出的早期副作用包括痤疮及多毛症(尤指妇女多毛症)，出现上述两种副作用时应考虑将剂量减少。若在早期及时发现，则上述症状很容易逆转。重度多毛症、变声、肌肉质量改变等是更严重的雄激素过量副作用，应根据早期检测并及时调整剂量来避免这样的严重副作用发生。为将副作用降至最低，建议对骨质自然增长产生有益作用的最低有效剂量为1.25mg/天。但是应理解为，医师应根据特定需要来决定各个病例所需的较高或较低剂量。
所有本发明所述的制剂都可以由专供一个月使用的分配器提供。典型的分配器应按预定顺序提供28粒药丸以供每天服用一丸。分配器实例为在美国专利4,165,709、4,807,757、3,678,884或3,651,927中公开的那些，(这些专利在此引入作为参考)。分配器或分配方式本身并不构成本发明，并且，任何将药丸分成独立包装并提供一种以特定次序将药丸每次1粒地进行分配从而使用户了解具体某天应服用某粒药丸的分配方式均可被接受。一盒中还可以装有一个月或多个月用的分配器；诸如，在一个纸盒内例如装有产品资料和/或使用说明书。分配器还可以被装在装饰性的箱子内，目的是使其不作为节育药丸分配器而被立刻辨认出来。动物试验的方法雌性cynomolgus猴在激素对骨代谢的作用的试验中是适宜的动物模型。此类猴子在月经周期的时间长短及周期期间激素的变化方面都与女性类似(Mahoney,1970)。此外，卵巢切除的猕猴在应答雌激素替代疗法时，骨骼变化的方式与在绝经后妇女中的方式类似(Jerone等人，1994)。在整个试验中，对骨密度、血清及尿内的骨更新标记物、血清内性激素、血脂、体重和重量分布、血压以及骨骼结构和形态学进行测定。在试验结束时，将对全部猴子进行尸体剖检并且对比各组的骨参数及冠状动脉粥样硬化(CAA)的程度。这种预见性试验是无法以人作受试对象的，原因是这种试验具有(人身)攻击性、费用高并且会由于无法控制的可变性导致并发症。
以试验为目的，将雌性猕猴分成3组第一组=完好的未处理对照组第二组=口服避孕药-处理组，口服Triphasil,OCTriphasil(妇女的剂量)第1-7天，无激素；第8-13天，0.03mg炔雌醇和0.05mg左炔诺孕酮；第14-18天，0.04mg炔雌醇和0.075mg左炔诺孕酮；第19-28天，0.03mg炔雌醇和0.125mg左炔诺孕酮。
第三组=口服避孕药-处理组，服用Triphasil加三阶段甲基睾丸素(MT)(Steraloids,Inc.Wilton,NH)Triphasil+MT(妇女的剂量)第1-7天，无激素；第8-13天，0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮和0.40mgMT；第14-18天，0.04mg炔雌醇、0.075mg左炔诺孕酮和0.60mgMT；第19-28天，0.03mg炔雌醇、0.125mg左炔诺孕酮和0.40mgMT。动物的获得以及起始数据从印度尼西亚的雅加达购得并进口100只年轻的成年(6-8岁龄)雌性cynomolgus猴。在以实验饮食饲养期间，根据法律要求对这些动物进行检疫。在为期一个月的基线阶段，利用体内骨光密度测定法和放射照相术检测骨异常。替换下患有骨骼异常或存在未闭合骺的动物。以机体测量法(体重和躯干长度)、骨光密度测定法、血清化学及血脂结果为依据将受试猴分成三个匹配组(如上所述)。用基线数据来校验各组为等值。处理24个月后，将全部动物尸体剖检，目的在于研究比较各组的骨骼结构、强度变化及CAA。
用于组织形态学检测(histomorphometric)分析的髂骨活组织检查是在基线以荧光染料标记后并在处理12个月后收集。在0、1、3、6、12、18和24个月时收集血样和尿样。在所有时间点(timepoint)测量血清及尿内的骨更新生物标记物。在0、6、12和24个月时测量腰椎、髋及猴的身长。在0、6、12、18和24个月时检测血脂并且在第12个月时进行LDL分子量测定。每6个月进行一次身体测量(体重、躯干长等)(在DEXA扫描时)。
统计学乘幂(statistical power)的计算(Dupont和Plummer,1990)是为了算出最小样品量，从而检测出任意两组之间在不同方法中的预期差异。骨无机物密度(BMD)、骨结构中的变异性估计值将利用组织形态学检测法进行评估(骨体积/总体积％[CnBV％])，本试验还计算出血清内骨代谢标记物(碱性磷酸酶，ALP)和CAA的内膜面积。表3列出调整的组规模(n)、可测差分、乘幂(power)、初级终点(primary endpoint)的双侧水平的显著性。
表3初级终点的数据变量可测差异 组(n) 幂双侧(β)(α)BMD 4％ 300.800.05CnBV％33％190.800.05ALP 23％240.800.05CAA 70％300.750.05在允许5％的年死亡率(基于本试验及长达24个月的处理；75只初始动物中存活67只)的前提下，将100只猴随机分成3个处理组的动物经2年的处理后共获得90只可评估动物。本发明人以那些临床似乎相关、生物可能合理的可测差分为目标，而这些是以表3所列的试验终点为基础，同时也合理地基于发明人在近期噻嗪(thiazide)研究中的发现(Jayo等人，1995)。饲养及饮食组成将猴子以每组4-5只的数量圈养在不限制行动和群体交往的室内围栏中(2.0×3.2×2.5m)。通过自动饮水装置随时供水。给猴子喂以适度致动脉粥样化的半纯食物。食物中含有43％得自脂肪的热量及0.30mg胆固醇/卡。这种饮食通常可预期诱发约200-400mg/dl的总血浆胆固醇浓度。该饮食含有2.5IU的维生素D3/g食物并且钙(Ca)/磷(P)的比例为1.0(207mgCa和206mgP/100g食物)。此物种适宜采用上述维生素D3量及Ca/P比。这种饮食已在CMCRC中采用(Jayp等人，1995)。试验方法是由动物保护和使用公共委员会建立的，整个试验过程全部符合州和联邦制订的法律以及Department of health and Human Services的标准。
将Triphasil(炔雌醇[EE]和左炔诺孕酮[LNG])加入上述饮食组合物中并给予第2组。将Triphasil+MT加入到上述饮食并给予第3组。饮食中加入适当剂量的药物并在如上所述的预定月份的某天投食。对照组(第1组)在整个28天的月经周期中以不添加激素的基础饮食喂养。筛选和取样紧随检疫期后，猴子将进入30天的基线阶段。在这一个月的期间内，收集血样和尿样以便分析骨更新标记物、血脂及激素检测。收集血样和尿样时对动物进行镇静(盐酸氯胺酮，15mg/kg，肌肉内)。通过检疫期观测到的月经周期来确定猴子是否具有正常卵巢功能，此后用阴道擦子来判断卵巢功能。利用放射照片来进行椎骨大小的测定、变形评分及病理筛选。利用DEXA检测BMC和BMD。同时进行身体测量，包括BW、躯干长度、皮褶厚度以及躯干和附肢的周长。完成上述检测后，将动物分成具有相当的骨无机物状况、身体测量数据、血清骨生物标记物及脂质特性的3个试验组。处理对照组的完整猴(intact monkey)接受不添加药物的食物。由完整猴组成的第2组动物接受24个月的Triphasil(Wyeth-Ayerst，一种三阶段口服避孕药)。第3组猴整体接受24个月的Triphasil+三阶段甲基睾丸素。之所以选择口服释药体系是由于该途径为妇女所采用并且另一原因是肝脏可以影响药物的代谢。需密切监测受试动物疾病的临床症状，并且如果需要，将添加物包含在饮食中给予各组动物。选择三阶段甲基睾丸素制剂是基于激素的正常节律水平(睾丸素/炔雌醇比例)并且该节律水平是通过观察雌猴动情周期获得(Wilson等人，1982)。所选用的MT剂量可在动情周期内产生与T相似的雄激素刺激。适用于绝经后妇女的较高剂量药物(Estratest,Solvay Pharmaceuticals,Marietta,GA)可能会在绝经前青春期女性中引起意外的副作用(Hickock等人，1993；Watts等人，1995)。常规健康状况一旦到达(试验)中心后，初步的体格检查将提供每只动物的健康及身体状况资料。若需要，可测定血液学参数及临床化学参数，其中包括全血计数及鉴别(defferentials)、总血清蛋白、白蛋白、血清葡萄糖、尿、氮、肌酸酐、钙和磷酸盐。尿分析样品和粪便样本可在需要时测定。建立一套雌性cynomolgus猕猴的正常参比值。用自动细胞计数器(库尔特计数仪M430,Hialeah,FL)进行全血计数，还进行了白细胞鉴别。在整个试验过程中检测CBCs、肝功能试验、总血清蛋白水平及葡萄糖。身体测量利用体重(kg)以及从胸骨上切迹至耻骨联合处的躯干长度来计算机体质量指数(body mass index)(BMI=BW/[TL/100]2)。还测出了三头肌、肩胛下、髂骨上、腹部、大腿中部、肩胛中部及胸廓皮褶厚度。同时测定腰、髋部、大腿和上臂的周长(cm)(Shicely等人，1987)。骨骼的光密度测定法在按上述方法用盐酸氯胺酮(15mg.kg,i.m)和马来酸乙酰丙嗪(0.15mg/kg,i.m)肌肉内麻醉的前提下，体内测定腰椎(L2-L4)、猴子全身及髋部的骨无机物含量及密度。骨密度是确定分组的基础并使所得结果能够与从人体临床试验获得的类似数据进行比较。DEXA扫描是在基线和第6、12、18和24个月时进行。血清和尿的骨生物标记物利用组织形态学检测法难于获得骨更新的真实且复杂的动态数据，尤其是骨吸收的。血清和尿的生物标记物在无需损伤性外科手术的条件下就可以提供一种经济实用的骨形成和骨吸收的检测途径。在基线和第1、3、6、12、18和24个月时分析血清和尿的骨生物标记物。用Cobas Fara化学分析器(Roche Diagnostics,Nutley,NJ)检测血清总ALP(骨形成)、ACP和耐酒石酸盐ACP(TACP，骨吸收)、钙及磷(Carlson等人，1992；Jayo等人，1995；Jerome等人，1994)。用已建成的放射免疫分析法来测定血清BGP(骨更新)。骨吸收还可以用FDA批准的N-端肽胶原分泌标记物(Osteomark,Ostex,Seattle,WA)来测定。绝经后妇女体内的Ⅰ型胶原交联N-端肽将降低至在接受6周雌激素替代疗法的绝经前妇女中观测到的水平(Hanson等人，1992)。激素测定利用Yerkes地区灵长类研究中心检测实验室(Yerkes RegionalPrimate Research Center’s assay Laboratory)建立的方法来测定睾丸素、游离睾丸素、甲基睾丸素、雌酮、雌二醇、炔雌醇、性激素-结合球蛋白及雄甾烯二酮在血浆中的浓度。检测MT是为了测定释药体系的有效性以及(若有的话)转化为T的有效率。血脂以Cobas Fara化学分析器(Roche Diagnostics,Nutley,NJ)并利用酶促技术来分析总血浆的胆固醇、甘油三酯及HDL胆固醇。同时还检测了LDL的分子量和组分。血压的测量及心电图在镇静状态下测量动物的血压。令动物右侧躺下并使其右臂趋向头侧方向直至右臂几乎垂直于身体纵轴。在从肩膀至肘部之间的中间位置测量出上臂周长，可以采用适当大小的套。检测收缩压、舒张压、心率(Castro等人，1981)。记录下上述检测数据的平均值。以利用了示波技术的Dinamap便携式成人/儿童及新生儿生命信号监视器(8100型)来非介入性地检测收缩压、舒张压及平均动脉压以及心率。该装置微机化地算出血压和心率并消除主观干扰(Corbett等人，1981)。用医学系统(Greendale,NY)的心电图描记器(MSC20001型)进行心脏病评估。心电图扫描器在动物背卧的状态下工作并记录下标准导联(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、AVR、AVL、AVF)和三个胸部导联(Ⅴ-1、Ⅴ-4、Ⅴ-6)。骨收集和组织形态学分析的方法荧光染料标记骨组织形态学检测需要预先在体内施用骨-搜索荧光染料标记物。在第1天对猴子接受灭菌静脉内注射并在随后的14天内令它静止休息，在第21天时进行第2次标记注射。7-10天后，采集活组织检查样品或尸体剖检样品。在三个骨采集时间点的每个时间点给所有受试猴使用下列骨-搜索荧光染料中的一种钙黄绿素(10mg/kg)、二甲酚橙(90mg/kg)或盐酸去甲金霉素(20mg/kg)，当然这些荧光染料仅是举例而其它荧光染料是所属领域专业人员已知的那些。
该类型方法的应用可以检测出动力学参数(Jerome等人，1994；Carlson等人，1992)。在不同时间点所测的骨形成率可能会出现差异，这是由于这些标记物的掺入速率不同(Goodwin和Jerome,1987)。通过在各时间点给予相同的荧光染料可降低在单个时间点组与组之间参比的变异性，但标记物掺入中可能的变化应被考虑在分析试验随时间发生的变化中。对标记物的间距及范围进行测定可以计算出骨形成率的结果，而使用不同荧光染料标记物可以鉴别出在先的骨矿化活性。髂骨的活组织检查从每只动物身上采集两份髂骨嵴活组织，每侧一份。基于获得的数据(表10)，卵巢切除的动物网状骨质的骨更新率是激素替代的动物的近两倍。所以髂骨嵴网状骨质骨骼每年被替代了50-100％。以一年为间期对髂骨活组织进行组织形态学分析，以便定性分析网状骨质的骨骼机能变化，这是由于大多数现存骨骼是在一年的间隔期内形成的。在基线时，无菌采集左侧髂骨嵴的活组织并且在开始处理后的第一年时采用右侧髂骨嵴的活组织。发明者开发的用于猴髂骨嵴活组织检查的方法为分析试验提供了具有足够骨面积和周长的皮质的及网状骨质的骨骼(Goodwin和Jerome,1987)。骨的组织学方法组织形态学测定将用于组织形态学检测分析的髂骨活组织及尸检骨骼标本固定在70％乙醇中、加工、嵌埋在异丁烯酸甲酯/邻苯二甲酸二丁酯中，采用下列的一种或两种方法进行切片1)用LKB Macrotome锤制显微切片刀或Jung Supercut旋转显微切片刀以5-10μm的厚度进行切片，并且用碱性甲苯胺蓝或改进的Von Kossa法将切片染色或未染色封固(mounte)；2)用Isomet锯(Buehler,Lake Bluff,IL)以100-125μm的厚度进行切片，在Faxitron柜(Hewlett-Packard,Rockville,MD)内进行显微放射照相，和/或粘着在载玻片上、抛光、按von Kossa法表面染色。
免疫细胞化学将所选的尸检样本固定在新制并且冷却的4％低聚甲醛中以维持样本的抗原特性，再实施下列方法中的一种或两种1)嵌入到异丁烯酸甲酯中，不脱钙；或2)在1％EDTA中脱钙，石蜡包埋，并连续切片，以便用于免疫细胞化学或就地的杂交试验。发明者开发的可靠技术确保了对骨骼相关蛋白质存在和/或生成的评估(Tulli等人，1992；Carlson等人，1993)。多个骨膜(bone envelopes)的标准组织形态学测定本试验采用改进的Parfitt(1987a)等所述方法。所用的测量结果和缩写基于ASBMR标准命名法(Parfitt等人，1987b)。结构及动力学参数分别来自于骨膜(Ps)、哈弗系统(haversian)(H)、内皮质(Ec)和网状骨质(Cn)的骨膜。同时还计算H+Ec和全部(Tt)结合骨膜的骨体积。这种分析试验用于分析骨内动力学(功能性)变化的初级值，它能够评估出皮质-骨内膜(cortical-endosteal)和网状骨质膜对于骨骼的大-和微-体系结构的相对作用。利用此方法，可以测定试验操作引起不同骨膜的结构变化的相对作用。该分析试验中包括的其它参数是有关侵蚀深度和壁厚的测量结果，而这些参数可用来判断每个重建周期中的骨平衡及激活频率(Cohen-Solal等人，1991)。该分析试验消耗时间，即使有自动的方法作协助，但它只能在每个骨切片的基础上完成。多个骨切片的自动组织形态学分析用Isomet锯切取股骨颈、股骨骨干、腰椎、远侧挠骨的多个横切片，将它们表面染色和/或显微放射照相，再以Apple Power微机并利用NIH图形分析系统来进行分析。显微放射照相的或von Kossa-染色的切片应具有足够强的对比度，这样根据用彩色照相机照出的图形灰度界限可以很容易区分骨与骨髓。可将分界的灰度图形转化为二元影像(可以用黑色和白色图形代表)，以便使检测快速并精确。尸体剖检和组织采集在DEAX扫描24个月后，用盐酸氯胺酮(10mg/kg体重)将动物镇静以便运往尸检实验室。静脉内戊巴比妥钠(13mg/kg体重)给药以使动物达到手术麻醉。将林格溶液经18号针导入到左(心)室内。静脉内注射5ml(325mg)戊巴比妥钠以实施安死术。在腹部下腔静脉处切出一纵向切口从而引流出心血管系统内的血液。切割下心脏和主血管，并在100mm/Hg的压力下灌注1小时的10％中性缓冲的福尔马林(NBF)。仔细地将心脏、主动脉、颈动脉和髂动脉切割分开，并浸固在10％的NBF中直至进一步的制备。取出包括颅内动脉在内的脑部并浸固在20％NBF中。粗粗地对所有主要器官系统进行检查。收集生殖的、内分泌的、心血管的及其它的软组织，固定在4％的低聚甲醛中和/或用液氮速冻，随后进一步仔细地评估因处理所致的变化。
在将软组织从屠体取出后，用高分辨率的DEXA对两个股骨头进行体外扫描，以描绘出局部的BMC差异，包括股骨颈、Ward氏三角和中骨干(皮质骨)的。将肱骨、右股骨及成对的腰3&4椎包在湿(林格液或盐水)纱布中，用签条标记，并置于适当的有标签的Ziploc袋中以便在-20℃下冷冻，需要时可用于进一步的研究。
将左挠骨、腰椎2和5及胸椎6-9固定在70％的乙醇中，以便用于组织形态学分析。将左股骨置于10％NBF中用于DEXA扫描，随后将其转移到70％的乙醇中。将两个膝盖固定在10％NBF中并随后置于70％的乙醇中，从而进行关节软骨和软骨下骨骼的关节评估。用Isomet锯将胸骨节及胸椎13纵向切片(1-3mm厚)(除去背弓及横突后)并固定在冷冻的4％低聚甲醛中。24小时后，将上述切片转移到40％的乙醇中。将上述切片进行免疫细胞化学(Tulli等人，1992)及就地的杂交。生物力学(biomechanical)实验对冷冻的骨骼进行生物力学骨折实验及骨强度分析。力学实验包括对股骨颈、肱骨中部骨干的三点结合处进行抗剪试验，对椎骨进行疲劳试验。冠状动脉粥样硬化评估为研究冠状动脉粥样硬化的范围及严重性，垂直于动脉的长轴切取15块样品(各长3mm)。其中的5块是从冠状动脉左卷曲得到的连续块，5块是从左前下行冠状动脉得到，而另5块是从右冠状动脉获得。高浓度乙醇处理以将组织块脱水，再包埋入石蜡中。从各组织块上切取两个切片(5μm)并用苏木精和曙红或Verhoeff-van·Gieson氏染色，随后进行形态学评估。将Verhoeff-van·Gieson氏染色的动脉切片用投影显微镜投影到数字转换器台(digitizer plate)上。用手持尖笔与计算机辅助数字转换器来描绘出动脉的组成部分。
对内膜面积、每单位长度的内弹性层的内膜面积、内弹性层中的内膜面积及冠状动脉腔面积进行测定。内膜面积的测定是通过将各冠状动脉切片的内弹性层与腔表面之间的区域进行数字化来算得。内膜面积的计算采用综合性方法。内膜面积可用斑的尺寸表示。为得到每单位长度的内弹性层的内膜面积，将内弹性层的长度按内膜面积划分。该测量结果提供了有关所取冠状动脉切片的大致平均内膜厚度的情况。内弹性层的长度(周缘)可用来计算面积。该测量结果用来定性测量动脉尺寸。还可测量外弹性层的面积，但有关其精确位置的原理还不像对内弹性层的了解得那么清楚。两者(内弹性层和外弹性层)的测量结果密切相关，因此，用内弹性层作为测量尺度。软组织评估对所有其它软组织的经福尔马林固定、石蜡包埋及苏木精和曙红染色的切片进行评估。数据分析及解释统计学方法由顺序抽样获得的数值(例如组织形态学测定、光密度测定、血清和尿化学检测)用重复测定方差分析(ANOVA)或协方差分析(ANCOVA)来进行分析，或采用适当的非参数方法。当需要参比任何两个数据点时，可采用适当的参数(t-统计)或非参数(Mann-Whitney或Wilcoxon)试验。利用回归及相关模型(参数及非参数的)来鉴定变量间的关系；例如，组织形态学测定及吸光分析测量之间的相关性。利用线性或曲线性的回归分析来鉴定随时间发生的变化率。此处所有参数分析采用Sokal和Rohlf(1981)的方法，并且所有非参数分析采用Seigel(1956)的方法。
下列实施例涉及说明本发明的优选实施方案的实施例。所属领域技术人员应理解，实施例中那些公开的技术内容是按照发明人开发的有代表性的技术，都是为使发明的实施易于进行，因此，可以认为发明的实施是由优选方式组成。但是，所属领域技术人员还应该了解，按照本发明公开的内容，这些具体实施方案还可以有许多改变并同样可以获得相同或相似的结果，但都不脱离本发明的宗旨及范围。
实施例1口服避孕药对灵长类动物骨代谢的作用动物若绝经前类固醇避孕药物(Triphasil)的使用对CAA的进展及手术绝经后的骨质疏松症有影响，则选用207只雌性cynomolgus猴(Macacafascicularis)作为临床对比实验中专用于受试的成员。动物的平均年龄(根据牙列判断)约为6岁龄，并且各组间无显著性差异(p＞0.040)。将207只动物随机地分成103只的未处理动物(对照)的组及104只口服避孕药(Triphasil)-处理动物的组。在此提供的数据将根据降低的倾斜度(斜率)以及使组方差相等的需要来进行变换，并将它们进行方差分析(AVONA)或重复测定的协方差分析(ANCOVA)。所有在此所示的数据代表未变换数据的平均值±SEM。利用重复测定的ANCOVA来分析从0、10和20个月获得的纵向骨光密度测定数据。以0月获得的数据(基线)来作为预处理(未处理)变量对照。
给药雌性cynomolgus猴消耗热量约是妇女平均热量的17％，或约306卡/天。基于估算出的120卡/kg体重(或一个成年妇女平均的1800卡/天)热量摄取量，计算口服避孕药剂量近似于人类的剂量来计算。所以，Triphasil-处理的猴子接受4种单独的制剂(第1-7天，无激素；第8-13天，0.03mg炔雌醇和0.05mg左炔诺孕酮；第14-18天，0.04mg炔雌醇和0.075mg左炔诺孕酮；第19-28天，0.03mg炔雌醇和0.125mg左炔诺孕酮)饮食中含有0.55IU维生素D3/卡(168IU/天)、1.75mg钙/(535mg/天)及1.49mg磷/卡(456mg/天)，钙/磷的比例为1.17。该水平的钙摄取量可换算成耗能1800卡/天妇女的3147mg钙/天，该水平是年轻女性钙推荐摄取量(1000mg/天)的三倍以上(参见Kanders等人，1988)，并且是绝经后妇女钙推荐摄取量(1500mg/d)的两倍多。饮食中的维生素D3水平相应于妇女推荐日剂量的约两倍。
骨光密度测定用Norland XR26的双能(dual-energy)X-射线吸收比色计(DEXA；Norland,Ft.Atkinson,WI)来测定腰椎(L2-L4)骨无机物的含量(BMCsp,g)及密度(BMDsp,g/cm2)和全身骨无机物含量(BMCw,g)。在0和处理10个月时将207只动物各扫描一次，其中的188只还在处理20个月后进行扫描。在所有时间点两组的BMDsp都没有显著的差异。两组的BMDsp在0个月时无显著性差异，但在10个月的Triphasil处理组却显著降低(p＜0.05)，并在处理20个月后继续显著降低。虽然BMCsp和BMDsp都随时间增加，但存在显著性组X时间的交互作用，这表明处理组的变化随时间而不同。
Triphasil动物在BMCsp和BMDsp方面比未处理对照动物在此期间增长得少。两组中的BMCw也随时间增加，并且同样存在显著性组X时间的交互作用。Triphasil动物在处理10个月后比对照组获得的BMCw要少。
血清生物标记物在处理前和处理期间每5个月的间期都需采集血清，用于评估骨代谢的循环标记物。取样是在激素给药的第21天进行。用Cobas Fara 11自动分析器来检测ALP(U/L)、ACP(U/L)、TRAP(U/L)、钙(Ca2+,mg/dl)和无机磷(Pi,mg/dl)，该分析器采用了由Roche Diagnostic Systems,Inc.(Nutley,NJ)提供的方法和试剂。在Triphasil组中，血清ALP水平比基线值降低了约43％，而在对照组中仅略微(12％)降低。在该试验的过程中，Triphasil处理动物的血清ALP活性近似等于对照组的55-60％。Triphasil动物中的血清ACP和Ca2+也显著降低，而处理对TRAP并没有显著影响，但从血清Pi水平中可观察出对循环的作用。所以，Triphasil组表现出减少的骨吸收(ACP)及骨形成(ALP)的生物标记物。
血清雄激素水平口服避孕药的使用引起了时间依赖型的抑制作用，该抑制作用导致血清DHEAS被抑制20-30％(p＜0.01)以及血清A的抑制；总T水平的显著降低，达到30-35％(P＜0.01)；并且fT降低了60％(p＜0.01)；但SHBG在第11和21天时升高200-240％(p＜0.01)。这些结果证明，雄激素水平及周围的雄激素代谢遭到深度抑制。(Wiegratz等人，1995；Kuhnz等人，1994)。
在对猴子的试验中，在第10和20个月时采集血清并检测总T、A和DHEAS。如表4所示，Triphasil组的血清雄激素水平是对照组的约半数。表4．绝经前猴子的血清雄激素浓度(平均±SEM)对照 Triphasil p-值T(ng/ml)0.367±0.0190.182±0.0090.0001A(ng/ml) 3.96±0.191 1.89±0.0920.0001DHEAS(μg/ml)15.43±1.06 12.09±0.860.015身体测量及光密度测量表5列出在不同时间点从两个处理组获得的身体测量及光密度测量结果(平均±sem)。从表5可看出，当取207只动物在第0和10个月的时间点及取188只动物在第20个月的时间点处采集光密度测量数据时，每组的观测数量在试验中随时间减少。由于该原因，应对各时间点分别进行分析。在任一时间点处，各组间在体重、躯干长、BMCw、BMCs方面都没有显著性差异。各组的BMDx在0时没有显著差异，但在第10个月时避孕组却显著性降低，并且在处理20个月后持续显著降低。
由于在第3个时间点(20个月)的观测(动物)数量减少，所以对第0和10个月的数据采用2×2方差分析法来进行分析。为了验证长期作用，通过对全部三个时间点的2×3ANOVA或将为预处理测量调整的第10和20个月时间点的2×2ANCOVA来进行数据分析。表5．对从服用安慰剂(对照)或避孕药(避孕)的207完整雌性cynomolgus猴在第0和10个月以及188动物在第20个月采集的身体测量数据及光密度测量数据在各时间点比较中的方差分析以及方差检验(ANOVA)。数值为平均±s.e.
对照 避孕 n p体重(kg)0月 2.80±0.042.89±0.04207 0.1510月2.89±0.042.97±0.04207 0.2020月2.89±0.042.99±0.04188 0.08干长(cm)0月 26.9±0.0127.0±0.01207 0.5910月27.0±0.0127.1±0.01207 0.4220月27.0±0.0127.2±0.01188 0.23椎骨L2-4的BMC(g)0月 4.23±0.084.27±0.07207 0.7310月4.54±0.084.46±0.08207 0.4620月4.63±0.094.50±0.08188 0.30椎骨L2-4的BMD(g/cm2)0月 0.476±0.006 0.473±0.005207 0.6510月 0.507±0.006 0.490±0.006207 0.0420月 0.515±0.006 0.494±0.006188 0.02全身BMC(g)0月111.5±2.1114.1±2.0207 0.7810月122.3±2.2122.6±2.0207 0.9120月123.8±2.5122.7±2.0188 0.72表6列出上述变量在0和10个月时的重复测定ANOVA结果。各组在基线时并无差别的体重在喂食中都发生显著增加。在前10个月结束时没有发现躯干长度受到组间的或时间的影响。但椎骨(L2-4)的BMC和BMD都随时间增高，并出现显著性组×时间的交互作用，这表明处理组随时间发生不同的变化。口服避孕药处理的动物在椎骨BMC和BMD随时间变化方面比未处理对照组增加的少。各组都表现出全身BMC随时间增加，并且也出现显著性组×时间的交互作用。处理10个月后，避孕药处理的动物获得的BMC要比对照组少。表6．对从服用安慰剂(对照)或避孕药(避孕)的207只完整雌性cynomolgus猴在第0个月(基线)及处理10个月后所采集的身体测量数据及光密度测量数据的重复测定方差分析。<
在0、10和20个月时获得的纵向身体测量和骨光密度测量的数据采用重复测定ANCONA法进行发现。0月(基线)时的数据用于对照预处理变量。还列出接受评估的动物在全部三个时间点处的数据的各平均值及标准偏差(表7和8)。与表5中的值相比略微改变，这是由于需消除不完全数据。在前10个月时显著增加的体重在第二个10月期间并未改变并且没有表现出组或组×时间的交互作用(表7)。两组中，躯干长度随时间增加的迹象较微弱，但没有观察到组或组×时间的交互作用。表7．从0、10和20个月时间点采集的完全身体测量数据的重复测定方差1和协方差2分析。
体重(kg)对照避孕(n=91) (n=97)0月 2.80±0.042.91±0.0410月2.89±0.043.00±0.0420月2.89±0.042.99±0.041〔无协方差〕，组的p=0.06；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.982〔协方差=0月时的BW〕，组的p=0.75；时间的p=0.59；组×时间交互作用的p=0.92躯干长 对照 避孕(cm) (n=91)(n=97)0个月 26.9±0.127.1±0.110个月26.9±0.127.2±0.120个月27.0±0.127.2±0.11〔无协方差〕，组的p=0.26；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.402〔协方差=0月时的TL〕，组的p=0.17；时间的p=0.01；组×时间交互作用的p=0.86在对预处理(0时)差别进行调整后，观察显著性组、时间及受时间影响组的腰椎骨无机物含量和密度(表8)。椎骨BMC及BMD在0和10月期间有所增加，但在10和20月期间增加的很少。与对照动物相比，避孕药处理的动物骨获得率要低，这导致在处理的10和20个月时椎骨BMC和BMD较低。同时还观察显著性组、时间及与时间的交互作用组的全身BMC。全身BMC在第一个10月时对照组和避孕药处理组都显著性增加，但在下一个10月时对照组略微增加而避孕药处理组略微降低。表8．从0、10和20个月时间点采集的完全骨光密度测量数据的重复测定方差和协方差分析(组平均值±sem)。协方差分析的调整平均值列在方括号内〔〕。椎骨BMC(g)0月 4.22±0.08 4.29±0.0810月4.52±0.08[4.56]4.48±0.08[4.45]20月4.62±0.09[4.66]4.50±0.08[4.46]1〔无协方差〕，组的p=0.78；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.002〔协方差=0月时的BMC(椎骨)，躯干长〕，组的p=0.00；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.00椎骨BMD(g/cm2)0月 0.476±0.006 0.473±0.00610月 0.506±0.006
0.491±0.006
20月 0.515±0.006
0.494±0.006
1〔无协方差〕，组的p=0.12；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.002〔协方差=0月时的BMD(椎骨)，BMC(椎骨)〕，组的p=0.00；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.03全身BMC(g)对照(n=91) 避孕(n=97)0月 111.4±2.0 115.0±2.010月122.0±2.2[123.8]124.0±2.0[122.4]20月123.8±2.4[125.5]122.7±2.0[121.0]1〔无协方差〕，组的p=0.61；时间的p=0.00；组×时间交互作用的p=0.002〔协方差=0月时的BMC(全身)，BMC(椎骨〕，组的p=0.00；时间的p=0.71；组×时间交互作用的p=0.00骨生物标记物表9列出血清生物标记物分析的结果。由于观测数量随时间发生了改变，所以对各时间点分别进行组比较。在避孕组中，血清碱性磷酸酶水平比预处理时(0时)的数值降低了约43％，而对照组中碱性磷酸酶水平比预处理时仅略微降低(12％)。在处理期间，避孕药处理的动物的血清碱性磷酸酶活性是对照组的约55-60％。避孕组的血清酸性磷酸酶及钙也有显著性降低，但对耐酒石酸酸性磷酸酶或血清磷酸水平都没有观测到相似的作用。所以，避孕组表现出降低了的骨吸收(酸性磷酸酶)和骨形成(碱性磷酸酶)血清标记物。表9．各时间点血清生物标记物数据比较的方差分析对照避孕n p=碱性磷酸酶(U/L)0月197.1±6.8 180.2±7.21800.0905个月 173.5±6.9 103.5±5.91130.00010个月 172.7±4.9 104.7±3.31740.00015个月 190.9±9.1 104.8±4.41710.00020个月 173.4±9.0 102.5±6.860 0.000酸性磷酸酶(U/L)0月8.39±0.21 8.47±0.251800.8205个月 8.35±0.31 7.89±0.321130.30710个月 8.90±0.23 7.89±0.171740.00615个月 9.01±0.22 8.11±0.181720.00220个月 8.72±0.35 7.07±0.35 590.002耐酒石酸酸性磷酸酶(U/L)0月3.70±0.07 3.80±0.061780.2805个月 4.12±0.10 3.68±0.151130.01310个月 4.44±0.09 4.33±0.091740.36015个月 4.14±0.08 4.09±0.101720.70020个月 4.35±0.19 4.09±0.1659 0.306钙(mg/dl)0月 9.23±0.04 9.27±0.041800.4705个月 9.12±0.05 8.90±0.051130.00510个月9.19±0.07 8.96±0.051740.00815个月8.98±0.05 8.73±0.041720.00020个月9.03±0.07 8.85±0.0860 0.092磷酸(mg/dl)0月 3.78±0.113.51±0.11 1800.0795个月 3.67±0.083.99±0.10 1130.08210个月3.74±0.103.97±0.09 1740.09715个月3.71±0.083.46±0.07 1720.01520个月3.77±0.144.00±0.15 60 0.272上述生化发现表明，口服避孕药处理在上述动物中引起骨更新的整体减缓。骨更新率的降低通常与骨无机物的保存相关，这是由于雌激素替代疗法可能通过降低总骨更新率来保存卵巢切除的猴子的骨密度。但在这种情况下，相对于对照动物而言，口服避孕药的处理可导致骨更新生物标记物的减少以及对净骨无机物密度的明确副作用。
上述数据表明，在正处于自然生长的年轻雌性猴子中，长时间口服避孕药的疗法将减弱骨的净自然增长并且可能导致较低的峰骨质。
实施例2雌激素对绝经后猴子的作用骨组织学和生物力学本实施例提供了从绝经后猴子试验中获得的组织形态学测量数据。骨组织形态学测量在未处理的卵巢切除妇女中，如同雌激素-不足的卵巢切除猴，当骨更新增强时，净作用结果却是骨损失。现有的报告已证明血清标记物与组织形态学测量数据间的良好相关性(Jerome等人，1994)。在处理11个月后，对在卵巢切除的猴子中髂骨及腰骨网状骨质出现的结构变化进行研究(Jayo等人，1995)。将受试动物的两侧卵巢都切除并分成3组1)未处理(OVX)，2)接受雌激素替代疗法(ERT)，和3)接受ERT加噻吩类利尿剂(thiazide diuretics)(ERT+TZ)。表10列出髂骨网状骨质组织形态学测量的资料。表10 在OVX、OVX+ERT、ERT+TZ的cynomolgus猴子中髂骨网状骨质的结构组织形态学测定(平均值±sem，采纳Jayo等人，1995)测量结果 OVX(n=10) ERT(n=10) ERT+TZ p-值(n=10)网状骨质体积(％)0月 28.87±2.0327.17±2.9725.47±2.19NS11个月 17.92±1.5125.65±2.6323.62±1.91 0.036小梁厚度(μm)0月 130.00±6.27 138.05±5.53 119.12±7.76NS11个月 102.12±6.44 110.85±7.16 101.71±6.29NS小梁n(/mm)0月2.23±0.14 1.95±0.18 2.14±0.12NS11个月 1.68±0.14 2.23±0.18 2.28±0.16 0.023小梁的分距(μm)0月 334.08±28.83 412.61±50.08 365.54±35.77NS11个月 540.43±63.10 370.66±51.83 355.36±29.24 0.026有文献公开有关卵巢切除猴子在25个月后，其椎骨网状骨质(腰)骨的中矢状(midsagittal)切片出现结构变化(Carlson等人，1992；Jerome等人，1994)。各组在椎骨网状骨质体积及小梁厚度方面也存在显著性差异，但在小梁数量或分离距离方面没有差异(表11)。表11在卵巢切除的(OVX)、OVX+17-β雌二醇(ERT)及OVX+17-β雌二醇+孕酮处理的(ERT+P)cynomolgus猴子中椎骨网状骨质的结构及动力学组织形态学测量测量 OVX(n=10)ERT(n=10) ERT+P网状骨质体积(％) 24.3±1.224.6±1.3 8.6±1.02*类骨质表面(OS/BS,μm) 17.5±3.16.8±0.911.9±2.2无机物外积率(μm/天) 0.65±0.03 0.48±0.02 0.56±0.03*p＜0.05对OVX和ERTp＜0.05对OVXp＜1.0对ERT总之，血清生物标记物及组织形态学数据表明，骨形成率在手术绝经的猴子中明显增高，骨更新通常需持续至少2年才增加。这种功能的变化将伴随有网状骨质构造变化及趋势以及相应的结构成份的损失。为验证结构成份损失的推断，测定了卵巢切除动物骨折所需的生物机械力。骨生物机械试验将在术后30个月时从INT及OVX猕猴采集的胫骨收集、冷冻并用Instron材料试验系统(Kasra和Grynpas,1992)测定。使中干承受无破坏性3点弯曲试验以测定弹性模量，随后进行破坏性扭转试验以测量剪切模量和破坏剪切应力。还测量中干的横切面积。虽然横切面积在各组中没有差异，但其它所有参数在OVX动物中要比在INT动物的显著降低(p＜0.05)，这表明骨骼在绝经后机械性能减弱并且脆性增加(表12)。表12完整(INT)和卵巢切除(OVX)的cynomolgus猕猴在术后30个月时的胫骨机械特性试验INT(n=11) OUX(n=11)p-值弹性模量(MPa)9044±4007193±412＜0.01剪切模量(MPa)2849±1382215±147＜0.05破坏应力(MPa) 47±2.4 35±2.1＜0.05面积(mm2)37±1.2 37±1.5NS在完整雌性猴(INT)、用雄甾烯二酮加E1(ANDRO)处理的完整猴及用睾丸素处理的完整猴(TETSO)中评估雄激素对骨生物机械特性的作用(Adams等人，1995；Kasra和Gynpas,1995)。在该试验中，TESTO的猴子接受超生理学(supraphysiological)水平的T、使它们具有与公猴类似的T水平以及雄性机体的组成。对从股骨头取出的芯样进行研究并且结果列在表13中。表13．INT、ANDRO及TESTO的cynomolgus猕猴在处理后30个月时的股骨小梁骨的机械特性(平均值±sd，每组n=12)。采纳kasra等人，1995。共有的符号表示显著性差异(p＜0.05)试验 INT ANDROTESTO弹性模量(MPa) 392±70*+ 737±152 812±123*最大应力(MPa) 23.6±4.8*23.2±2.6 29.8±5.4*密度(g/cm3) 1.326±0.09*1.389±0.05 1.440±0.06*同时也对胫骨进行生物机械试验，并且发现TESTO组具有强壮的、坚韧的及强直的胫骨(Kasra和Grypas,1995)。
上述骨试验表明，手术性绝经后猕猴的骨骼变化与绝经后妇女的相似，其中包括骨更新的增强、骨质降低、网状骨质微结构的变化以及折衷(compromised)的骨强度。通过含有或不含有孕激素的ERT法可以预防这些变化。在绝经前猴子中，雄激素处理的动物的骨强度有所提高，并且T处理的动物具有更强和更致密的骨骼。
实施例3绝经前猴子中的动脉粥样硬化相关性试验口服避孕药对完整雌性cynomolgus猕猴CAA的作用业已公开(Clarkson等人，1990)。在该试验中，给年轻的成年雌性cynomolgus猕猴喂食致动脉粥样硬化的饮食并将它们分成三组对照组、炔雌醇和炔诺孕酮给药组、炔雌醇和双醋炔诺醇给药组。两种避孕药制剂都使HDL胆固醇降低。但是，两种避孕药都使CAA程度减轻。
本发明人研究了雌性猴在食用可诱发动脉粥样硬化饮食后所引发的过度雄性性征(hyperandrogenism)作用(Adams等人，1995)。30个月后，TESTO组动物的CAA比未处理INT组动物增加了近两倍(p＜0.05)，但ANDRO处理并未对动脉粥样硬化的程度造成影响。T的致动脉粥样化作用与血浆脂蛋白风险变量无关。虽然TESTO组猴子中动脉粥样硬化程度较高，但血管舒缩活性与INT猴子的相似。本发明人已观察到，手术绝经后猴子在添加甲基睾丸素(MT)的炔雌醇疗法中并未受到损害。MT疗法没有抑制炔雌醇对动脉壁的有益作用。
实施例4如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及0.25mg甲基睾丸素的在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇并在月经周期第14-18天连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇的在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例5如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及0.3mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例6如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及0.5mg甲基睾丸素并且在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们是在月经周期的第1-7天服用。
实施例7如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及0.75mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例8如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及1.0mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例9如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及1.5mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例10如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及1.5mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例11如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及0.25mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮、约0.040mg炔雌醇及约0.25mg甲基睾丸素且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮、约0.030mg炔雌醇、0.025mg甲基睾丸素并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
实施例12如下所述的包含28片的口服避孕药制剂6片含有0.03mg炔雌醇、0.05mg左炔诺孕酮及0.5mg甲基睾丸素并在月经周期第8-13天连续服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮、约0.040mg炔雌醇及约0.5mg甲基睾丸素且在月经周期第14-18天时连续服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮、约0.030mg炔雌醇0.5mg甲基睾丸素并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和，7片不含任何口服避孕激素的安慰剂，它们在月经周期的第1-7天服用。
虽然本发明的组合物及方法是通过优选实施方案加以说明的，但所属领域技术人员可清楚地理解那些对于此处所述组合物、方法及所述方法的步骤或步骤的顺序进行的改变都不脱离本发明的概念、宗旨和范围。具体而言，很显然，某些化学上及物理上相关的试剂可以取代此处所述的药剂来获得相同的或相似的结果。所有此类的对于所属领域技术人员很显然的相似取代物及改进都被认定是属于本发明如权利要求书定义的宗旨、范围及概念中。
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权利要求
1．一种避孕制剂，该制剂含有有效量的雌激素、孕激素和雄激素，该制剂可以促进该避孕药使用者骨骼的自然增长。
2．根据权利要求1的制剂，其中所述雄激素为甲基睾丸素。
3．根据权利要求2的制剂，所述制剂被进一步定义为每个日剂量含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素。
4．根据权利要求1的制剂，其中所述制剂在月经周期约第8-13天给药。
5．根据权利要求1的制剂，其中所述孕激素为约0.050mg的左炔诺孕酮并且所述雌激素为约0.03mg的炔雌醇。
6．一种口服避孕药制剂，该制剂包括(a)在月经周期第8天至约第13天每天给药的含有甲基睾丸素、左炔诺孕酮及炔雌醇的一种组合物；(b)在月经周期第13天以后每天给药的含有左炔诺孕酮和炔雌醇的一种组合物；
7．根据权利要求6的制剂，该制剂进一步含有在月经周期第1-7天每天给药的安慰剂组合物。
8．根据权利要求6的制剂，其中(a)的组合物被进一步定义成为每个日剂量含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素。
9．根据权利要求8的制剂，其中(a)的组合物被进一步定义成包含约0.050mg左炔诺孕酮和约0.030mg炔雌醇。
10．根据权利要求6的制剂，其中(b)的组合物被进一步定义成为一种在月经周期第14-18天服用的包含约0.075mg左炔诺孕酮和约0.040mg炔雌醇的第一组合物；一种在月经周期第19-28天服用的包含约0.125mg左炔诺孕酮和约0.030mg炔雌醇的第二组合物。
11．根据权利要求10的制剂，其中的第一组合物、所述第二组合物或两者都被进一步定义成为每个日剂量包含约0.25mg-约0.5mg的甲基睾丸素。
12．一种口服避孕药组合物，该组合物每个日剂量中含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.050mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇。
13．一种配制成下列28种片剂的口服避孕药组合物(a)6片含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.050mg左炔诺孕酮及约0.03mg炔雌醇的片剂；(b)5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇的片剂；(c)10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇的片剂；和(d)7片安慰剂。
14．一种根据权利要求13的口服避孕药组合物，其中组合物(b)、组合物(c)或两者进一步在其每个日剂量中包含0.20mg-0.50mg甲基睾丸素。
15．一种根据权利要求13的口服避孕药组合物，其中所述片剂是包装在一个包括28个腔室的分配器内，每个腔室专用于容纳一个片剂，并且其中所述分配器提供一种将所述片剂按照预定顺序分配的方式。
16．一种提高服用含雌激素口服避孕药对象骨骼自然增长的方法，其中所述对象还未达到峰骨质，该方法包括在给予所述对象口服避孕药的同时给予雄激素。
17．根据权利要求16的方法，其中所述雄激素是在月经周期第8-13天期间每天给予约0.2mg-约1.5mg的甲基睾丸素。
18．根据权利要求16的方法，其中所述雄激素是在月经周期第8-28天期间每天给予约0.2mg-约1.5mg的甲基睾丸素。
19．一种预防使用者妊娠的方法，该方法包括给予所述使用者一种制剂，该制剂包括在月经周期第8-13天每天服用的0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.050mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇；在月经周期第14-18天每天服用的约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇；和在月经周期第19-28天每天服用的约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇。
20．一种预防使用对象妊娠的方法，该方法包括给予使用对象一种制剂，该制剂包括在月经周期第8-13天每天服用的0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.050mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇；在月经周期第14-18天每天服用的约0.075mg左炔诺孕酮、约0.040mg炔雌醇及约0.2mg-约0.5mg甲基睾丸素；和在月经周期第19-28天每天服用的约0.125mg左炔诺孕酮、约0.030mg炔雌醇及约0.2mg-约0.5mg甲基睾丸素。
21．一种月用口服避孕药包装，该包装含有7片含有安慰剂组合物的片剂，它们在月经周期的第1-7天服用；6片含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.050mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并且在月经周期第8-13天服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮及约0.040mg炔雌醇且在月经周期第14-18天时服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并在月经周期第19-28天连续服用的片剂；和一个含有28个腔室的分配器，所述各腔室含有一种口服避孕药组合物。
22．一种月用口服避孕药包装，该包装含有7片含有安慰剂组合物的片剂，它们在月经周期的第1-7天每天服用；6片含有约0.2mg-约1.5mg甲基睾丸素、约0.050mg左炔诺孕酮及约0.030mg炔雌醇并且在月经周期第8-13天每天服用的片剂；5片含有约0.075mg左炔诺孕酮、约0.040mg炔雌醇及约0.2mg-约0.5mg甲基睾丸素且在月经周期第14-18天时每天服用的片剂；10片含有约0.125mg左炔诺孕酮、约0.030mg炔雌醇及约0.2mg-约0.5mg甲基睾丸素并在月经周期第19-28天每天连续服用的片剂；和一个含有28个腔室的分配器，所述各腔室含有一种口服避孕药组合物。
全文摘要
本发明公开了口服避孕的方法及组合物。本发明的特定组合物包含雄激素,优选甲基睾丸素,所述的本发明组合物是供年轻的避孕药使用者服用,从而抑制由于使用口服避孕药而对骨无机物密度产生的负作用。
文档编号A61K9/20GK1225008SQ97196255
公开日1999年8月4日 申请日期1997年7月9日 优先权日1997年7月9日
发明者C·L·小·修斯, M·J·杰伊 申请人:威克福雷大学