专利名称：用于治疗动物真菌疾病的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗真菌疾病的物质和方法。更具体地说，本发明涉及衍生自用于治疗动物真菌疾病的物质的碳水化合物。
真菌感染在各种动物中都很常见。常见的真菌感染包括genii念珠菌属和曲霉属的各种类，它们的各个类型，及其它各种真菌。表面的真菌感染相对较小，但系统真菌感染可引起严重的医学后果。真菌感染的发生率已经明显的增加，特别是在人体中。这个增加至少部分是由于具有受损的免疫系统的病人的数目不断增加，免疫系统受损的原因既可以是对其它病症医疗，也可以是由于其它疾病如艾滋病损伤了免疫系统。真菌疾病，特别是当它是全身性的时候，对于免疫系统有损伤的病人来说能够危及生命。
在现有技术中，已经开发了一些药物来治疗真菌疾病。这些物质包括化合物如两性霉素B(AMB)，三唑和氟胞嘧啶。AMB由于它的广谱活性是治疗许多全身性疾病的药物；但是，由于它对肾脏有损害，必须采用静脉注射给药。许多三唑显示广谱活性且可口服给药；但是很多真菌菌株对这些物质耐药性。因此，需要一组新的能有效消除真菌疾病，同时对病人毒性低的药物。理想地说，这些物质应该是制备简单，稳定并易于给药。
如下面详述的，本发明涉及高效的控制真菌疾病的药物。本发明的物质是从天然碳水化合物衍生得到的物质并因此毒性低。此物质是特定地从复杂的碳水化合物如壳多糖或壳聚糖制备的。本发明的物质广泛分布于自然界，并发现存在于，例如，节肢动物的壳中，和真菌的细胞壁中。本发明的这些和其它优点，从下述讨论，说明和实施例可明显地看到。
这里公开了一种治疗动物真菌疾病的治疗物质。此治疗物质含有重复的β-葡萄糖胺单元构成的低聚物。此低聚物的分子量范围在4,000-18,000道尔顿，优选的情况是分子量在4,000-7,000道尔顿。本发明特定物质的分子量在约4,000-5,000道尔顿，最优选的分子量是约4,800道尔顿。β-葡萄糖胺低聚物可通过其氮原子被部分乙酰化，在一个特定的情况下，本发明物质约5％-30％乙酰化。低聚物可以，在某些情况下，葡萄糖胺单元通过其四个位置连接形成。
本发明的物质可通过水解壳多糖，壳聚糖和类似材料容易地制备。水解可使用无机酸进行或使用酶如纤维素酶进行。
包括将感染动物的组织暴露于本发明治疗剂的治疗方法也在本发明范围内。
图1是不同浓度的本发明物质的典型灭杀曲线，证明其对念珠菌属代表性分离物的效果；图2是不同浓度的本发明物质对特定菌株白假丝酵母90028所显示效果的灭杀曲线。
按照本发明，发现由重复的β-葡萄糖胺单元连接构成的特定低聚物材料，且分子量在4,000-18,000道尔顿的，可高效灭杀和/或限制各种可引起动物，包括人的疾病的类型的真菌有机体的生长。在本发明说明书中，真菌有机体是专指包括酵母菌。本发明的物质优选通过水解壳多糖或壳聚糖制备。壳多糖是多糖的复合物且在节肢动物的外骨骼和许多真菌的细胞壁中可找到。壳聚糖是通过至少部分脱乙酰化壳多糖形成的半合成材料。如下详述，本发明的治疗剂主要由β-葡萄糖胺重复单元构成，且β-葡萄糖胺单元主要通过其四个位置连接在一起。β-葡萄糖胺的基本结构如下述通式Ⅰ所示
正如将被提到的，β-葡萄糖胺可通过其氮原子乙酰化，且在本发明中，发现优选的治疗剂有约5％-30％被乙酰化，其余为胺。一种特定的，优选的材料是5％被乙酰化。一般地，发现具有分子量在4,000至18,000道尔顿的材料是有用的，且分子量在4,000至7,000道尔顿的材料特别可以用于抵抗各种真菌。更明确地，具有分子量在4,000-5,000道尔顿的材料，且特别是4,800道尔顿的材料，被证明对抵抗真菌显示特别高的活性。通常，具有至少10个β-葡萄糖胺重复单元，且优选22-25个重复单元的低聚物被证明特别有用。
本发明的物质可通过各种方法制备，包括直接合成。但是，发现制备此物质最经济的方法是通过水解壳多糖或壳聚糖，由于这些材料可很容易大量且相对低花费地得到。水解可使用无机酸如盐酸进行，或使用酶如纤维素酶实施。无论如何，水解包括连接β-葡萄糖胺单元的醚键的断裂。根据反应条件的强度和时间，很容易控制所得低聚物的分子量。
本发明的低聚物，可按照下述方法从壳多糖制备。将Sigma化学公司提供的从虾壳中获得的磨细的壳多糖(20g)与300毫升浓盐酸一起在0℃搅拌约3小时。将所得壳多糖的悬浮液加热至32℃水解约1小时。加入氢氧化钾将酸性混合物调至pH约为4.0。将混合物离心并丢弃沉淀。上层清液通过截留分子量20,000的膜过滤。浓缩滤液，然后使用截留分子量约400-700的膜脱盐。所得寡糖混合物在Bio-GelP-4柱上分离，用HPLC检测到不同的峰。发现此物质包括聚合度约25，相应于分子量约5,000的低聚物。
已发现，使用壳聚糖作原料可制备类似的物质。另外，其它酸如三氟乙酸也可类似地被用于水解。
本发明的低聚物也可类似地使用酶水解制备。在一个优选的方案中，将9g具有分子量约400,000道尔顿的壳聚糖(从Sigma化学公司得到)悬浮于100毫升水中。加入100毫升0.5N盐酸以使壳多糖溶解，并用0.5N氢氧化钠滴定将pH调至约5.0。将壳多糖溶液稀释至约3％，并加入0.5％纤维素酶(Novo化学公司提供的商品名为Celluclast的产品，且具有每个壳多糖最多4单元avicelase活性)。将混合物加热至50℃6小时。将混合物通过具有截留分子量10,000道尔顿的膜淬灭反应。这样可除去纤维素和任何高分子量低聚物。或者可在85℃加热10分钟淬灭反应，这样可使酶失活。如前所述的例子，所得低聚物的溶液用离心纯化并脱盐。如此制得的产物具有分子量在4,000-10,000道尔顿。应理解用于制备低聚物的反应条件可被本领域技术人员容易地改变，本发明不限于任何具体方法制备的物质但涉及低聚物材料和其在治疗真菌疾病中的应用。
通过气相色谱/质谱，和核磁共振分析和描绘如此制得的物质的特征。分析证实低聚物中的主要键是4-连接的N-乙酰基β-葡萄糖胺。低聚物还包括少量的3,4和4,6连接的N-乙酰基β-葡萄糖胺，且这些键可代表低聚物中的分支。一维和二维NMR分析结果与结构中包含β-葡萄糖胺重复单元的结构是一致的。样品的分子量分析用粘度测量或分子筛层析进行，它们都与它们的判定一致。
本发明的低聚物材料使用不同的真菌评价，包括对常规杀真菌材料耐受的菌株。具体地，本发明物质使用代表14个不同种的酵母菌的99个菌株进行评价。大多数菌株是临床分离物且其余的是从在Rockville,Maryland的美国典型培养中心获得。种的分布包括29个白假丝酵母(Candida albicans)(其中14个对吡咯耐受)；15个团假丝酵母(C.glabrata)(其中5个对吡咯耐受)；6个近平滑假丝酵母(C.parapsilosis)(其中1个对吡咯耐受)；6个葡萄牙假丝酵母(C.lusitaniac)；2个皱落假丝酵母；10个热带假丝酵母(其中2个对吡咯耐受)；1个吡咯耐受郎比可假丝酵母；8个吡咯耐受短卵假丝酵母(C.crusei)；9个季也蒙假丝酵母；5个乳酒假丝酵母；4个星形假丝酵母；1个亚热带假丝酵母(C.paratropicalis)；1个解酯假丝酵母；和2个酿酒酵母。此物质还用20种曲霉属(Aspergillus)真菌进行了评价。这些菌株中的10个是从Detroit医学中心的微生物实验室得到的临床分离物；5个是分别对伊曲康唑和两性霉素B耐受的实验室分离物。
使用分生孢子作为接种物在从St.Louis,Missouri的Sigma化学公司获得的YPD琼脂斜面上制备前述的培养物。将斜面在30℃保温4天或直到培养物分生孢子和次代培养物的新的分生孢子用作所有后续培养工作的接种物源。
用于此评价的低聚物材料包括β-葡萄糖胺重复单元，具有分子量约4,800道尔顿。此材料是按照前述方法用酸水解壳聚糖得到的。所使用的具体材料定名为CAN-296，且以0.1mg/ml水溶液用于酵母抗真菌敏感性分析。
除了使用TYG分析用培养基代替RPMI1640，使用临床实验室标准国际委员会(National Committee for Clinical LaboratoryStandards)推荐的肉汤微稀释法(NCCLS文件M27；1992)，测定了CAN-296的最小抑制浓度(MIC)和最小致死浓度(MLC)。按照此方法，微生物在PYG介质中生长并向其中以10-0.019微克/毫升加入CAN-296。MIC定义为完全抑制生长的最低浓度。在35℃保温48小时后测量MIC。从证明完全抑制生长的第一个浓度和所有无可见生长的浓度的次代培养100微升测定MIC。次代培养在萨布罗氏葡糖琼脂板上在30℃保温24小时进行(对于隐球菌属种培养72小时)。MLC定义为99％的初始接种物被杀死时的最低浓度。
烟曲霉敏感性研究按照Manavathu等使用新鲜分生孢子作为接种物的改进的Espinel-Ingroff等的肉汤大跨度稀释(macrodilution)技术测定烟曲霉(A.fumigatus)对CAN-296以及伊曲康唑和两性霉素B的敏感性。为了制备分生孢子悬浮液，将各种分离物的培养物在Sigma化学公司获得的酵母提取物蛋白胨葡糖(YPD)琼脂板上生长，在30℃保温6天直到整个板被真菌覆盖。用无菌培养基(约22毫升)冲洗琼脂表面然后轻轻地用无菌橡皮刮刀刮来收集分生孢子。用吸入法收集含有菌丝碎片，琼脂碎块和其它细胞碎片的所得悬浮液。吸入物剧烈振动以从分生孢子柄释放分生孢子并通过塞入无菌棉花塞的过滤漏斗过滤。用血细胞计数器测定细胞密度。每个样品分别测定4次，且4次的平均值用于计算细胞密度。典型地，当使用20毫升培养基用于再悬浮时可得到1-3×107分生孢子/毫升。用血细胞计数器测定的细胞密度与用适量稀释的细胞悬浮液在YPD琼脂上铺板测定的集落(克隆)形成单元的数之间的关系是，用集落(克隆)形成单元(CFU)估算的细胞密度比用血细胞计数器获得的结果低10-20％。
在无菌的6毫升大小的聚苯乙烯试管中用最终体积1毫升进行肉汤大跨度稀释试验。在0.5ml培养基中用2-倍系列稀释法制备两倍最终所需浓度的CAN-296，伊曲康唑和AMB。每个样品容器用0.5ml分生孢子悬浮液(在培养基中用2-倍系列稀释法制备的两倍最终所需CFU)接种得到最终CFU为1×104/ml。每组药物浓度进行3次试验且每个MIC测定至少重复一次。将AMB试管外套铝箔以防止暴露于光中，并将所有试管在35℃保温48小时，且，涡流后，根据需要刮壁，计数可见的生长。MIC为无可见生长发生的药物最低浓度。
时间灭杀研究使用白假丝酵母(C.albicans)分离物(B311和90028)和团假丝酵母(32554)进行灭杀曲线试验检测CAN-296的杀真菌活性。在此项研究中，试验微生物在YPD肉汤中在30℃旋转震动器160rpm条件下生长24小时。将培养物稀释约1,000倍得到细胞密度为1×106形成单元(CFU)/ml。将含有0-5微克/ml不同浓度的CAN-296的5ml等分的稀释的培养物在30℃保温。在0-24的不同时间间隔，移出0.1ml等分的细胞悬浮液，连续稀释(102-106倍)且将0.1ml等分铺在YPD琼脂板上平行测定。在30℃保温48小时后，测定每毫升CFU数并相对于暴露在CAN-296的时间绘图构建灭杀曲线。
结果表1总结了本发明的CAN-296化合物对各种酵母菌的有效性试验结果。表中的MIC数据不仅有对于本发明化合物的，还包括对预防性杀真菌剂包括AMB，氟胞嘧啶，酮康唑，氟康唑，伊曲康唑，和pneumocandin L-733,560的数据。表中还列了CAN-296物质的MLC。正如将看到的，大量的试验品种对0.078-0.312微克/ml浓度的CAN-296有高度一致的敏感性。吡咯耐受和吡咯敏感性念珠菌属也也有类似的敏感性，且当与L-733,560比较时，CAN-296具有较窄且更一致的治疗范围。将CAN-296的MIC值与AMB的值进行比较。只有一个团假丝酵母显示对于10微克/ml的CAN-296耐受。对于所有吡咯敏感性和耐受性念珠菌属，MIC和MLC差别不大于两倍。杀真菌作用很快，在2.5-5微克/ml的浓度时，在15分钟内观察到杀真菌作用，在1.25微克/ml的浓度时，在45分钟内观察到杀真菌作用，在0.625微克/ml的浓度时，在120分钟内观察到杀真菌作用。图1描述了对于不同的念珠菌属分离物的典型灭杀曲线。用于时间-灭杀研究的CAN-296的浓度在约2-16倍，对于大多数念珠菌属其为主要MIC值。如图1所示，CAN-296的杀真菌活性是依赖于浓度和时间的。大于99.999％的细胞在暴露于浓度大于8倍的MIC的CAN-296化合物时在15分钟内被杀死。
表1生物 抗真菌剂 MICμg/ml范 MLCμg/ml范围 围白假丝酵母(29)CAN-296 0.156-0.312 0.156-0.312两性霉素B0.02-0.1氟胞嘧啶0.04-1.25酮康唑 0.01-6.25氟康唑 0.08-＞80伊曲康唑0.01-12.5L-733,5600.05-0.78近平滑假丝酵母(6) CAN-296 0.078-0.312 0.078-0.312两性霉素B0.05-0.2氟胞嘧啶0.08-1.25酮康唑 0.02-0.2氟庚唑 0.16-＞20伊曲康唑0.02-0.2L-733,5600.02-1.56团假丝酵母(15)CAN-296 0.078-0.312 0.078-0.312两性霉素B0.05-0.2氟胞嘧啶0.04-0.3酮康唑 0.01-6.3氟康唑 1.25-＞40
伊曲康唑0.02-6.3L-733,5600.1-0.39热带假丝酵母(10)CAN-296 0.039-0.312 0.039-0.312两性霉素B0.02-0.39氟胞嘧啶0.08-0.63酮康唑 0.02-3.12氟康唑 0.63-＞80依曲康唑0.02-6.25L-733,5600.1-0.78葡萄牙假丝酵母(6) CAN-296 0.156-0.312 0.156-0.312两性霉素B 0.05氟胞嘧啶 0.08酮康唑 0.02-0.2氟康唑 0.31-＞20依曲康唑0.02-0.1L-733,5600.39-0.78短卵假丝酵母(8) CAN-296 0.039-0.312 0.039-0.312两性霉素B0.1-0.39氟胞嘧啶 2.5-20酮康唑 0.01-1.56氟康唑 10-＞80伊曲康唑0.01-0.39L-733,560 0.78季也蒙假丝酵母(9) CAN-296 0.078-0.312 0.078-0.312两性霉素B0.2-0.78
氟胞嘧啶0.08-0.16酮康唑 0.02-0.1氟康唑 5-＞10伊曲康唑0.02-0.78L-733,5600.78-1.56乳酒假丝酵母(5)CAN-296 0.156-0.312 0.156-0.312两性霉素B0.05-0.39氟胞嘧啶0.08-0.16酮康唑0.02氟康唑 0.31-2.5伊曲康唑 0.2L-733,5600.02-0.78星形假丝酵母(4)CAN-296 0.312 0.312氟胞嘧啶0.625-1.25酮康唑0.01氟康唑 0.16-0.31伊曲康唑 0.01皱落假丝酵母(2)CAN-296 0.312 0.312氟胞嘧啶 0.08酮康唑0.01氟康唑 5伊曲康唑 0.02郎比可假丝酵母(1) CAN-296 0.078 0.078两性霉素B 0.01氟胞嘧啶 0.31
酮康唑 0.01氟康唑 20伊曲康唑0.01亚热带假丝酵母(1)CAN-2960.3120.312解酯假丝酵母(1)CAN-2960.3120.312酿酒酵母(2) CAN-2960.1560.156关于图2，显示的是CAN-296对于白假丝酵母90028的灭杀曲线。
表2总结了对于各种烟曲霉菌株，CAN-296与伊曲康唑和AMB的MIC值比较。应注意CAN-296物质对于曲霉菌多少不象对酵母菌那么有效；但是，值得注意的是，对于伊曲康唑耐受和AMB耐受的曲霉菌菌株对于本发明的物质没有耐受。
表2微生物MIC(μg/ml)CAN296 ITZAMB烟曲霉W733550.625 0.250.5烟曲霉W27023 ＞50.250.5烟曲霉W37825 ＞50.250.5烟曲霉W60252 ＞50.250.5烟曲霉M38358 ＞50.250.5烟曲霉X8069 ＞50.250.5烟曲霉H33233 ＞50.250.5烟曲霉H52950 ＞50.25 1烟曲霉H38375 ＞50.250.5烟曲霉W45777＞50.25 0.25烟曲霉AB8.36＞50.254烟曲霉AB8.56＞50.254烟曲霉AB8.95＞50.5 4烟曲霉AB16.2＞50.125 2烟曲霉AB16.3＞50.254烟曲霉ITZ5 5 ＞16 0.5烟曲霉ITZ25 ＞5＞161烟曲霉ITZ40 ＞5＞1650烟曲霉ITZ51 ＞5＞161烟曲霉ITZ70 5 ＞1650测定了CAN-296的热和pH稳定性，发现沸腾60分钟后也不影响其对于白假丝酵母B311和90028生长的抑制作用，证明它是热稳定性化合物。还发现此物质对pH是稳定的，且当培养基(PYG〕的pH改变时未发现其MIC结果有变化。
上述研究证明本发明的物质是高效，广谱抗真菌剂。它对一些甚至对于常规抗真菌物质耐受的耐受种和菌株也是有效的。而且，本发明的物质与常规使用的抗真菌剂之间无交叉耐受性。本发明的物质可快速杀死真菌，一般在暴露15分钟之内，因此此作用方式是独一无二的。尽管不想限于推测，应相信本发明物质可破坏真菌的酶系统或干扰细胞代谢。本发明物质的热稳定性和pH稳定性增加了其应用，它用于各种给药系统并进一步简化贮存和处理。由于本发明的物质不被胃酸降解，因此它可口服给药；尽管在有些例子中，它优选使用静脉内给药。
尽管试验数据仅反应了一个具体的代表性化合物，应理解前述本发明的各种分子量片段，以及低聚物混合物可在实践中使用。前述图，数据，实施例和讨论只用于举例说明本发明的一个特定例子并不用于限定本发明。下面的权利要求，包括所用等同物，定义了本发明的保护范围。
权利要求
1.治疗动物中真菌疾病的方法包括将所述动物的组织暴露于治疗剂由β-葡萄糖胺重复单元构成的低聚物，所述低聚物具有分子量在4,000-18,000道尔顿。
2. 权利要求1所述方法，其中所述低聚物具有分子量在4,000-7,000道尔顿。
3.权利要求1所述方法，其中所述低聚物具有分子量在4,000-5,000道尔顿。
4.权利要求1所述方法，其中所述低聚物具有分子量约4,800道尔顿。
5.权利要求1所述的方法，其中至少一部分β-葡萄糖胺重复单元是通过其氮原子乙酰化的。
6.权利要求5所述的方法，其中约5％-30％的β-葡萄糖胺重复单元被乙酰化。
7.权利要求1所述的方法，构成所述低聚物的β-葡萄糖胺重复单元是通过其1-4键连接的。
8.权利要求1所述的方法，其中低聚物至少由10个连接的β-葡萄糖胺重复单元构成。
9.权利要求8所述的方法，其中所述低聚物由约22-25个所述重复单元构成。
10.权利要求1所述的方法，进一步包括通过水解壳多糖或壳聚糖制备所述低聚物。
11.权利要求10所述的方法，其中所述水解壳多糖或壳聚糖的步骤包括使用无机酸水解所述壳多糖或壳聚糖。
12.权利要求10所述的方法，其中所述水解壳多糖或壳聚糖的步骤包括使用酶水解所述壳多糖或壳聚糖。
13.权利要求12所述的方法，其中所述酶包括纤维素酶。
14.治疗由念珠菌属或曲霉属感染引起的动物中真菌疾病的方法，所述方法包括将所述动物组织暴露于治疗剂，治疗剂包括由β-葡萄糖胺重复单元连接构成的低聚物，所述低聚物具有分子量在4,000-18,000道尔顿。
15.用于治疗动物中真菌疾病的治疗剂，所述材料包括由β-葡萄糖胺重复单元连接构成的低聚物，所述低聚物具有分子量在4,000-18,000道尔顿。
全文摘要
由重复的β－葡萄糖胺单元构成的低聚物显示广谱抗真菌活性。所述低聚物优选具有分子量在4,000—18,000道尔顿,且可被部分乙酰化。此物质可高效抵抗各种真菌包括念珠菌属的各种真菌。
文档编号A61K31/722GK1237108SQ97199631
公开日1999年12月1日 申请日期1997年10月15日 优先权日1996年10月15日
发明者D·普拉特 申请人:D·普拉特