专利名称：能提高免疫功能的活性肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类具有提高免疫功能的活性肽及其应用，该类肽是以从荞麦花粉中分离得到的一种十二肽为模型，设计合成的一类六肽。
早在两千多年前，中国、希腊等国家的人们就食用花粉，并将其作为药物应用。本世纪50年代，人们又从新认识花粉的医疗功能，实践证明，花粉不但能健身壮体，且对多种疾病确有疗效，又因其副作用小，并含有生命所需的多种营养物质，可长期服用，达到有病治病，无病强身的作用。如国产的“前列康”即由油菜花粉制得，长苞香蒲花粉是治疗高血脂、冠心病的“心舒Ⅲ号”的主药。长苞香蒲花粉可使大鼠免疫应答受到抑制，而在大剂量使用时，又可使巨噬细胞功能加强，这说明它具有双向调节作用(杨晓慧等，湖南医药杂志，1983.1:61)，油菜花粉具有免疫促进作用(KaikeWan,Yanling Song,Aixue Ji and ShengJin,in Peptides Biology and Chmistry,Proceedings of the 1994,Chinese Peptide Symposium,June 13-17,1994,Beijing.Ed.by ESCOM,Leiden,1995,p116)，其中的多肽物质对小鼠有明显的促进生长的作用(Chauvin R.Bee Pollen 1958,39:301)，此外，家蝇实验表明，油菜花粉还有一定的抗衰老作用(金道山等，老年学杂志1988 2:104)。
由于花粉是较全面的营养物质，且其次生代谢物质又是多种多样的，显示出它会有多种生物活性，因次，由花粉出发，很可能会制备出治疗多种疾病的新一代的高效低毒药物。通过从其中提取有效成份，结构测定及结构修饰，再经人工合成，是寻找新药的重要途径。问题在于有效成份虽然多种多样，但往往多数含量较少，给提取工作造成极大困难，例如，花粉中的小肽种类很多，而含量甚少，故国内外报导的，多数是有关较大分子量的花粉免疫原的工作(分子量大于50000)。
本发明的目的是，在我们对花粉的研究中，尤其是在从油菜和荞麦花粉中进行小肽提取、分离、结构测定、合成、结构与生理活性关系等方面研究的基础上，从荞麦花粉中分离得到一个碱性十二肽(Yanling Song et al.,Chinese ChemicalLetters,1977,7:607)，以该肽为模型，取其N-端起始的六个氨基酸，并对之进行适当的化学修饰，作为模型肽片段或片段类似物，合成一系列该类六肽。预期该类肽具有提高免疫功能、抗肿瘤及抗衰老作用，并能达到适宜的强度。上述十二肽的结构如下式所示丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸-甘氨酸-丝氨酸-天冬酰胺本发明的多肽，其结构如下列的通式(1)所示丙氨酸-脯氨酸-A-B-谷氨酰胺-异亮氨酸(1)式(1)中的A代表缬氨酸或赖氨酸；式(1)中的B代表亮氨酸或赖氨酸，A和B同时为赖氨酸者除外；式(1)中的丙氨酸的构型为L型或D型，未指明者即为L型；式(1)中的羧端基为游离羧基或酰胺基，未指明者即为游离羧基。
合理的药物设计可大大减少药物筛选的数量，但合理的药物分子设计需在已知受体结构的条件下才能进行，而目前许多已知药物的受体结构是未知的，因此，合理的药物分子设计很困难。据文献报导，有一种通过化学修饰已知分子的办法，进行蛋白质分子的合成，其中包括改变链的长短或改变侧链，后者是，用另一种天然或非天然的氨基酸取代肽链中适当位置的氨基酸，如此制成的肽之二级结构可以发生变化，同时也可影响肽的亲油或亲水性，有利于肽在体内循环中的输送。本发明根据上述原则，设计合成前述十二肽的一个六肽片段，即通式(1)中的A和B依次分别为缬氨酸和亮氨酸的六肽，即编号如下的肽PKUP-1丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-亮氨酸-谷氢酰胺-异亮氨酸同时根据改变侧链的办法，设计合成通式(1)中的A和B依次分别为赖氨酸和亮氨酸以及缬氨酸和赖氨酸的如下的两个六肽PKUP-2丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸PKUP-3丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸将D-型氨基酸引入肽链，有时可极大地提高活性肽的激动活性，或变激动活性为拮抗性，其原因在于D-型氨基酸的引入，可使肽链提高抵抗酶进攻的能力，同时也发生构象变化。例如，在对黄体激素释放激素(LH-RH)的研究中，利用D-型氨基酸取代的方法寻找出了活性比天然LH-RH高出数十倍甚至百倍以上的激动剂。又如，用D-型丙氨酸取代脑啡肽的2-位上的甘氨酸，可大大提高其活性，这是因为D-型丙氨酸或其他D-型氨基酸取代甘氨酸后，往往有利于β-转角构象的形成，它常被认为可能是与受体结合的部位，基于这种考虑，本发明设计合成了通式(1)中的丙氨酸的构型各为D-型，A和B依次分别为缬氨酸和亮氨酸、赖氨酸和亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸，如下的三个六肽
PKUP-4D-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸PKUP-5 D-丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸PKUP-6D-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酸很多活性肽，例如，激肽、神经肽、丘脑肽等的端羧基是酰胺化的，而相应的为游离羧基者，却活性较低或者根本无活性，为此，在本发明中同时设计合成了与上述PKUP-2,PKUP-3,PKUP-5,PKUP-6相对应的端羧基酰胺化的四个六肽，如下式所示PKUP-7丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酰胺PKUP-8丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酰胺PKUP-9 D-丙氨酸-脯氨酸-赖氨酸-亮氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酰胺PKUP-10 D-丙氨酸-脯氨酸-缬氨酸-赖氨酸-谷氨酰胺-异亮氨酰胺本发明所设计合成的活性肽的制备方法本发明的活性肽皆可以用已知的各种接肽方法合成，不同的方法各有其优缺点，在实际应用中可把不同方法结合起来使用，以满足合成的需要。本发明主要以固相逐步合成法制得PKUP-3、PKUP-4、PKUP-5、PKUP-6、PKUP-7、PKUP-8、PKUP-9和PKUP-10八个六肽；用同步多重法同时缩合，同时裂解，同时分离纯化的方法，最终同时获得PKUP-1和PKUP-2两个六肽。本发明所合成的多肽均可用反相高压液相色谱进行分离、纯化，用氨基酸分析，FAB-MS和分析型反相高压液相色谱进行纯度鉴定。
本发明的活性肽的生理活性及其应用1975年，Slosn-Kettering肿瘤中心的Carswell等报道，受卡介苗(BCG)感染的小鼠经静注内毒素(脂多糖，LPS)后，血清中产生一种与内毒素无关的活性因子，可以引起肿瘤细胞坏死，称为肿瘤细胞坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF)。TNF是一种由内毒素激活的巨噬细胞产生的，仅对癌细胞有杀伤作用的一类非种属特异活性因子，它不仅对多种肿瘤具有细胞毒作用，而且还参与机体炎症与免疫应答的调节。TNF的发现对癌症的免疫治疗具有重要意义。
在体外试验和动物试验中TNF均有一定的抗肿瘤作用，但在单独将之应用于临床治疗肿瘤的试验中，效果并不令人满意。Jones A.L.等研究发现，TNF剂量达400～800μg/m2时，仍无明显的抗肿瘤作用，若再加大剂量，则会引起低血压和肝损害等副作用(Jones A.L.et al.,Cancer Surv.,1989,8:817-836)。
鉴于单独使用TNF在肿瘤治疗中的效果不佳，人们开始探索TNF与其他药物复合使用，并取得令人鼓舞的成果。例如Gridley D.S.等人将恶性黑色素瘤移植到小鼠体中，单独使用TNF-α治疗无明显效果，但将TNF-α和干扰素(IFN)-γ合用后，抗肿瘤作用明显增强，与对照组有明显的差异(Gridley D.S.et al.,Biol.ResponseMod.,1990,9:593-602)。
我们选用对TNF较为敏感的小鼠纤维母细胞瘤L929细胞系作为靶细胞，用本发明的活性肽PKUP-2与TNF进行协同杀伤，结果表明，PKUP-2可以加强TNF的细胞毒作用，增加其对肿瘤细胞的杀伤能力。
本发明还通过体外促猪胸腺细胞成熟法(E-玫瑰花结法)测定了肽PKUP-2的生物活性。E-玫瑰花结试验结果显示当PKUP-2浓度为1μg/ml时，形成的“红血细胞玫瑰花形成细胞”(ERFC，结合3个或3个以上绵羊红血细胞的成熟猪胸腺细胞)占猪胸腺细胞总数的26％，比不加PKUP-2的空白试验4.2％，增加了21.8％。
上述实验结果表明，本发明的活性肽具有免疫功能，可用于制备提高人体免疫功能和抗肿瘤的药物。
本发明的优异之处是，没计合成了十个新的活性六肽，该类多肽具有免疫功能，可用于制备药物。
为了更清楚地说明本发明，列举下列实施例，但其对本发明无任何限制。
实施例1用同步多重法合成PKUP-1和PKUP-2两个活性六肽，其中所用的固相载体为氯甲基树脂，所用的氨基酸均用Boc集团保护α-氨基，赖氨酸侧链保护为CIZ，具体步骤如下1．氨基酸的固定称取1.00g(1.05mmol/g)氯甲基树脂，悬浮于10ml无水DMF中，加入0.65g(2.5mmol)Boc-异亮氨酸和1.4ml(约2.0mmol)DCHA，并加入15mgBu4NI，在70℃油浴中搅拌60小时。冷却后过滤。树脂依次分别用DMF、DMF/H2O(9∶1)、DMF、EtOH(无水)各洗涤三次，抽干，再于50℃下真空干燥。
2．封闭残余氯甲基将干燥好的Boc-异亮氨酸-树脂加入到梨形瓶中，加入约为氯含量10倍的冰醋酸和DCHA，及适量的DMF，在70℃下搅拌1小时，冷却后过滤，树脂依次用DMF,DMF/H2O(9∶1)，无水乙醇，二氯甲烷洗涤，抽干，真空干燥。
3．封闭可能的羟基将上述树脂放入梨形瓶中，加入苯甲酰氯、吡啶各1ml，无水二氯甲烷5ml，室温下搅拌1小时。过滤后，脂树用DMF,DMF/H2O(9∶1),DMF,无水乙醇各洗两次。真空干燥。
4．树脂上氨基酸含量的测定准确称取一定量封闭羟基后的Boc-异亮氨酸-树脂，脱保护后，通过在波长570nm下测定其和茚三酮显色反应后的吸光度，得出氨基酸含量。
5．接肽采用常规的逐步缩合固相合成法(HOBt/DCC)，并结合同步多重法合成PKUP-1和PKUP-2，用茚三酮法检测缩合反应的完全程度，合成的多肽达到预定长度后，洗涤，干燥，待切。
6．切肽将待切的肽-树脂加到聚四氟乙烯反应器中，加入少量(约0.5ml)的苯甲醚，充分润湿树脂，将反应器接入体系，抽真空，在液氮冷却下，通入干燥HF，在冰水浴下搅拌反应1.5小时后，减压除去HF，用无水乙醚将树脂及脱保护后的肽充分洗净，转移至玻璃砂漏斗中，用10％醋酸将肽洗下。冷冻干燥得粗品肽。
7．纯化分离粗品肽先经凝胶柱分离，收集PKUP-1和PKUP-2的混合物。再经反相高压液相色谱分离。分别收集峰1及峰2的流出液，冷冻干燥。
8．分析结果氨基酸分析结果及FAB-MS的测定均证明以上峰1及峰2分别给出的PKUP-1和PKUP-2，符合预期结构要求，纯化后的PKUP-1和PKUP-2在分析型反相高压液相色谱上均显示单峰。分析数据见下表编号 丙氨酸 脯氨酸 缬氨酸 赖氨酸 亮氨酸 谷氨酰胺 异亮氨酸 FAB-MSm/ePKUP-1理论值 111 111 639.53实验值1.00 1.13 1.05 0.99 1.09 1.03 639PKUP-2*理论值11 1 111 668.49实验值0.98 1.080.96 1.05 1.051.00668
(c=0.9,in H2O)实施例2活性肽PKUP-2对肿瘤坏死因子(TNF)活性的增强作用将传代的小鼠L929细胞株配成3×105cell/ml，种于96孔培养板上(100μl/孔)在37℃、5％二氧化碳条件下培养24小时，使细胞贴在培养板底部。倒去上层清液，每孔加入含有TNF的肽样品100μl，使孔内肽样品浓度分别为0.1,0.01和0.001mg/ml，再在每孔加入放线菌素D0.2μg，在37℃,5％二氧化碳条件下培养24小时，倒尽培养板上之上清液，每孔加入100μl浓度为2％的结晶紫，室温放置10分钟后，冲掉结晶紫浮色，晾干。每孔加入100μl浓度为1％的十二烷基硫酸钠，放置数分钟后在酶联仪上测定570nm处的光密度值(OD)。其结果如下空白TNF CPKUP-2(mg/ml)(单独使用)0.1 0.010.001OD1.290.84 0.790.560.60ΔOD％*0-5.95 -33.3 -28.6*AOD％=[OD(TNF+PKUP-2)-OD(TNF)]÷OD(TNF)×100％结晶紫只染色L929活细胞，死细胞不被染色。经TNF杀伤后的靶细胞部分死亡，死亡的比例越大OD值越低。从以上数据可以看出本发明的活性肽PKUP-2对TNF活性有明显的增强作用。
权利要求
1．一种多肽，其特征在于，所述多肽的结构如通式(1)所示丙氨酸-脯氨酸-A-B-谷氨酰胺-异亮氨酸(1)式(1)中的A代表缬氨酸或赖氨酸；式(1)中的B代表亮氨酸或赖氨酸，A和B同时为赖氨酸者除外；式(1)中的丙氨酸的构型为L型或D型，未指明者即为L型；式(1)中的羧端基为游离羧基或酰胺基，未指明者即为游离羧基，
2．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为缬氨酸和亮氨酸的多肽，
3．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为赖氨酸和亮氨酸的多肽，
4．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为缬氨酸和赖氨酸的多肽，
5．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为缬氨酸和亮氨酸的多肽，其丙氨酸的构型为D型，
6．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为赖氨酸和亮氨酸的多肽，其丙氨酸的构型为D型，
7．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为缬氨酸和赖氨酸的多肽，其丙氨酸的构型为D型，
8．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为赖氨酸和亮氨酸的多肽，其羧端基为酰胺基，
9．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为缬氨酸和赖氨酸的多肽，其羧端基为酰胺基，
10．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为赖氨酸和亮氨酸的多肽，其丙氨酸的构型为D型、羧端基为酰胺基，
11．按照权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽的结构为通式(1)中的A和B分别为缬氨酸和赖氨酸的多肽，其丙氨酸的构型为D型、羧端基为酰胺基，
12．权利要求1至11各项所述的多肽的用途，其特征在于，所述的多肽用于制备提高免疫功能、抗肿瘤或抗衰老的药物。
全文摘要
本发明涉及一类具有提高免疫功能的活性多肽及其应用。该类活性多肽是以从荞麦花粉中分离得到的一个十二肽为模型,设计合成的十个六肽。经过生理活性实验表明,该类活性多肽具有提高免疫功能和抗肿瘤作用。
文档编号A61K38/08GK1210110SQ9811747
公开日1999年3月10日 申请日期1998年9月7日 优先权日1998年9月7日
发明者宋艳玲, 张广利, 王霞 申请人:北京大学