专利名称：：一种活性单肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及血管紧张素I转换酶抑制肽以及它的类似物，或者其盐类中的一种所构成的ACE抑制剂，具体地说是一种从牡蛎可溶蛋白酶解产物中分离得到的活性单肽及其应用。技术背景高血压是最常见的心血管疾病之一，长期的高血压能引起动脉硬化、心绞痛、心肌梗塞、终末期肾病等多种疾病，严重威胁着全世界15—20%的成年人的身体健康。因此，治疗和预防高血压对提高人类的健康水准，延长寿命有着重要的意义。血管紧张素I转换酶(angiotensinIconvertingenzyme,略称为ACE)是一种Zn2+依赖型二肽外切肽酶，在人体肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统中，对血压调节起着重要的作用。ACE可以将血管紧张素I转换为血管紧张素II，使周围小动脉、血管平滑肌收縮，同时刺激醛固酮分泌，促进人体肾脏对Na+、K—的重吸收，引起钠储量和血容量的增加，使血H;:升高；还可以使舒缓激肽失活，引起血压升高。因此ACE抑制剂的研究是开发高血压药物的热点。现有的作为治疗高血压的合成物如卡普托利、爱诺普利等ACE的抑制剂均具有很多副作用，而源于食品蛋白的ACE抑制活性肽无毒副作用，市场前景好。曾经有人从牛的脊髓中分离纯化得到与本文所提到的序列相同的九肽(见5/oc/2em/cfl/Sfop/2j^s7'ca/iasearc/7Commww/caf/ow51，Volume202,Issue1，15My1994，Pages410-415)，并研究讨论了此九肽的阿片活性，然而，对于此活性单肽的ACE抑制活性至今尚未见报道。
发明内容本发明提供一种由食品来源的、高安全性的、廉价的、具有可产业化的活性单肽及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种活性单肽，其具有序列表NO.l的氨基酸序列。所述的活性单肽及其盐类，它们具有ACE抑制活性，可在制备治疗和预防高血压药物中的应用；本发明相关的ACE抑制剂，使用量是没有特别的限制，具体的要报据高血压的程度，患者的年龄，体重，身体状况和给与的方法等因素，适"1地确定。所述药物可为活性单肽及其盐类与充填剂所形成的各种形式的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、水溶液、悬浮液、乳化液、喷剂或粉剂，通过U腔摄取或者是注射液的形式使用；其使用可以采取经口腔和非经口腔的投入方法非经口腔的投入可以采取皮下和静脉注射，肛肠投入等；注射液的制作可以任意选用生理盐水、葡萄糖、安定剂、防腐剂、悬浮剂、乳化剂等。所述药物可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健食品。食品的形态可以是液体的，比如像清凉饮料、乳酸饮料、调味品、汤类、同体的奶酪、火腿、点心等。所述活性单肽及其盐类是从牡蛎可溶蛋白中分离得到的。将新鲜牡蛎去壳，除内脏，将白色肌肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎后，将其加到等体积的PBS(0.2mol/LNaH2P04和0.2mol/LNa2HP04按体积比39:61混合，pH7.0)缓冲液中，充分搅拌。于4。C条件下，静置6小时后，离心(5000Xg，4°C)25分钟。取上清液，加入硫酸铵，并使其最终浓度达到75%，并在4。C条件下，静置6小时，离心(5000Xg，4°C)25分钟。将沉淀与少量水混溶，装入透析袋(MW10000)。流水透析24小吋,再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎可溶蛋白。牡蛎可溶蛋白经胃蛋白酶酶解24小时后，酶解产物经超滤(取分子量小于10000道尔顿的组分)后，采用SephadexLH-20，流动相为30%的甲醇，柱温为室温，检测波长为280nm，按时间收集。经SephadexLH-20分离后得到的具有ACE抑制活性的组分在经C,8高效液相色谱分离纯化，分离条件为流动相A液为含O.P/。TFA的水溶液，用前超声脱气；流动相B液为:100X的乙腈，检测波长215nm，室温，进样体积20^1，采川梯度洗脱，按时间收集。洗脱梯度0-40minA液100%-0%线性降低；B液0%-100%线性升高，40-50minA液0%;B液100%。从牡蛎可溶蛋白酶解产物中分离得到的活性单肽，高效液相-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS)测定此活性肽的分子量为1195道尔顿，经氨基酸测序仪检测(Model491,AppliedBiosystems,USA)其氨基酸序列为缬氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-苯丙氛酸(Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe;VVYPWTQRF)。本发明通过对牡蛎可溶蛋白酶解液的进一步分离、纯化得到了其氨基酸序列为VVYPWTQRF的肽，是有效的ACE抑制剂。检测了人工合成的VVYPWTQRF对ACE抑制活性，证明它对ACE具有较强的抑制作用。上述肽及肽的类似物的盐类可以用通常的方法生产。公认的与酸反应产生的盐类，比如说盐酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸；蚁酸、乙酸、W酸、甘氨胆酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸等有机酸等形成的盐类；公认的与金属离子形成的盐类，包括钠盐、钾盐、钙盐、铰盐；以及氨基乙醇、二乙氨、二环乙氨等形成的胺类盐等没有特别的限制。本发明应用现代酶催化技术对牡蛎可溶蛋白进行酶解，利用生物分子分离技术对具有ACE抑制活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的单肽进行氨基酸序列分析，并研究了此肽在体内、体外对ACE抑制活性的稳定性，结果表明此肽有较强的降血压效果。图1为SephadexLH-20柱分离酶解产物液相图谱；图2为用RP-HPLCHypersilC18柱分离寡肽图谱；图3为纯化的九肽浓度与ACE抑制活性关系曲线。具体实施方式卜'面结合实施例对本发明作进一步的阐述实施例l牡蛎可溶蛋白的制备将新鲜牡蛎去壳，除内脏。留存的白色蛎肉、鳃和体液用匀浆机在低温状态下切碎。之后，将其加到等体积的PBS(0.2mol/LNaH2POjn0.2mol/LNa2HP04按体积比39:61混合，pH7.0)中，充分搅拌。于4。C条件下，静置6小时后，离心(5000Xg，4°C)25分钟。取上清液，加入硫酸铵，使其最终浓度达到75%，并在4。C条件下，静置6小时，离心(5000Xg，4°C)25分钟。将沉淀与少量水混溶，装入透析袋(MW10000)。流水透析24小时,再用去离子水透析24小时，然后将内容物真空冷冻干燥，得到牡蛎粗蛋白粉末，-20°(:保存。实施例2牡蛎可溶蛋白的酶解牡蛎可溶蛋白溶于0.05mol的礴酸缓冲液中(用lmol/L的HC1调pH2.0)，蛋白浓度2.5%，酶与底物的比，加入胃蛋白酶，酶与底物的比为l:50(质量比)，在37。C下酶解24小时。所得酶解液加热至100°C，并保持10分钟，使蛋白酶失活。之后调节水解液pH为中性，离心(5000Xg，室温)25分钟，经超滤膜(MW10000)过滤，透过超滤膜的组分，进行真空冷冻干燥，为牡蛎寡肽，-20°<:保存。实施例3牡蛎寡肽的分离由牡蛎可溶蛋白酶解液15ml经SephadexLH-20柱进行层析分离(如图1所示)，用30%的甲醇溶液洗脱，按管数收集，20分钟/管，收集具有较强ACE抑制活性的部分继续在RP-HPLC上分离纯化(如图2所示)，。在RP画HPLC上用Hypersil(318柱，流动相A液为0.1%TFA的水溶液，川前超声脱气；流动相B液为100%的乙腈，检测波长215nm，室温，进样体积20pl，采用梯度洗脱，按时间收集。洗脱梯度0-40minA液100%-0%线性降低；B液0%-00%线性升高，40-50minA液0%;B液100%。获得的活性单肽，具有序列表NO.l的氨基酸序列。测定此活性肽的分子量为1195道尔顿，经氨基酸测序仪检测(Model491,AppliedBiosystems,USA)其氨基酸序列为缬氨酸-缬氨酸-酪氨酸-脯氣酸-色氨酸-苏氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-苯丙氨酸(Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe;VVYPWTQRF)。其空间结构为线性单链，九个氨基酸，最初来源为牡蛎(Ostrea(Crassostrea))，特性名称为PEPTIDE。实施例4ACE抑制活性的检测原理ACE可把Hip-His-Leu降解成Hip和His-Leu，通过高效液相色谱在228nm的波长下检测Hip(马脲酸)含量来计算样品对ACE活性的变化。实验方法在5uL样品中，加入5uL的ACE酶，5min后力口25uL底物，30min后加5uL的TFA(三氟乙酸)，上述操作过程全部在37t恒温条件下进行。流动相的配制300mL甲醇加入0.5mL冰醋酸和lmL10%的丁FA，用蒸馏水定容至1000mL，用NaOH调节pH至3.3。具体实验将合成EH]VVYPWTQRF分别配制不同Ak度检测ACE抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>如图3所示，经计算最终IC50=0.079mg/ml=79|iig/ml=0.066pmol/ml序列表SEQUENCELISTING<110>中国科学院大连化学物理研究所U20>—种活性争教及其应用〈130><160〉1〈170>PatentInversion3.1〈210〉1〈211〉9〈212〉PRT〈213>Ostrea(Crassostrea)〈220>〈221〉PEPTIDE<222〉(1)..(9)〈223〉〈400〉1ValValTvrProTrpThrGinArgPhe1权利要求1.一种活性单肽，其特征在于其具有序列表NO.1的氨基酸序列。2、一种权利要求1所述的活性单肽及其盐类，它们具有ACE抑制活件，可在制备治疗和预防高血压药物中的应用。3、按照权利要求2的应用，其特征在于所述活性单肽及其盐类是从牡蛎可溶蛋白酶解产物中分离得到的。4、按照权利要求2的应用，其特征在于所述药物可为活性单肽及其盐类与充填剂所形成的各种形式的散剂、颗粒剂、片剂、胶囊、水溶液、悬浮液、乳化液、喷剂或粉剂。5、按照权利要求2的应用，其特征在于所述药物可以添加到各种食品当中，作为抑制血压保健食品。全文摘要本发明涉及血管紧张素I转换酶抑制肽以及它的类似物，或者其盐类中的一种所构成的ACE抑制剂，具体地说是一种从牡蛎可溶蛋白酶解产物中分离得到的活性单肽及其应用，其具有序列表NO.1的氨基酸序列。本发明应用现代酶催化技术对牡蛎可溶蛋白进行酶解，利用生物分子分离技术对具有ACE抑制活性较强的部分进行分离纯化，对纯化得到的单肽进行氨基酸序列分析，并研究了此肽在体内、体外对ACE的抑制活性及稳定性，结果表明此肽有较强的降血压效果。因此，可以将此活性肽及其衍生物或者其盐类作为高血压患者的长期治疗药物，或者作为食品添加剂制成保健食品。文档编号C07K14/435GK101210047SQ20061015582公开日2008年7月2日申请日期2006年12月29日优先权日2006年12月29日发明者杜昱光,王佳培,白雪芳,胡建恩申请人:中国科学院大连化学物理研究所