专利名称：：包含纤连蛋白结合蛋白或纤连蛋白结合肽的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种组合物，其包含至少一种纤连蛋白结合蛋白、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一个纤连蛋白结合结构域；以及至少一种iscom基质复合物和/或脂质体和/或至少一种脂质和至少一种皂苷，由此所述至少一种脂质和至少一种皂苷可处于复合物、溶液或者悬液之中。另外，本发明还涉及其在制备抗包含至少一个纤连蛋白结合结构域的微生物的疫苗中的用途。本发明还涉及其部件中包括至少两个区室的试剂盒，其中一个区室包含至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽，其包含至少一个纤连蛋白结合结构域，并且另一个区室包含使用说明和/或iscom基质复合物和/或iscom复合物和/或脂质体。此外，本发明涉及动物疫苗接种的方法。
背景技术：
：SA是一种病原体，其几乎在所有哺乳动物物中引起疾病。SA是在牛、绵羊和山羊物种中的重要病原体，其在遍及全世界的乳业养殖类包括牛、绵羊和山羊(家畜)在内的饲养中引起疾患以及很大的经济损失。SA诱发的乳腺炎也许是兽医领域中单个最重要的经济负面因素，这是由于其致病性造成的，包括严重的急性和疼痛炎症、慢性和持久性病况以及难于高效治疗，这主要基于因抗性导致淘汰而可能无用的抗生素。替代方案是接种疫苗，但是迄今为止没有发现高效的疫苗，疫苗接种可以构成对抗由SA引发乳腺炎的基础。有几种病原性因子对于期望的抗SA感染保护性疫苗需要克服。例如，SA将抗原"隐藏"在对于感染和其存活所必需的细胞中。此外，SA具有操纵宿主免疫系统以辅助细菌生存的能力。这种复杂的情形是不能获得抗乳腺炎的高效SA疫苗的一个原因。操纵并可以下调宿主免疫应答的SA组分包括分泌产物比如a-和(5-毒素、杀白细胞素。同样涉及细胞结合组分比如超抗原和蛋白质A。细菌躲藏其感染的宿主免疫系统的必需结构的实例是纤连蛋白结合蛋白(FnBp)或者外部纤维蛋白因子(Ebf)，其对于SA粘附至组织例如伤口是必需的。已经从不同的革兰氏阳性细菌中分离并表征了几种识别粘性基质分子的纤连蛋白结合性微生物表面組分。已经克隆并测序了来自金黄色葡萄球菌(""/^/ococcws做m/s)(Signasetal.,"NucleosidesequenceofthegeneforafibronectinbindingproteinfromStaphylococcusaureus:Useofthispeptidesequenceinsynthesisofbiologicallyactivepeptides,"Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86:699-703，1989)、酿脓链球菌(5^印tococcws/;"gertes1)(Talayetal""Fibronectin國bindingproteinofStreptococcuspyogenes:Sequenceofthebindingdomaininvolvedinadherenceofstreptococcitoepithelialcells,"Infect.Imm叫60:3837-3844，1992.;Hanskyetal.Infect.Immun.，60:5119-5125,1992)和停乳链球菌(5"加/^occms办sgfl/flWae)(Lindgrenetal，"Twodifferentgenescodingforfibronectin-bindingproteinsfrom5^ep^cflcc"sdysgalactiae—thecompletenucleotidesequencesandcharacterizationofthebindingdomains,"Eur.J.Biochem,214:819-827，1993.)的编码识别粘性基质分子的纤连蛋白结合性微生物表面组分的基因。所推导的M^列显示出它们具有非常相似结构构造的60-100kDa蛋白质。N端信号序列的后面是一长段独特序列，在某些情况中其被两拷贝约30个JL&酸长的片段中断。配体结合位点',位于富含脯氨酸结构域的N端，据信其将所述蛋白质锚定于细胞壁中。该结构域后接着是作为细胞壁把向信号的序列LPXTGX(Schneewindetal"Science,268:103-106，1995.etal"1995)，一段代表跨膜单元的疏水残基以及含有一簇正电荷残基的短C端细胞质结构域。无乳链球菌(iS^cptococcMS"^i/flf"Zfle)和乳房链球菌(iS^eptococcMS1w6m's1)以及凝固酶阴性葡萄球菌具有相似的纤连蛋白结合装置并且对牛和绵羊物种中的乳腺炎特别相关。凝固酶阴性葡萄球菌也具有FnBp并引发乳腺炎。在这些识别粘性基质分子的微生物表面组分上的主要纤连蛋白结合位点由重复3-4次的30-42个氨基酸长的基序所组成，并且多数重复单元含有共有序歹1(Lindgrenetal"1993loccit;McGavinetal""FibronectinreceptorsfromStreptococcusdysgalactiaeandStaphylococcusaureus:Involvementofconservedresiduesinligandbinding,"J.Biol.Chem.268:23946-23953，1993.)。该结构域由重复3或4次的、37-40个氨基酸的单元所组成(USP6，685，943的图1)。因此，基于粘附功能并且更作为细M逸作用靶标来作为主要的抗SA保护机制，FnBp是配制抗包括SA在内的几种革兰氏阳性细菌的保护性疫苗的重要粘附蛋白(抗原)。重要的是，FnBp存在于来自革兰氏阳性细菌比如酿脓链球菌(5^印toccMS/^"ge"^)和/或停乳链球菌(flfj^a/flcftVie)和无乳链球菌(iS^e/7勿coccwsflgfl/acftW)和乳房链球菌(5^印to"cc"sw&n's)和凝固酶阴性葡萄球菌的许多分离林中。其中接近100%的SA分离林。疫苗不但用于保护牛以抵抗由SA感染引起的乳腺炎，而且用于包括A^内的几乎所有受由SA引发感染所影响的动物物种。根据几种因素，包括地方株和临床情况，疫苗抗原的组成可以在抗革兰氏阳性细菌包括SA感染和SA所引起疾病的疫苗中有变化。粘附至纤连蛋白介导感染过程中的重要和常见因素，并且这种蛋白质存在于几乎所有SA分离株中。阻断粘附和中和是通过抗体由IgGl实现的作用，然而IgG2a对于作为抗SA的主要免疫保护性机制的吞噬作用是重要的。鉴于SA也是细胞内寄生物的事实，免疫系统的细胞介导分支(CMI)是重要因素。已有充分的文献记栽iscom系统强力增强CMI尤其是细胞毒性T细胞杀伤受感染细胞例如感染SA的细胞。因此，基于iscom技术的佐剂制剂具有诱发几种免疫保护性机制的能力。包含FnBp的iscom已经才艮道过(A7cAwso/！Nelsonetal,2000，Symposium,StresaItaly,Proceedings,426-4319)。FnBp被惨入iscom基i中从而与完整抗原一起形成iscom。然而Nelson的iscom制剂不具有足够的免疫原性并且不能用于疫苗，这在一定程度上是由于该制剂只诱导很短持续期的免疫性。基于iscom基质或脂质体(matrixorliposome)作为佐剂的本发明提供好得多的免疫性(见本发明中实施例5的比较)。此外，根据本发明的疫苗制剂更好地适于大规模生产，因为本发明中应用的iscom技术只需要向疫苗抗原悬液中加入iscom基质。现已证实iscom技术非常适于制备抗革兰氏阳性细菌、包括金黄色葡萄球菌SA在内以及尤其是抗牛物种中乳腺炎的疫苗组合物。
发明内容本发明涉及一种组合物，其包含至少一种纤连蛋白结合蛋白、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一个纤连蛋白结合结构域；以及至少一种iscom基质复合物和/或脂质体和/或至少一种脂质和至少一种皂苷，由此所述至少一种脂质和至少一种皂苷可处于复合物、溶液或者悬液中。另外，本发明涉及其在制备抗包含至少一个纤连蛋白结合结构域的微生物的疫苗中的用途。本发明还涉及其部件中包括至少两个区室的试剂盒，其中一个区室包含至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽，其包含至少一个纤连蛋白结合结构域，并且另一个区室包含使用说明和/或iscom基质复合物和/或iscom复合物和/或月旨质体。》匕夕卜，本发明涉及个体疫苗接种的方法。通过以下的表和图来阐明本发明。表l:l用纤连蛋白结合蛋白(FnBp)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自4矣选疫苗间隔4周皮下免疫两次。表2:1用破伤风类毒素(TT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候选疫苗间隔4周皮下免疫两次。表3:1用白喉类毒素(difteritoxiod)(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候选疫苗间隔4周皮下免疫两次。表3:1用白喉类毒素(difteritoxiod)(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候选疫苗间隔4周皮下免疫两次。图1:1用含于各种佐剂制剂中的FnBp第二次免疫Balb/C小鼠之后，对纤连蛋白结合蛋白(FnBp)的lgGl和IgG2亚类的血清抗体应答。图2:1用含于各种佐剂制剂中的TT第二次免疫Balb/C小鼠之后，在IgGl和lgG2亚类中所测量的对破伤风类毒素(TT)的血清抗体应答。图3:1用含于各种佐剂制剂中的白喉类毒素(DT)第二次免疫Balb/C小鼠之后，对白喉类毒素(DT)的lgGl和IgG2亚类的血清抗体应答。图4:1至4:4在进入喷乳期之前，用iscom基质作为佐剂的FnBp初次免疫10只小母牛，分别经阴道内(ivag)途径(4:1)(图中显示3只动物中的一只)；或者经鼻内(i.n.)实施初次免疫(4:2)(图中显示3只动物中的一只)，或者经皮下(s.c.)施用(4:3)(图中显示4只动物中的1只)。3至4周后并且在哺乳期开始以后对所有组经皮下实施第二次免疫。用ELISA通过测量如图中所示的总Ig、IgGl、IgG2和IgA来分析血清和乳清中的抗体应答。图5:1以iscom基质作为佐剂用FnBp间隔6周疫苗接种两次的4-7月龄的5只小牛中对纤连蛋白结合蛋白(FnBp)的抗体应答。记录第一次免疫之后IgM和总IgG类型的免疫应答。第二次免疫后，i己录IgGl和IgG2亚类的抗体应答。图5:2在用各种制剂(见下)间隔6周疫苗接种两次的4-7月龄小牛中对a(A)和(J(B)毒素的抗体应答。通过毒素中和试验测量抗体应答。每組中的5只小牛按下述进行免疫组A:以iscom基质作为佐剂的FnBp组B:在第一次免疫时应用FnBp加上金黄色葡萄球菌(SA)以及a和P毒素并用iscom基质作为佐剂,其后只应用FnBp组C:在两次免疫中均应用FnBp和SA再加上a和p毒素并用iscom基质作为佐剂组D:在两次免疫中均应用SA以及a和p毒素并用iscom基质作为佐剂组E:未免疫的对照图6在用纤连蛋白结合蛋白(FnBp)并补充金黄色葡萄球菌(A)细胞或者a和(3毒素(B)疫苗接种的1-2岁龄小牛中的抗体应答。试验疫苗用iscom基质佐剂。在IgM、总IgG、IgGl和IgG2类和亚类中测量抗体应答。发明详述本发明涉及一种组合物，其包含至少一种纤连蛋白结合蛋白(FnBp)、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一种纤连蛋白结合结构域，以及至少一种iscom基质复合物和/或脂质体和/或至少一种脂质和至少一种皂苷，由此所述至少一种脂质和至少一种皂苷可处于复合物、溶液或者悬液之中。所述组合物可用于制备抗革兰氏阳性菌比如金黄色葡萄球菌(5"鄉^y/。coccMsflw"ws).酉良腺链球菌(iftr印toc0""s/7"^wes1)、停乳链球菌(5^e/toc0ccMS咖艰a/fl"iW),无乳链球菌(5^e/^coccwsagfl/a"/"e)和乳房链永菌(5^印^^ccwsw&A)以及凝固酶阴性葡萄球菌的疫苗。可以应用全长的纤连蛋白结合蛋白以及截短的蛋白质或者肽，只要其包含至少一个纤连蛋白结合结构域或表位。对于截短的蛋白质，我们了解是已缺失一个或多个氨基酸的天然存在或合成产生的全长蛋白质。可以缺失非FnBp结合区中的一个或多个氨基酸。也可以缺失来自FnBp结合结构域的氛基酸。不过，应当至少有一个FnBp结合结构域或表位未受影响。优选所述截短的蛋白质或肽包含一或多个来自革兰氏阳性细菌的纤连蛋白结合蛋白结合结构域，尤其是来自金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌。纤连蛋白结合结构域可以选自来自金黄色葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白A或B的D结构域，比如DU和D1-D4结构域；来自停乳链球菌的纤连蛋白结合蛋白A的A结构域，比如AU和Al-A3结构域；来自停乳链球菌的纤连蛋白结合蛋白B的B结构域，比如B1-B3结构域；以及来自酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白的结构域，比如Pl-P4结构域(见USP6,685,943的图1)。金黄色葡萄球菌的FnBp结合结构域也描述于SignSsetal.:(1989)Nucleotidesequenceofthegenefibronectin隱bindingproteinfrom5"似/^卢"ccwsftwrn/s:Useofthispeptidesequenceinthesynthesisofbiologicallyactivepeptides.iVoc.7Vflf/y4cfl^/.5"c/.t/5^4，Vol:86pp.699-703。所述截短蛋白质或肽可以在一个或多个FnBp结合结构域例如上述D、A、P结构域的上游或者下游包含1-200、优选1-100比如1-50、比如1-20个氨基酸。所述截短蛋白质和肽可以是天然存在的氨基酸序列或者是合成产生的，或者通过杂交DNA技术产生。这些FnBp结合结构域中的一种或多种或者包含一个或多个上述FnBp结合结构域的几个重复单元可以根据本发明来产生和应用。在USP6，685，943中描述了如何获得天然存在的和合成产生的FnBp结合结构域。对Fn-结合结构域或表位的鉴定在本领域中是普遍公知的。例如，可以使用Hopp的方法，如U.S.Pat.No.4,554,101中所教导的，其教导基于亲水性来鉴定和制备氨基酸序列的表位。也能够应用在其它几个文献中描述的方法、以及基于其的软件程序来鉴定表位核心序列(见，例如，JamesonandWolf,1988;Wolfetal"1988;U.S.Pat.No.4,554,101)。随后可以通过应用肽合成或者重组技术将这些"表位核心序列"的氨基酸序列很容易的掺入肽中。通常，所述结构域或者表位的大小不是特别关键，只要它至少大到足以结合FnBp即可。根据本发明公开内容所预期的最小有用核心序列通常在约至少5个氨基酸长的水平，更优选10或50个氨基酸长水平的序列。可以应用一个或多个FnBp结构域或表位。鉴定表位核心序列的方法对于本领域技术人员是已知的，例如，如U.S.Pat.No.4,554,101中所述，其教导基于亲水性来鉴定和制备氨基酸序列的表位。此外，有许多计算机程序可用来预测蛋白质的抗原性部分(见例如，JamesonandWolf，1988;Wolfetal.，1988)。计算机化的肽序列分才斤禾呈序(例如，DNAStar7软件，DNAStar,Inc.，Madison,Wis.)也可用来设计根据本发明公开内容的合成FnBp，以及源于FnBp的表位和表位类似物。就此来说，通过制备包括表位/免疫原性核心序列的合成肽可以实现特别的益处。这些表位核心序列可被鉴定为多肽的亲水性和/或可移动区域或者包括T细胞基序的区域。为确认蛋白质或者肽或者与其生物功能等价物具有免疫交叉反应性，本发明所公开肽的一种或多种表位也是直接的主题。应用特异性分析法，例如单个建议表位序列的特异性分析，或者应用更一般性筛选，例如对随机产生合成肽或者蛋白质片段库的筛选，能够很容易地对此进行确定。所述筛选分析可用来鉴定等效抗原或者交叉反应抗体。无论如何，原则是相同的，即，基于对抗体和抗原之间结合位点的竟争。可利用的适当的竟争性分析包括基于免疫组织化学分析、ELISA、RIA、Western或者斑点印迹等的方案。在任何竟争性分析中，一种结合组分，通常是已知元件比如源于FnBp的肽、或者已知抗体，将会用检测标签进行标记，并且通常保留未标记的待测组分将会被用来检测它们降低结合于相应反应性抗体或抗原的标签的量的能力。可以依照实施例、实施例1之前的概述和实施例1中所述获得可用于根据本发明用途中的肽。为了更好的纯化所述截短的蛋白质或肽，它们可以通过DNA工程和编码对可用于分离的物质具有亲和性的氨基酸序列的插入序列来产生。例如可以分别引入6组氨酸；一个或多个正电氨基酸；和/或蛋白质A的与螯合(Ni-或Co-)物质结合的zz(z)区；离子交换物质和免疫亲和物质。这些方法在本领域中是公知的。纤连蛋白结合蛋白、包含至少一个纤连蛋白结合结构域的截短纤连蛋白结合蛋白以及纤连蛋白结合肽可以从上述任何细菌的细菌细胞中分离。它们也可以从细菌的分泌产物中分离。此外，根据公知技术，所述抗原可以作为来自细菌细胞、真菌或者来自哺乳动物细胞的rDNA产物而产生。它们也可以在载体系统中产生；或者用所谓的DNA疫苗免疫之后或者作为本领域公知的所谓RNA疫苗进行免疫之后在体内产生。它们也可以作为融合蛋白并且是例如来自细菌细胞的rDNA产物而产生；作为融合蛋白并且是来自真菌细胞的rDNA产物而产生；作为融合蛋白并且是来自哺乳动物细胞的rDNA产物而产生；或者在来自细菌细胞的栽体系统中作为融合蛋白而产生；在来自真菌细胞的载体系统中作为融合蛋白而产生；在来自哺乳动物细胞的栽体系统中作为融合蛋白而产生。此外，所述融合产物可以是蛋白质与来自革兰氏阳性细菌诸如金黄色葡萄球菌，酿脓链球菌，停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌的碳水化合物荚膜抗原之间的偶联体，或者所述融合蛋白质产物可以是两个蛋白质之间的偶联体，其中至少一个蛋白质为来自任何上述微生物的细菌蛋白质比如金黄色葡萄球菌蛋白质。所述纤连蛋白结合蛋白和/或截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽可以整合入脂质体中或者与iscom基质或脂质体(matrixorliposome)相混合或者结合于脂质体或者iscom基质。在本发明组合物中的iscom基质复合物包含至少一种糖苷和至少一种脂质。所述脂质至少是固醇比如胆固醇并且还任选是磷脂酰胆碱。所述基质对共施用的抗原性物质具有免疫增强效应，见EP0436620Bl并且可以根据本专利的描述来产生。所述组合物iscom、基质复合物和/或脂质体也可以包含一种或多种其它免疫调节性(佐剂活性)物质，而不必是皂苷，例如脂多糖(LPS)、脂质A或脂质A衍生物、CT或LT以及它们的亚片段或者其衍生物，例如，LTB、LTA、CTB、CTA或CTA1-DD。所述iscom基质可以是一种或多种iscom基质颗粒或者其6纳米环的任何亚片段。可以使用这些iscom基质、颗粒或亚片段的任何混合物。根据EP9600647-3(PCT/SE97/00289)所述，可以使用一种或多种抗原以及可以使用转运和过客抗原。所用脂质尤其见本申请人的专利EPO109942Bl中尤其是第3页以及专利EP0436620Bl中第7页第7-24行描述的那些。尤其可使用固醇比如胆固醇和磷脂比如鳞脂酰乙醇胺和磷脂酰胆碱。可以使用结合于细胞结合组分的含脂质受体，比如包括作为神经节苷脂GM1的霍乱毒素受体在内的糖脂，以及岩藻糖化的血型抗原。所述细胞结合组分随后能够作为粘液靶向分子发挥作用并且通过它们与包含它们的复合物简单混合而结合于所述含脂质的物质。iscom复合物包含这些受体，受体描述于WO97/30728中。在EP0109924Bl中描述了可用的糖苷。优选皂苷和三辟皂普(triterpensaponins)。它们可以是来自皂树(5""/o履"'"Molina)的原始4C取物形式(Dalsgaard，K.(1974)，Arch.GesamteVirusforsch,44,243.)、或者其任何亚组分，如PCT/US/88101842toKensiletal.，Kensil,CA.etal.(1991)，J.Immunol,146,431,Kersten,GF.A.etal.(1990)."AspectsofIscoms.Analytical,PharmaceuticalandAdjuvantProperties;Thesis,UniversityofUtrecht、EP0362279B2和EP0555276Bl中所述。才艮据本发明的一个方面，所述iscom基质复合物包含含皂苷混合物的QuilA粗制或原始提取物或其半纯4匕形式比如QuillajaPowderExtract(Berghausen,USA)、QuillajaUltraPowderQPUF300、QuillajaUltraPowderQPUF1000或者Vax-Sap(所有三种都来自NaturalResponses,Chile)。根据本发明的另一方面，所述iscom基质复合物包含至少一种纯化的糖苷比如来自QuilA的皂苷组分。才艮据本发明的纯化皂苷组分可以是WO96/11711描述的A、B和C组分，EP0436620描述的B3、B4和B4b组分，EP03632279B2描述的组分QA1画22，Q-VAC(Nor-Feed,ASDenmark)，0"/〃"y"MolinaSpikoside(IsconovaAB,UppsalaSciencePark,75183，Uppsala,Sweden)。可以4吏用EP03632279B2的纟且分QA-l-2-3-4画5画6-7-8-9國10誦ll-12-13画14-15-16-17-18-19-20-21和22,尤其可以使用QA國7、17-18和21。它们是根据EP03632279B2、尤其是在第6页以及在第8和9页的实施例1中所述而获得。优选使用亚组分A和C。在整个说明书和权利要求中，使用术语"一种来自皂树(07/fl>Molina)的皂苷组分"作为对皂树(0w///"_/Vi5"fl/w/i"nVi)的纯化*或确定的皂苷组分或者基本纯组分的通称。重要的是，所述组分不含有很多对当4吏用iscom混合物或主要包含一种组分的iscom基质时所获得良好结果有负面影响的任何其它组分。如果期望的话，所述皂苷制备物可以包括少量的其它化合物比如其它皂苷或其它佐剂物质，所述少量例如最高40%重量，比如最高30%重量、最高25%重量、最高20%重量、最高15%重量、最高10%重量、最高7%重量、最高5%重量、最高2%重量、最高1%重量、最高0.5%重量、最高0.1%重量。根据本发明的组合物可以包含至少两种iscom复合物的混合物，其选自iscom基质复合物，每种复合物主要包含一种不同的来自皂树的皂苷组分，如WO2004/004762(PCT/SE03/01180)中所述。在优选使用的基质混合物中，皂树组分和QuilC组分分别掺入不同的iscom复合物或基质。如上所述，分别基于皂树的组分A和C含量，可以使用不同iscom复合物的重量％的任何组合。所述混合物可以包含O.l比99.9%重量、5比95%重量、10比90%重量、15比85%重量、20比80%重量、25比75%重量、30比70%重量、35比65%重量、40比60%重量、45比55%重量、40比60%重量、50比50%重量、55比45%重量、60比40%重量、65比35%重量、70比30%重量、75比25%重量、80比20%重量、85比15%重量、90比10%重量、95比5%重量的包含皂树之组分A(如本文定义)的iscom基质复合物，并且在每一区间情况下其余是最高至100%的包含皂树之组分C(如本文定义)的iscom基质复合物，其中以所述iscom基质复合物中皂树之组分A和C总含量来计算。所述混合物可以包含从75%至99.5%重量的组分A和0.5%至25%重量的组分C。优选地，所述混合物包含从卯％至99%重量的组分A和1%至10%重量的组分C。一种特别优选的制备物包含约91%至98%重量的组分A和约2%至9%重量的组分C，尤其是约92%至96%重量的组分A和约4%至8。/。重量的组分C，其中以所述iscom基质复合物中皂树之组分A和C总含量来计算。任意组合使用上述所有区间。根据本发明可施用制剂的动物物种的实例是伴侣动物比如猫、狗、马、鸟比如鹨鵠，重要经济物种比如家畜，例如牛类物种，猪、绵羊、山羊。优选使用超过50%重量的组分C与任何其它组分相组合，并且尤其是与组分A相组合。因此可以使用从50.5至99.5%重量的C和0.5至49.5%重量的A。根振本发明的一个实施方案，所述iscom基质复合物包含QuilA的组分A以及至少一种如WO2005/002620(PCT/SE2004/001038)中所述的其它佐剂。这种iscom复合物和Iscom基质复合物可以包含占组分A和C总重50至99.9%的QuilA之片段A和0.1至50。/。的片段C和/或组分B和/或QuilA的其它组分或衍生物，其中可以将所述不同的糖苷成分整合入、偶联在或混合于相同或不同的复合物或iscom基质颗粒。也可以将包含至少一个纤连蛋白结合结构域的截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽整合入、偶联于或混合于脂质体中。脂质体可以依照以下所述来制备Gregoriadis,G，McCormack,Obrenovic,M..Perrie,Y.andSaffie,R.InVaccineAdjuvants,PreparationMethodsandReseachProtocols.(2000)Ed.O'HaganD.,pp137-150.脂质体可用作免疫佐剂和疫苗载体。它们也可以被整合入、偶联于或者混合于和/或至少一种脂质和至少一种皂苷，由此所述至少一种脂质和至少一种皂苷可以处于复合物、溶液或悬液之中。优选地，在此所述复合物不是iscom形式。可以考虑所述包含至少一个纤连蛋白结合结构域的纤连蛋白结合蛋白、截短的纤连蛋白结合蛋白和纤连蛋白结合肽作为抗原。根据本发明的组合物可以包含至少一种另外的抗原。根据本发明的一个实施方案，所述的至少一种另外的抗原是以革兰氏阳性细菌全细胞形式的抗原。在本发明的另一个实施方案中，所述抗原是抗原性成分，比如来自细菌细胞或者分泌产物比如a和p溶血素，尤其是来自革兰氏阳性微生物的那些。从中获得这些全细胞和抗原性成分的革兰氏阳性细菌可以是金黄色葡萄球菌、s良脓链球菌，停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌，和凝固酶阴性葡萄球菌。金黄色葡萄球菌细胞意思是指葡萄球菌属的金黄色组。相应的s良脓链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌、和凝固酶阴性葡萄球菌表示所述属的各个组。这也将适用于从中获得FnBp结合蛋白、肽或者结构域的微生物。粘附素可以选自聚集因子(clumpingfactor,clf)、外部纤维蛋白结合蛋白(externalfibrinbindingprotein,efb)、针对纤维蛋白原的A和B粘附素、凝固酶(coagulase，coa)、结合于纤维蛋白原的纤维蛋白原结合蛋白A、附着于纤维蛋白原的纤连蛋白结合蛋白(FnBp)A和B、结合于胶原的胶原蛋白结合蛋白(cna)、结合于弹性蛋白的弹性蛋白结合蛋白(ebpS)、结合于细胞外基质蛋白的MHC类似物蛋白(map或eap)、涉及细胞内粘附和生物膜形成的多糖细胞内粘附素(pia)、涉及可能逃过宿主防御的蛋白质A(spa)、抗吞噬作用分子的荚膜多糖(例如l、5、8和13型)(cap)、或iTechoidacid。成孔因子(poreformingfactors)可以被外泌，并且可以选自a國溶血素、p-溶血素、y-溶血素、s-溶血素、涉及宿主细胞裂解的磷脂酶c(plc)、涉及组织侵入的弹性蛋白酶(sepA)、和涉及组织侵入的透明质酸酶(hysA)。所有提及的组分可以是分离自细菌细胞的蛋白质或者碳水化合物、外泌产物、rDNA产物或者作为rDNA产物表达的融合产物、载体系统中的产物或融合蛋白，所谓的DNA或RNA疫苗，只要它们使用本发明的佐剂系统即可。根据本发明的另一实施方案，所述抗原可以是下调免疫系统的抗原性成分，比如超抗原、荚膜抗原、内毒素、外毒素和细胞外酶。这些外毒素和细胞外酶可以选自肠毒素A至E、H(sea-e,h)、毒素休克综合征毒素-l(tst)(与超抗原一起逃避宿主防御的特性)、剥脱毒素AB(eta，efb,etb)(逃避宿主防御)、脂肪酶(geh)(逃避宿主防御)、Panton-Vallentine杀白细胞素(lukF，lukS)(裂解宿主吞噬细胞)、葡萄球菌激酶(sak)(逃避宿主防御)。上面提及的抗原性成分可以在来自世界不同地区的所述属的組中在物种之间有所差异。上面有关截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽来源的信息也可适用于所述组合物可以包含的至少另外的抗原。根据本发明的组合物还可以包含药用可接受载体、稀释剂、赋形剂或者添加剂。所述药物组合物可以是无菌注射水性或油性悬液的形式。该悬液可以根据公知技术应用那些合适的分散剂或湿润剂和助悬剂进行配制，如上所述。所述无菌注射制备物也可以是在无毒胃肠外可接受稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬液，例如1,3-丁二醇的溶液。可应用的可接受载体和溶剂中有水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油通常用作溶剂或者悬浮介质。为此目的，可以应用任何品牌的不挥发性油，包括合成的单-或二甘油酯。此外，脂肪酸比如油酸也可用于所述注射制备物中。所述溶液或悬液也能够包含至少一种以下佐剂无菌稀释剂比如注射用水、盐水、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或者其它合成溶剂，抗细菌剂比如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯，抗氧化剂比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠，螯合剂比如乙二胺四乙酸，緩冲剂比如醋酸盐、杼檬酸盐或磷酸盐，以及渗透压调节剂比如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、可弃型注射器或多剂量容器。通式I的化合物可经胃肠外施用。本文中使用的术语胃肠外的意思包括有关无针注射-射流注射的输注技术的皮下注射、静脉内、肌内、皮内注射。所述组合物可以是适于包含用于接种例如200只牛的几百剂量的射流注射器用的疫苗组合物形式。根据本发明的组合物还可以包含影响乳房的抗原组合物比如凝固酶阴性葡萄球菌、乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、大肠杆菌样细菌包括克雷伯氏菌属(f/WwV//"spp.)和大肠埃希氏菌(五."//)。本发明也涉及所述组合物用于制备疫苗的用途。所述疫苗意图用于任何哺乳动物比如人，动物比如牛、绵羊或山羊。本发明尤其涉及用于牛、绵羊和山羊动物抗乳腺炎的疫苗接种。本发明尤其涉及用于牛的包含来自金黄色葡萄球菌的抗原并混有iscom基质的乳腺炎疫苗。所述基质优选产自粗制QuilA或者半纯化的QuilA。牛可以在产犊之前进行一次疫苗接种并在产犊之前或之后(优选之后)的一个月进行加强接种。小母牛可以在产犊之前施用两次，优选可能在产犊之后接着施用第三次。本发明的一个实施方案涉及根据权利要求l的组合物，其包含选自毒素和/或来自微生物的全细胞的至少另外一种抗原，所述微生物尤其是革兰氏阳性细菌比如金黄色葡萄球菌、酿脓链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌，尤其是金黄色葡萄球菌。因此，所述组合物可以包含毒素或全细胞或两者都包含。已证明的是，对于超过一岁龄的小母牛而言，当所用的根据本发明的组合物添加来自革兰氏阳性细菌尤其是来自上述任一种比如金黄色葡萄球菌的全细胞和/或毒素时获得更佳的免疫效果。本发明还涉及部件的试剂盒，其中一个区室包含至少一种纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一个纤连蛋白结合结构域，以及另一个区室包含使用说明和/或至少一种iscom基质复合物和/或脂质体。上述革兰氏阳性微生物种，比如来自葡萄球菌属金黄色组的金黄色葡萄球菌，可以在世界不同区域之间有所差异。所述试剂盒的一个区室可以包含根据本发明的iscom基质复合物或脂质体。该区室可以包含一种或多种来自革兰氏阳性微生物例如葡萄球菌属金黄色组的抗原。另一区室可以包含来自可对某些区域有特异性的革兰氏阳性微生物例如来自葡萄球菌属金黄色组的抗原，例如这种特异性可以基于荚膜抗原。这两类抗原可以整合入脂质体，结合于脂质体或iscom基质复合物或者与iscom基质复合物或脂质体相混合。由于上述革兰氏阳性微生物比如来自葡萄球菌属金黄色组的金黄色葡萄球菌可以诱发下调免疫系统的抗原以及不下调免疫系统的抗原，所以能够有益地将在不同制剂中的这些不同类型的抗原施用于动物体的不同部分，以增加免疫之后每种成分的效用。由此试剂盒可以包含至少一个包含至少一种下调免疫系统之抗原的区室和包含至少一种不下调免疫系统之抗原的另一区室。所述组合物和试剂盒也可以包含抗生素。当动物具有上述微生物的亚临床或临床感染时，这可以是有用的。抗原性物质的量可以根据所用物质和微生物以及待处理个体而变化。对于小动物，低剂量是0.1jig至100ng;对于大动物，低剂量范围是10jig至1000ng，尤其是10jig至300ng，所述这些不是限制性界限。对人而言，剂量范围是ljtg至200ng，但这不是限制性界限。本发明也涉及用于哺乳动物比如人尤其是家畜的疫苗接种方法，其中向所述动物施用一种组合物，该组合物包含至少一种纤连蛋白结合蛋白、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，其中它们包含至少一个纤连蛋白结合结构域，以及至少一种iscom基质复合物和/或脂质体。保护性乳腺炎疫苗的免疫方案可以如下进行对于将进入哺乳期的小母牛实施两次间隔5-8周的皮下免疫。在产犊前约10天完成最后免疫。之后推荐在预计产犊之前10-14天进行每年一次的免疫。在母牛具有亚临床或临床SA乳腺炎的情况下，将推荐在干奶期中实施两次间隔2-3周的疫苗接种并联合用抗生素治疗母牛，即免疫和抗生素联合治疗。所有关于所述纤连蛋白结合蛋白、包含至少一个纤连蛋白结合结构域的截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽、脂质、糖普以及除所述纤连蛋白结合蛋白或肽之外的其它添加抗原的信息进行必要的变更后涉及本发明的所有实施方案。本发明已经结合某些公开实施方案进行了描述，技术人员可以预见到没有具体提及的但仍在所附权利要求范围内的其它实施方案、变化或者组合。所有在本文中引用的参考在此以其整体通过参考并入本文中。本文中使用的表述"包含"应被理解为包括但不限于所列的事项。本发明将通过以下非限制性实施例进行进一步的阐述。实施例关于实施例的一般信息材料佐剂Al(OH)3-用于动物和人的传统佐剂。其佐剂作用仍然没有被完全了解。与没有佐剂相比，抗体应答被增强，但是该应答强烈偏向于TH2。对细胞应答没有或者有很低的佐剂作用。AI(OH)3、Allhydrogel来自BrenntagAG^De證ark。Iscom基质佐剂基质-O-由含有全范围不同皂树皂苷分子的半纯化皂树皂苷(Quillajasaponin)制备。其佐剂作用强烈并且包括体液和细胞免疫应答。基质-C由皂树皂苷的一种纯化组分(组分-C)制备。它具有强效的佐剂活性(Johansson,MandL6vgren-Bengtsson，KVaccine17,2894-2900)。其毒性比基质-Q要低很多。基质-OWT由皂树皂苷的另一种纯化组分(组分-A)制备。其佐剂作用被描述为低于基质-C(PCT/SE2004/001038)，但似乎对细胞免疫应答有很强作用。基质-QWT显示出在与佐剂活性相关的剂量中是基本无毒的并且在所有检测过的动物中有非常好的耐受性。基质-MIX—是基质-OWT和基质-C的混合物(由17%基质《和83%基质-QWT所组成)。相似的混合物显示出对单一抗原发挥出高的令人惊奇的佐剂作用(WO2004/004762，PCT/SE2004/001038)。所有基质佐剂制剂来自IsconovaAB,Uppsala，Sweden。抗原福尔马林处理过的破伤风类毒素(TT)得自TheStateSerumInstitute,Copenhagen,Denmark。TT是一种重要的免疫原性抗原。在实施例中应用较高剂量(2.51f)和低剂量(0.5Lf)。对于该特定批次，1Lf的毒素相当于x微克蛋白质。重组白喉类毒素(DT)来自Sigma。在实施例中应用l微克的剂量。纤连蛋白结合蛋白(FnBp)由CrosslinkLtdBudapestHungary制造，是FnBpAShort(396bp，与NC—002951.2的FnBpA具有100%—致性)和FnBpBShort(396bp,与NC002951.2的FnBpB具有95%—致性和来自BiostaproABUlltunaallen2B75651Uppsala,Sweden)的混合物并且是包括16kD纤连蛋白结合结构域的DNA片段，其中所述纤连蛋白结合结构域包括3个DD重复，其包括非免疫结果所必需的半胱氨酸N末端。l卯ng的该构建体与1mgiscom基质/剂量混合。ELISA小鼠血清通过常规间接ELISA在各个样本中测量血清中的抗原特异性抗体。用溶于50mMpH9.6碳酸盐緩冲液的浓度为1fig/ml的单个抗原包被微滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)并在+4n过^L在与样品一起孵育之前，所述板在室温(r.t.)下用添加2V。(w/v)脱脂奶粉的PBS-T(含0.05%Tween的磷酸盐緩沖液)(PBS-T/M)封闭1小时。板子依次与在PBS-T/M中连续稀释的待检血清以及偶联HRP的兔抗小鼠IgG(Dakocytomation，Denmark)—起孵育。对于IgG亚类的测量，用偶联HRP的山羊抗小鼠IgGlHRP(Serotec,Norway)或者用偶联HRP的山羊抗小鼠IgG2aHRP(Serotec，Norway)与连续稀释的待检血清一起孵育。通过与底物緩冲液(K画blue,SVANOVA,Upppsala，Sweden)—起孵育使酶反应显4象，通itia入50nl的2MH2S04^10分钟后终止该反应，并且在450nm处读取吸光度。用PBS-T进行所有洗涤。在PBS-T/M中根据使用说明稀释偶联物。在滴定曲线线性部分通过内插法计算效价并表示为产生1.0吸光度时血清稀释度的倒数。牛血清和乳通过常规间接ELISA在个体血清(乳)样品中测量血清和乳中的抗原特异性抗体。用溶于50mMpH9.6碳酸盐緩冲液的浓度为1pg/ml的FnBp包被微滴定板(Nunc,Roskilde,Denmark)并在+4"C过夜。在与样品一起孵育之前，所i^L在室温(r.t.)下用添加10。/。(w/v)马血清的PBS-T(含0.05%Tween的磷酸盐緩冲液)(PBS-T/H)封闭2小时。板子依次与在PBS-T/H中连续稀释的待检血清(乳)以及偶联HRP的绵羊抗牛IgG(Serotec，Norway)—起孵育。对于IgG亚类的测量，用偶联HRP的绵羊抗牛IgGl(Serotec,Norway)或者用偶联HRP的绵羊抗牛IgG2HRP(Serotec,Norway)、用偶联HRP的绵羊抗牛IgA(Serotec，Norway)与连续稀释的待检血清一起孵育。通过与底物緩冲液(K-blue,SVANOVA，Upppsala，Sweden)—起孵育使酶反应显像，通过加入50pi的2MH2S04在10分钟后终止该^^应并且在450nm处读取吸光度。用PBS-T进行所有洗涤。在PBS-T/H中根据使用说明稀释偶联物。在滴定曲线线性部分通过内插法计算效价并表示为产生lo吸光度时血清稀释度的倒数。抗葡萄球菌抗体使用商品ELISA(金黄色葡萄球菌抗体检测试剂盒，WMRD，Pullman,WA,USA)测量血清和乳中的抗葡萄球菌抗体。实施例1纤连蛋白结合结构域的制备克隆纤连蛋白结合蛋白由CrosslinkLtd.Budapest,Hungary实施项目由CrosslinkLtd.的FerencFel伤l(U撰写才艮告由ISCONOVA,Uppsala,Sweden的Prof.BrorMorein定制内容介绍piA.克隆在C末端具有6-His标签的全长形式plp3B.克隆在C末端具有6-His尾的短形式介绍本项目的目的是克隆并表达来自金黄色葡萄球菌的FNBP基因a.)在C末端具有6-His标签的全长形式用于蛋白质制备；b.)在C末端具有6-His尾的短形式用于连接佐剂；引起牛乳腺炎的菌林由ISCONOVALtd.，Uppsala,Sweden提供。然而，没有获得该菌林的序列信息。A.克隆在C末端具有6-His标签的全长形式在金黄色葡萄球菌中，两种类型的基因编码纤连蛋白结合蛋白质，即FNBPA和FNBPB基因。我们在NCBIDataBank(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中调查了有关FNBP的信息并找到8个金黄色葡萄球菌菌林的序列。在这8个菌林的FNBP基因中只有80%的一致性。为了确保能以全长(除了信号序列之外)扩增我们菌株的FNBP基因，我们必须选择既扩增A又扩增B的引物。制备来自金黄色葡萄球菌的靶DNA通过常规方法制备来自金黄色葡萄球菌的基因组DNA并用作PCR反应中的模板。幸运地是，A和B基因的长度有200bp差异。因此，在长电泳凝胶中分开这两种PCR产物是可能的。分离A基因产物并用于l^的步骤中。1.50ml金黄色葡萄球菌培养物(OD600=2)被离心并在2x25ml洗涤緩沖液(150mMNaCl,50mMTrisHC1[pH:7.5)中洗涤两次。2.细胞被重悬于5ml裂解緩冲液A(10mMEDTA，50mMTrisHC1[pH:7.5，0.1mg/ml溶菌酶)并在室温下保持15分钟。3.加入5ml裂解緩冲液B(2%SDS,50mMTrisHC1[pH:7.4,0.025mg/ml蛋白酶K)。悬液在55匸下孵育过夜。4.用l体积苯酚提取悬液，接着用1体积氯仿+异戊醇进行提取。5.用2.5体积乙醇沉淀DNA并用玻璃^i拌。用70o/。乙醇洗涤DNA并在Eppendorf管中干燥。6.DNA被重悬在250微升TE緩冲液中。在接下来的步骤中，我们用不同的限制性内切酶消化这两种PCR产物以选择其中没有切割位点的PCR产物。它们能够确保在末端克隆而不破坏插入片段。我们发现三种不切割FNBPA的限制性内切酶BamHI、HindIII和Xhol。我们决定继续用FNBPA，并用BamHI和HindIII进行克隆，而用Xhol在C末端添加His标签。用于扩增的引物在其5'末端具有上面的切割位点(粗体文本)CGGGATCCT.GCAGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGTKNBPaRGTAAGCTTATGCTTTGTGATTCTTTTTATTTCTGCGTAAFNBP基因的扩增扩增、克隆并通过测序确认来自期望菌林的全长FNBPA基因。为了使随后的纯化更有效率，基因的膜结合结构域(M)和跨细胞壁结构域的重复和非重复部分(Wl和W2)#皮去除。有关所述结构域的说明见文章SignSsetal.:(1989loc.cit.)Ncol和上面提及的Xhol限制性内切酶适于本目的。在所设计的引物中FnBpNcoCGGGATCCATGGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGT(引物起点在以下参考序列中第2572388位〉ref]NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength=2809422)FnBpD4GAGCTCGAGTGGCACGATTG(5AGGTGTTGTATCTTCT(引物起点在以下参考序列中第2569863位>ref|NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength-2809422)实施以下步骤1.100微升扩增溶液含有10微升10xPCR緩沖液,每种引物(10pmol/jil母液)各IO微升，400孩馎尔dNTP和5UPfu酶。2.扩增实施30个循环，每一循环包括变性(94"C45秒)、退火(65匸l分钟)和聚合(72"C2分钟)。3.在琼脂糖凝胶中检查PCR产物并用SingleSamplePCRCleanupMontagePCRFilterUnits(Millipore)进行纯化。PCR产物的克隆将FNBP基因克隆入pET21d载体。6-His标签的密码子以及随后的终止密码子位于pET21d载体中Xhol切割位点之后。因而，所表达的蛋白质在C末端将包含6-His标签。诱导后实施8小时的表达。表达后细胞用超声进行处理并离心。在SDS-PAGE上用考马斯蓝染色对产物进行检测，其中有或没有Ni-NTA琼脂柱上的制备物。与未经诱导的培养物相比，表达是明确的。实施以下步骤1.PCR产物被重悬在40jilNEB2緩冲液中并在37匸下用Ncol和Xhol限制性内切酶消化2小时。2.用MontageGelExtractionKit(Millipore)从凝胶中纯化消化后片段。3.在50nl反应溶液中将纯化的DNA克隆入pET21d载体中Ncol/Xhol位点。用11U连接酶将载体和插入物连接过夜。4.质粒用2.5体积乙醇进行沉淀，重悬，并根据供应商使用说明经电穿孑L(Bio-Rad)将其引入雄埃希氏菌BL21菌林。5.在LB培养基中培养克隆并通过Ncol/Xhol消化接着凝胶电泳来检验载体中FNBPA基因的插入。6.适宜的栽体再次转化入大肠埃希氏菌BL21菌林，在LB培养基中进行20个30ml平行培养。在OD600=1时用1mMIPTG诱导细胞。B.克隆在C末端具有6-His尾的短形式用以下引物克隆所述短形式。Ncol限制酶和Xhol限制酶的切割位点用粗体字母表示。BGFCGGGATCCATGGAAGGTQGCCAAAATAGCGGTAACCAGT(引物起点在以下参考序列中第2570270位>reflNC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL，completegenomeLength=2809422)BGRGAGCTCGAGAGGTGTTGTATCTTCTTCAATCGTTTGTTG(引物起点在以下参考序列中第2569875位>ref!NC002951.21Staphylococcusaureussubsp.aureusCOL,completegenomeLength=2809422)用这些引物所制得的PCR产物被克隆入pET21d载体并在BL21(DE3)Star细胞中表达。6-His标签的密码子和随后的终止密码子位于pET21d载体中Xhol切割位点之后。因而，所表达的蛋白质在C末端将包含6-His标签。诱导后实施8小时的表达并且在Ni-NTA柱上纯化表达产物以及在SDS-PAGE凝胶中显像。与未经诱导的培养相比，表达是明确的。按下述制备较大量的所述蛋白质。用FNBP(AB)BL21(DE3)Star菌株生产FNBP培养培养基4升LB+2g/L葡萄糖+100ng/mlAmp，在37匸直至OD1.5，降低温度至30"C,在OD2-2.5时用1mMIPTG诱导5小时。下游通过离心沉淀培养物重悬于緩冲液中10mMTris，pH8，150mMNaCl通过离心沉淀，重悬于40ml25mMTrispH8超声处理10次，每次30秒，每次之间暂停l分钟。添加PMFS至5mM终浓度。以20000g沉淀25分钟。保留上清液。重悬沉淀于40ml25mMTrispH8。如上进行超声处理。添加PMFS至5mM终浓度。将上清液与之前的上清液混合。总体积约卯ml。将上清液施加于用超声緩沖液(25mMTrispH8)平衡的10mlNi-NTA琼脂柱(具有5-10mg蛋白质/ml凝胶的结合能力)。用l体积超声緩沖液洗涤。用2体积25mMTrisHC1pH:6.8，250mlNaCl洗涤。用1体积25mMTrisHC1pH:8，8M尿素洗涤。用2体积超声緩沖液洗涤。用200mM。米唑pH7进4亍洗脱。添加TCA至10%终浓度，在4t:放置l小时。沉淀蛋白质。添加0.2ml1MTrisHC1pH8并用TE緩沖液补充至1ml。在超声器中以水浴溶解蛋白质。(任选为了传送，可以用硫酸铵来沉淀蛋白质。)如下所述，由CrosslinkLtd.Budapest,Hungary以相同的策略构建相应的FnBpA蛋白质并交付一三个各含2mg蛋白质的管。在Ni-NTA柱上纯化蛋白质。最后步骤是用硫酸铵沉淀并离心以产生沉淀。待作事项在弱緩冲液中进行。优选用带水浴的超声器，这促进溶解并且没有泡沫累积。在PD-10柱(Amersham)上去除盐。——个含3.1mg蛋白质的管。与其它3个管一样，但是没有离心。待作事项将管在4"C下放置1小时。以15,000g或更高离心20分钟。移除上清液。实施如上W目同的步骤。所述蛋白质是在末端具有His标签的FnBpA和FnBpB基因的混合物。分子量是16kDa。FnBpA1MEGGQNSGNQSFEEDTEEDBCPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIHGQN^GNQSF50FnBpB1MEGGQNSGNQSFEEDTEEDKPKYEQGGNIVDIDFDSVPQIHGQN^GNQSF5051EEDTEKDKPKYE;gGGN工IDIDFDSVPHIHGFNKHTEIIEEDTNKDKP^YQ10051EEDTEKDKPKYE^GGNIIDIDFDSVraiHGFNKHTEIIEEDTNKDKP^VfQ100101FGGHNSVDFEEDTIiP^SGgNEGQQTIEEDTTPliEHHHHHH*142101FGGHNSVDFEEDTIjP^VSG^NEGQQTIEEDTTPIjEHHHHHH*142产物用于实施例6和7中所进行的试验,根据相同的策略由BiostaprosAB产生相应的FnBpA蛋白质。制备两个分别在N和C末端有Cys的两种构建体。每种各50%的混合物用于实施例2-5。FNBPCys-NMACEGGQNSGNQSFEteDTEEDKPKYEQGGNWDIDFDSWQIHGQ服GNQSFEEDTEKDKPKYEHGGNHDIDFDSVPHIHGFNKHTEIIEEDTOKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPKVSG0NE6QQTIEEDTTPGFNBPCys^CEDTEKDKPKYEHGGNHDIDFDSWHIHGFNKHrEnEEDTNKDKPSYQFGGHNSVDFEEDTLPKVSGQNEGQQTIEEDTTPCG实施例2介绍金黄色葡萄球菌(SA)对于大多数哺乳动物物种来说是引起创伤中、乳腺中急性和慢性感染或者引起人医院感染的病原体，所述创伤包括由外科治疗而引起的创伤。SA经常对抗生素具有抗性，一种选择是至少用于预防的疫苗，尽管已有许多尝试用包括全细胞、毒素、多糖和粘附因子来配制疫苗，但是迄今为止还没有有效的疫苗。为了成功制得抵抗有引起慢性感染倾向之病原体的疫苗制剂，当应用非复制性抗原时，佐剂系统的辅助是必要的。因此，作为疫苗抗原受关注并测试的SA的很多成分包括粘附因子、碳水化合物(多糖)和毒素都已失败，这也许是由于缺少所涉及物种能够接受的合适的佐剂。在此实施例中，我们选择了粘附因子即纤连蛋白结合蛋白(FnBp)，其被认为可以阻断粘附但可能更重要的在于其是吞噬作用的靶标，前提是如果诱导了促进这种活性的FnBp的恰当抗体(调理性抗体)。此外，基于iscom技术，已经用多种佐剂制剂，包括对敏感性物种可接受的佐剂制剂，来补充FnBp。因此，不同的动物物种需要不同的佐剂制剂，包括不同的皂苦。例如牛类物种(bovinespecies)对QuilA或Q-WAC类型的半纯化皂苷有非常良好的反应，这对其它物种来说也许是有毒性的。其它动物物种例如猫或小鼠或人有不同程度的敏感性并且需要几乎无毒的制剂例如QMIX(QV-MIX,瑞典专利申请0202110-3-QV-MIXPCT/SE03/001180)或者QWT制剂(QWT，瑞典专利申请0301998-1PCT/SE03/00586)，或者组分C-基质制剂(ref)。后者被用于兽医学中以;5LA临床试验中。其目种中IgG2a，而IgGl可能促进抗-粘附和中和效应。在本实施例中分析这些免疫学特性。应注意的是，对于如果不是全部也是大部分哺乳动物物种来说，SA是重要的病原体，并且由乳腺炎疫苗产生的结果已经对在包括人在内的其它物种中SA引发疾病产生了影响。根据几种因素，包括地方林和临床情况，疫苗抗原的组成可以在抗SA感染和SA所引起疾病的疫苗中有变化。粘附至纤连蛋白介导感染过程中的重要因素，并且这种蛋白质存在于几乎所有SA分离林中。粘附阻断和中和作用是通过抗体由IgGl实现的作用，而lgG2a对于作为抗SA的主要免疫保护性机制的吞噬作用是重要的。所提及的亚类反映鼠免疫球蛋白系统，而例如IgG2a相当于人的IgG3。通过反映Thl和Th2应答的IgG免疫球蛋白类型之间的平衡来分析小鼠中对用QWT-基质制剂作为佐剂的强候选疫苗FnBp的免疫应答。试验方案依照表l:l中所述免疫18g雌性Balb/c小鼠。根据早先有关免疫原性的试验来确定抗原剂量。选择不诱导高应答的低剂量，以便于察看所添加佐剂的影响。用任一种所述FnBp佐剂制剂在小鼠尾根处经皮下(s.c.)并间隔4周对所述小鼠进行免疫。在第3周和第6周釆集用于血清检测的血样。所有动物接受1ngFnBp并且佐剂成分是组1无佐剂；组2Al(OH)3;组3基质誦Q6组4基质-Q2ng。第6周时IgGl和lgG2亚类的抗原特异性抗体应答被显示在图1:1中。通过ELISA测量抗体水平并表示为在y轴上读出的稀释曲线陡峭部分在OD450的稀释度(101og)(图1:1)。结果第一次免疫后无佐剂的和以氢氧化铝为佐剂的FnBp几乎不诱导可检测的血清抗体应答。以任何iscom佐剂制剂为佐剂的各种FnBp制剂诱导针对FnBp的可检测应答。第二次免疫之后(图1:1)IgGl应答在用以iscom基质为佐剂的FnBp免疫的小鼠组中是很高的(>101og4)。在给予基质-Q或者给予基质MIX的小鼠组中很高，小鼠个体之间的效价分布没有多少差距，然而在给予基质C制剂中FnBp的小鼠组中4艮高。用氢氧化铝佐剂的FnBp与用其它佐剂的FnBp制剂;J目比，IgGl血清抗体水平应答明显更低，4且在个体动物之间ELISA效价呈很大的离散分布。用无佐剂制剂免疫的小鼠具有低IgGl应答。第二次免疫之后(图1:1)IgG2a应答在用以iscom基质为佐剂的FnBp免疫的小鼠组中是很高的(>101og4)。在给予基质-Q或者基质MIX的小鼠组中很高，小鼠个体之间的效价分布没有多少差距，然而在给予基质C制剂中FnBp的小鼠组中其分布却很宽。用无佐剂FnBp或者用氢氧化铝佐剂的FnBp免疫的小鼠应答具有几乎不可检测的IgG2a血清抗体水平。讨论很清楚的表明iscom制剂有能力调节包括TH1和TH2类型免疫应答在内的平衡的免疫应答，这对于诱导抵抗持久性和慢性感染的保护作用是必须的。迄今为止在SA疫苗中所用的佐剂制剂还缺少这种能力。结论对SA和FnBp来说两种感兴趣的制剂是适于大型动物比如牛的基质Q和几乎没有副作用并且例如适于猫和人的不同颗粒中的低毒基质C和基质A。这两种制剂诱导高水平的和平衡的IgGl和IgG2反应。实施例3介绍抗SA疫苗可以包括或者甚至需要各种疫苗成分，包括全细胞、毒素、多糖和粘附因子，其中每一种都有助于免疫保护作用。在本实施例中用如实施例2中的不同佐剂制剂检验破伤风类毒素(TT)以研究它们对毒素的免疫增强作用。试验方案依照表2:1中所述免疫18g雌性Balb/c小鼠。根据早先有关免疫原性的试验但又不诱导非常高应答来确定抗原剂量，以便于察看所添加佐剂的影响。用任一种所述TT佐剂制剂在小鼠尾根处经皮下并间隔4周对所述小鼠进行免疫。在第3周和第6周采集用于血清检测的血样。所有动物接受0.5Lf/剂量并且佐剂成分是组l无佐剂；组2Al(OH)3;组3基质-Q6ng;组4基质-Q2jig。第6周时IgGl和IgG2亚类的抗原特异性抗体应答被显示在图2:1中。通过ELISA测量抗体水平并表示为在Y轴上读出的稀释曲线陡峭部分在OD450的稀释度(101og)(图2:1)。结果第一次免疫后无佐剂的和以氢氧化铝为佐剂的TTi秀导可检测的血清抗体应答，正如用各种以任何iscom制剂为佐剂的TT制剂一样。第二次免疫之后(图2:1)IgGl应答在包括无佐剂的TT在内的所有小鼠组中是很高的(>101og4)。在给予以iscom基质制剂为佐剂的TT的小鼠组中观察到稍微更高的抗TT抗体水平并且在小鼠个体之间效价分布很少展开。第二次免疫之后(图2:1)IgG2a应答在用以iscom基质为佐剂的TT免疫的小鼠组中是很高的(>101og5)。在给予以基质Q或基质MIX为佐剂的TT组中的小鼠所作应答具有最高的IgG2a水平并且在小鼠个体之间效价分布很少展开。用无佐剂TT或以氢氧化铝为佐剂的TT免疫的小鼠所作应答没有或者几乎没有可检测的IgG2a血清抗体水平。讨论TT对于Th2型应答有很强的抗原性能力。氢氧化铝也调节针对Th2型的免疫应答。该实施例表明iscom制剂克^L了TT的强免疫调节作用并且能够诱导对于该毒素的平衡的Thl-Th2应答。对于抗诱导慢性或持久性感染的病原体的疫苗来说重要的是，控制该病原体调节宿主中免疫应答的内在能力，这对于弱佐剂来说是不能实现的。结论该实施例表明iscom制剂有能力调节"强毒素抗原"免疫应答为平衡的免疫应答，这对于实现免疫保护可能是必需的。对于SA以及其它病原体来说，毒素是重要的致病性因素，因此可能需要获得强效的疫苗。实施例4SA产生大量的毒素，其中一些具有强免疫原性，另一些具有相对弱的免疫原性。它们中任何一种都可能是获得非常宽保护能力的疫苗所需要的疫苗抗原。相比较TT而言，白喉类毒素(DT)是相对弱的抗原。在该实施例中，用如实施例2和3所示的不同佐剂制剂来检验弱抗原以探究它们对DT型毒素的免疫增强作用。试验方案依照表3:1中所示免疫18g雌性Balb/c小鼠。根据早先有关免疫原性的试验但又不诱导非常高应答的原则来确定抗原剂量，以便于察看所添加佐剂的影响。用任一种所述DT佐剂制剂在小鼠尾根处经皮下(s.c.)并间隔4周对所述小鼠进行免疫。在第3周和第6周采集用于血清检测的血样。所有动物接受1jigDT并且佐剂成分是组1无佐剂；组2Al(OH)3;组3基质-Q6ng;组4基质-Q2ng。第6周时IgGl和IgG2亚类的抗原特异性抗体应答被显示在图3:1中。通过ELISA测量抗体水平并表示为在Y轴上读出的稀释曲线陡峭部分在OD450的稀释度(101og)(图3:1)。结果第一次免疫后只有用以基质MIX制剂为佐剂的DT免疫的小鼠具有可检测的血清抗体应答。第二次免疫之后(图3:1)IgGl应答在用以氢氧化铝以及基质混合为佐剂的DT免疫的小鼠中最高(>101og3.5)。第二次免疫之后(图3:1)IgG2a应答在用以基质MIX为佐剂的DT免疫的小鼠组中是很高的(约lOlog4)，其具有最高的抗体应答水平，即比其它组中小鼠高出几乎50倍或更高的效价，并且效价分布范围较窄。用无佐剂DT或者用以氢氧化铝为佐剂的DT免疫的小鼠没有或几乎没有可检测的IgG2a血清抗体应答水平。讨论DT是一种比TT(实施例3)弱的抗原，并且无佐剂DT甚至在两次免疫之后没有诱导可检测的IgGl或IgG2，即既没有Th2型应答也没有Thl型应答。调节Th2型免疫应答的氢氧化铝使对DT的应答增强到易于检测到的IgGl水平。本实施例表明iscom制剂增强并且也调节针对DT的免疫应答至Thl和Th2之间平衡的应答。尤其是"低毒"基质MIX对于刺激IgGl和IgG2都是高效的，即强效并平衡的免疫应答。因此，iscom制剂能够高效调节对强抗原以及弱抗原的免疫应答。结论实施例2和3表明iscom制剂高效增强并调节毒素的免疫应答，无论这些毒素是弱抗原还是强抗原，并且驱动例如偏向于Th2的毒素抗原趋于平衡的Thl-Th2应答。这样的能力在可由SA抗原制剂构成的复杂抗原系统中是重要的。实施例5用以iscom基质为佐剂的金黄色葡萄球菌粘附因子FnBp的免疫接种试验进行小规模现场试验在Kungs汪ngen(KJL)，一个属于AgricultureUniversityUppsala的农场中实施疫苗接种试验，以在天然宿主即牛类物种中检验抗金黄色葡萄球菌(SA)的潜在疫苗。在奶牛中以及在相关物种绵羊和山羊中，当它们被用来进行乳品生产时，乳腺炎是严重问题。在乳品科学和生产中任何有经验的人员，包括乳场生产人员、负责动物健康的兽医以及需要高质量乳来生产不同乳制品的工厂，都充分认识到乳腺炎问题。为了控制乳腺炎的情况，通过主要用抗生素处理来加强而改进农场管理是第一选择。SA是引起相关乳房病患和经济问题最重要的病原体。尤其严重的问题是SA经常具有抗生素抗性，并且由于没有治疗方法而必须剔除受影响动物。抗生素治疗乳腺炎的替代方案是免疫预防剂即使用疫苗。尽管有许多的尝试，但是市场上没有高效乳腺炎疫苗。开发乳腺炎SA疫苗的尝试仍是徒劳无功的并且在尝试开发在不同情形中针对其它物种的SA疫苗中也是如此，例如抗狗疗病或者抗人医院感染。因此，高效的抗SA乳腺炎疫苗将从疾患中挽救受影响动物并且在经济上对于乳场、对于乳品工业以及对于它们的消费者都具有极好的作用。选择粘附因子，纤连蛋白结合蛋白质(FnBp)，是因为它存在于几乎100%的SA分离林中。在早先的试验(Nelsonetal.1991)中，FnBp被掺入iscom中。用这种SA乳腺炎试验性疫苗获得了有希望的结果。相反地，继续试验没有获得所期望的结果并且该计划由此而被停止。失败的原因是由于免疫性短暂并且也可能是由于在乳腺中的不充分免疫应答。本疫苗接种试验的目标是研究进一步开发用基于iscom技术的制剂为佐剂的FnBp疫苗的可能性。关注点是引起全身性和局部性免疫应答的最佳施用模式，其中在血清中测量全身性应答，在乳腺中测量局部性应答。因此，为了获得对于候选疫苗潜力的更好预测，对来自乳房的局部分泌物(乳清)也实施免疫学分析。对免疫应答的评价包括血清和乳清中的抗体应答，其包括IgGl、IgG2和IgA应答，还调查抗体对SA细胞吞噬作用的增强。IgG2促进吞噬作用，这是抗SA的最重要防御机制。局部产生的IgA抗体也是在粘膜表面中抵抗侵入者的重要防御因子。应注意的是，先前的试验没有分析乳腺中的免疫应答，很可能是因为之前的疫苗在乳清中没有诱导明确可检测的免疫应答，这种应答将令人信服地支持该试验。已经认识到大体积乳的稀释作用会掩藏在乳腺中引起的免疫应答。疫苗试验方案以及材料和方法较大蛋白质的16kD片段的纤连蛋白结合蛋白质(FnBp)片段包括负责粘附纤连蛋白的DD区。所述多肽在大肠埃希氏菌中表达并且从BiostaproAB获得。它与早先的基于较短69-80kD蛋白质的产物(Nelsonetal.1991)不同。此外，在早先的产物中，FnBp被掺入iscom基质中从而形成iscom。在本试验性疫苗中，所述疫苗的制备不涉及将FnBp包括在基质中从而形成iscom的步骤。避免掺入过程的好处在于提供更简单和更经济的生产系统。因此，本发明制剂在两个方面不同于早先所检验的FnBpiscom4吳选疫苗。Iscom基质由IsconovaAB提供。细菌学检验乳样品的细菌学检验在7Vfl&》Am/FWcVmo^/"W似^(SVA)的乳腺炎实验室中进行。试验方案抗原FnBp选择在大肠埃希氏菌中生产的rDNA产物，这是根据早先的积极经验(Nelsonetal-)，但是构建体更短。最好用确定抗原辅助免疫学评价。将进入其第一哺乳期的10只小母牛用作试验动物以尽可能避免早先SA感染的经历，这更可能在较高龄牛中发生，这会使对疫苗接种难以进行免疫学评价。三种不同的施用模式被检验。因为乳房是一种具有很大粘膜区的器官，据此认为粘膜免疫在乳腺中是重要的。与例如人和猪相比，在牛中没有肠乳腺联系(个人通信Holmberg)，即疫苗抗原的口服施用(即在消化道中)将在猪的乳腺中诱发免疫应答但在牛中却不会。在本试验中使用两种粘膜施用模式，即通过鼻内(i.n.)或通过阴道内(i.vag.)途径施加初始剂量。这些初始免疫(priming)模式的作用与在上乳腺区域中经皮下免疫的初始免疫进行比较。3至4周后经皮下途径对所有动物施用第二剂量。使用这样的免疫方式的目的在于探究是否在上呼吸道区或生殖道与乳腺之间存在联系。对免疫保护重要的是，粘膜(局部)免疫应答以及在乳腺中诱发正确类型的抗体类型。免疫方案包括在产犊前2-4周实施初始免疫。三只动物通过鼻内(i.n.)施用、三只动物通过阴道内(i.vag.)施用模式和四只动物在上乳腺区经皮下途径实施初始免疫。在乳腺定位的淋巴结引流处在上乳腺区(supramammalregion)中通过皮下模式在产犊后对所有动物实施第二次免疫。采样.如图(4:1至4:2)中所示，在第一次免疫时和随后定期开始时釆集用于血清和免疫学分析的血液。对用于细菌学和免疫学分析的乳清的采集在分娩后开始，接下来如对血液所述。细菌学分析在SVA进行并且仅有一次从经鼻内途径初始免疫的一个动物的乳样品中分离到SA。它恰好是在第二次免疫之前。免疫学分析包括测量ELISA中的抗体应答(见上)。详细的结果显示在图4:1至4:4中。吞噬作用分离和纯化白细胞从牛血中分离和纯化白细胞通过Ficoll离心方法进行，参见以下描述Guidryetal1993JDairySci76:1285-1289和Leeetal2005CanJVetRes69:11-18。细胞被重悬在Hanks^i^溶液(HBSS)中，检查其活力，并将其浓度调节至10xl(^细胞/ml。所选的金黄色葡萄球菌菌林首先培养在琼脂平板上并且随后在胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)(最少IOOml)中在37X:下培养18小时。通过在60t:水浴中孵育30分钟杀死细菌。用盐水洗涤3次后，细菌悬液在540nm处光密度为2.0时被调节至1:10的稀释度。细菌的FITC标记才艮据Leeetal2005CanJVetRes69:11-18的描述进行。FITC标记的细菌在含0.15mM钓、1mM镁和0.1%明胶的巴比妥緩冲盐溶液(GVBS)中洗涤3次，在540nm处OD为1.350时按1:10稀释度来确定其浓度并且最后在-80"C下以1ml等分将其保存在GVBS中直至应用。吞谨作用;FITC标记的细菌被融化并在2.4A超声处理30秒，并且浓度被调节至1x109/ml。根据Leeetal2005CanJVetRes69:11-18的描述，用在两次免疫之前和之后收集的未经稀释或者在HBSS中1/4稀释的50nl待;^r血清孵育细菌悬液和细胞。对照包括在HBSS中孵育的细菌悬液，以及没有血清与的细胞悬液一起孵育的细菌悬液。在4予细振荡下在37匸孵育30分钟。通过加入含0.02%EDTA的冰冷盐水来停止吞噬作用。在显微镜下检查之前，用1。/。亚甲蓝处理细胞以淬灭额外的细胞荧光。在荧光显微镜下对最少200个细胞实施检测并且确定细胞与细菌的比例。结果经阴道内途径(图4:1)实施初始免疫的动物显示出低的或者没有血清抗体应答。在乳清中，第一次免疫接种后记录到抗FnBp抗体，以lgG2和IgA亚类为主。在加强免疫之前没有收集乳样品，因为在产犊之前没有乳产生。在经皮下强化免疫之后，在血清和乳中抗FnBp的抗体应答持续期4艮短并且以IgG2和IgA为主。在来自经鼻内途径实施初始免疫的动物的血清中检测不到或几乎检测不到应答(图4:2)。在乳清中所记录的抗FnBp的抗体主要为IgG2和IgA亚类。经阴道内模式给予初始免疫的所有动物都有应答。在经皮下加强免疫之后，在血清和乳清中动物之应答具有明确的抗体升高。最高应答是lgG2和IgA亚类。抗体水平朝向试验期结束时而下降。经皮下模式施用进行初始免疫和加强免疫的动物在血清和乳清中获得了IgGl和甚至更高水平的IgG2以及也很高的IgA(图4:3)。加强免疫后血清和乳清中高水平的IgGl和甚至更高水平的IgG2以及也高水平的IgA指示局部在乳房中和循环血液中保护性免疫的质量。重要的是，血清抗体在整个试验周期即7-10个月中持续。同样，乳清抗体水平在试验周期中持续即高达8个月，i^明本试验性疫苗接种将覆盖整个哺乳期，这对于保护性乳腺炎疫苗是重要的。对来自经皮下途径免疫两次的组中牛的血清进4亍吞喧作用测量。与细菌和在第一次免疫之前收集的血清一起孵育30分钟后，有30%的PMN细胞显示出吞噬作用。与细菌和第二次免疫后收集的血清一起孵育30分钟后，有增加至51%的PMN细胞显示出吞喧作用。有4。/。PMN细胞与细菌但无血清一起孵育时显示出吞噬作用。不经与细菌和第二次免疫后收集的血清一起孵育有2%的PMN细胞显示出吞嗟作用。讨论抗体应答在其类型和亚型的分布对于获得最佳的免疫保护作用是极其重要的。一般认为IgG2抗体对于对抗SA感染具有最大的重要性，因为该亚型促进对细菌的吞噬作用。所有形式的免疫接种既促进乳清中也促进血清中IgG2和IgA的FnBp特异性抗体。在来自经阴道内和鼻内初始免疫动物的血清和乳清中具有相当低水平的抗体应答。意料之外的是，通过应用以iscom基质为佐剂的FnBp进行两次皮下免疫，其在血清和乳腺分泌物中诱导了高抗体水平，其中包括IgGl、IgG2和IgA亚型。这些程度和性质的免疫应答还没有在先前使用SA疫苗或任何其它疫苗的牛乳腺中被显示出。同样，在血清中这些Ig亚类也被记录。与早先检验过的短持续期的试验性疫苗(Nelsonetal.1991)相比，皮下施用模式诱导长期持续并且更优的免疫应答(图4D)。特别受关注和有价值的是在乳腺中的强效免疫应答，这在先前所检验的抗SA候选疫苗中没有描述。来自功能性吞噬作用检验的结果突出表明诱发了重要的免疫保护特性。iscom基质的强效免疫增强作用是没有预料到的并且其通iti^免FnBp多肽与iscom基质偶联的步骤而有利于高效的疫苗生产。有两种纤连蛋白结合蛋白质FnBpA和FnBpB，它们具有相似的构成。Nelsonetal所用的构建体由60-65kD的蛋白质组成，其与来自葡萄球菌蛋白A的两个IgG结合结构域相偶联从而形成融合蛋白zzFnBpA以及zz-FnBpB,其中zz-FnBpB包含推测的T细胞表位，zzFnBpA与包含推测T细胞表位的另一部分相连而形成zz-FnBpA-T。这些多肽与iscom相偶联(L6vgren，K.，Lindmark，J"Pipkorn，R.andMorein，B(1987)J.Immunol.Methods98.)。我们已经使用了这些多肽并发现它们被片段化。对于Nelson构建体限制性的一个原因，我们认为是由于这种片段化的趋势所引起的。本发明的16kDFnBp片段更加稳定并且包^进与纤连蛋白结合的重要的DD区重复片段。结论在两次皮下免疫之后，补充iscom基质制剂的截短型FnBp构建体在乳腺和血清中诱导高水平的高质量免疫应答。所期望的疫苗在牛乳腺中诱导抗SA感染的免疫保护作用具有强的免疫学标准。该技术能实现对于所期望疫苗重要的高效生产系统。实施例6全SA细胞以及a和|3溶血素对针对FnBp和毒素的免疫应答的作用SA引起慢性和持续的感染，其通迚基于"掩蔽"感染和对从宿主免疫系统中存活所必要成分的能力而由病原体的固有特性所促进。此外，引起持续和慢性感染的病原体具有指导宿主免疫反应从而允许其持续的能力。SA包含大量具有免疫调节特性的不同组分并且不合适的组合物可以引起针对包括在疫苗组合物内的一种或所有抗原的低免疫应答。如上所述，有许多可作为SA候选疫苗的组分。首先的策略是应用分离自病原体的组分或由细胞(在此为大肠埃希氏菌)表达作为分离林疫苗抗原所产生的组分。第二种方法是应用强效的佐剂，在本情况中为iscom基质。疫苗组分的一个有希望类别是毒素。在来自乳腺炎的SA分离抹中非常频繁地鉴定出a和p溶血素(对于p溶血素，在100%情况中)，这种事实^f吏得它们成为强有力的候选疫苗。这两种毒素都是外泌产物并且能够从SA生长的培养液中收集。在本试验中，如材料和方法中的安排，SA细胞与含a和p溶血素的培养液在疫苗组合物中与FnBp混合以探究在该组合物中FnBp和所述毒素的免疫原性。材料和方法试验方案。才艮据下面的免疫方案，对位于瑞典南部6vedsKloster的4-7个月大的25只小牛以4周间隔实施3次免疫。由RolandM6Uby教授领导的KarolinskaInstitutetMTC细菌学部生产并友好提供SA细*与含a和p溶血素的培养液。如下表所述，在颈侧肩胛骨前部经皮下用200fig的FnBp或者FnBp和108金黄色葡萄球菌细胞/剂量以及a和p溶血素各50照的混合物实施免疫。所有疫苗制剂用1mg/剂量的iscom基质作为佐剂。剂量体积是2ml。抗动物组检验5FnBp和毒素5FnBp和毒素5FnBp和毒素5FnBp和毒素E/PBSPBSPBS5FnBp和毒素Fn:FnBp，S:金黄色葡萄球菌细胞以及a和p溶血素，PBS:磷酸盐緩沖液为了获得有关免疫应答达到最高限度的额外信息，以及有关反复免疫后可能的抑制的信息，实施了笫三次免疫。如上所述，通过ELISA对血清实施针对FnBp抗体应答的评价。我们需要了解SA全细胞+毒素对FnBp是否具有支配作用即抑制抗FnBp的免疫应答。在由RolandM611by教授领导的KarolinskaInstitutetMTC细菌学部实施针对a和p溶血素的中和试验。结果在本实施例中，小牛的年龄小于l岁，并且它们对补充SA细胞以及a和p溶血素的FnBp不产生应答或者产生的应答只具有非常低的抗体效价。通过ELISA测量的关于组1的针对FnBp的免疫应答显示在图5:1中。在第一次免疫后，仅在组l中只用FnBp以及用iscom基质作为佐剂的FnBp免疫的动物产生IgM以及IgG抗体应答。在第一次加强免疫后，在单独用FnBp接种的动物中记录到IgM、IgGl和IgG2应^r有明显的增加。在用包含FnBp和金黄色葡萄球菌细胞以及a和(5溶血素的组合物进行初次免疫的动物中，没有动物显示出针对FnBp的免疫应答(未显示)。第三次免疫后进行检验。针对a和p溶血素的免疫应答在功能性即毒素中和试验中进行测量。该结果显示在图5:2中。第一次免疫后，在用包含SA细胞和毒素的疫苗组中即B、C和D组的动物中记录到低IgG应答。在第二次免疫时抗体水平下降。第二次免疫后，已接受两剂量毒素的动物即组C和D中的动物产生具有高中和效价的应答。讨论本试验表明金黄色葡萄球菌细胞与a和p溶血素的混合物抑制针对FnBp的免疫应答。相比较而言，所有动物产生抗a和p溶血素的高中和抗体的应答。不清楚的是，是否毒素或者培养液中其它产物或者全细胞或者两者的组合引起这种下调。在本试验中的动物年龄小于一岁。在后来的试验中，所述动物超过一岁最大两岁并且接受或者补充SA细胞或者补充a和(J溶血素的FnBP,这些动物产生针对FnBp的高水平抗体应答(见实施例7)。在本试验中注意到的抑制似乎是基于主动免疫应答即具有记忆性，因为组B中的动物对第二次施用没有作出应答。相比较而言，a和p溶血素在所有试验的疫苗抗原组合中诱导强免疫应答，这提示毒素和FnBp的组合是相容的并且可行的疫苗组合物。全SA细胞在疫苗组合物中的可能应用需要进一步研究。实施例7的结果指出当SA细胞或者a和p溶血素包含在所述疫苗制剂中时，年龄较大的小牛或母牛对疫苗抗原可能不对疫苗抗原有抑制反应。结论先前的试验已经显示用iscom基质为佐剂的FnBp在牛类物种中具有高度免疫原性，这在本实施例中被证实。在本实施例中，当FnBp同时补充SA细胞以及a和p溶血素时，对FnBp的免疫应答^皮下调。可以从实施例7中总结出，当测量抗FnBp的抗体应答时，联合FnBp与a和p溶血素的疫苗组合物具有高免疫原性，并且FnBpSA细胞的联合疫苗也是如此。可以想到，在用FnBp并补充SA细胞以及联合a和p溶血素对较年轻动物进行免疫观察到有抑制，而对于超过一岁的牛则不产生抑制反应。实施例7在实施例6中，我们已经观察到在试验性疫苗中a和p溶血素与全SA细胞的混合物下调针对第三组分即FnBp的免疫应答。因为a和(5溶血素以及全SA细胞都包括在内，不清楚是毒素与细胞中的一种或另一种或者其组合负责这种抑制作用。在本实施例中，通过将FnBp与毒素或全SA细胞进行组合，进一步研究了各自的抑制、相容性或增强作用。为此目的，如材料和方法中所述来实施试验。所有的试验疫苗都用iscom基质为佐剂。材料和方法试验方案根据下面的免疫方案，对位于瑞典Uppsala东部MostaFarm的1-2岁龄的15只小牛以6周间隔实施2次免疫。由RolandM611by教授领导的KarolinskaInstitutetMTC细菌学部生产并友好提供SA细菌以及含a和p溶血素的培养液。如下表所述，在颈侧肩胛骨前部经皮下用200ng的FnBp或者FnBp与1()S金黄色葡萄球菌细胞/剂量的混合物或者FnBp与a和p溶血素各50jig的混合物实施免疫。所有的疫苗制剂用1mg/剂量的iscom基质为佐剂。剂量体积是2ml。免疫方案抗动物组检验A/FnBpFnBp5FnBp和毒素B/SA+FnSA+Fn5FnBp和毒素C/Tox+FnTox+Fn5FnBp和毒素D/PBSPBS5FnBp和毒素Fn:FnBp，S:金黄色葡萄球菌，Tox:a和P溶血素，PBS:磷酸盐緩沖溶液结果通过ELISA测量的针对FnBp的免疫应答显示在图6:1中。在第一次免疫后三周，所有动物产生的应答具有相当高的抗FnBp抗体效价，其中包括所有检验的免疫球蛋白类型，即IgM、IgGl和IgG2。根据这种初级免疫应答，所有积累的经验告诉我们，第二次免疫后将会产生IgG亚型应答的显著增加。第二次免疫的数据正在处理中。讨论本试验显示金黄色葡萄球菌细胞以及a和p溶血素的混合物分离开地不抑制针对FnBp的免疫应答。在实施例6中清楚的显示毒素组分或者培养液中其它产物与全细胞联合，下调所有检验的免疫球蛋白类型中的免疫应答。在实施例6中所证明的抑制似乎是基于包括免疫记忆细胞的主动免疫应答。在实施例6中也表明a和p溶血素在所有疫苗抗原组合中诱导强免疫应答，这提示毒素和FnBp的组合是相容的和可行的疫苗组合物。来自本实施例的结果表明，在疫苗组合物中使用全SA细胞是可能的，条件是在实施例6的某些组中检验的疫苗抗原组合物中引起抑制的因子被鉴定并从含全细胞的期望疫苗组合物中排除。应当注意，针对补充SA细胞以及a和p溶血素的FnBp的抗体应答是低的，it^明针对FnBp的免疫应答被抑制。应该注意，实施例6中小牛的年龄小于一岁，而实施例7中的动物年龄较大即l-2岁。较年轻的动物可能还具有未发育完全的免疫系统或者不由FnBp抗体反映的母体抗体。在很多制剂中，以iscom基质为佐剂的试验疫苗已包括FnBp和毒素(见实施例3和4)。在小鼠模型中，引发了针对FnBp以及针对所包含毒素的非常强效的免疫应答。因此，所积累的结果有力地表明，包含粘附因子和其它成分并以iscom制剂为佐剂的期望疫苗制剂可i秀导强免疫应答。结论当FnBp或者与毒素或者与全SA细菌细胞相混合时，在将i^V哺乳期年龄的动物中诱导抗FnBp的高抗体水平。因此，基于几种抗原成分的SA疫苗是可行的。表l:l用纤连蛋白结合蛋白质(FnBp)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候选疫苗间隔4周经皮下克疫两次<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>低毒制剂由在分开颗粒中的0.6ng基质-C+3.4jig基质-A的混合物组成。表2:1用破伤风类毒素(TT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候选疫苗间隔4周经皮下免疫两次<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>低毒制剂由在分开颗粒中的0.6pg基质-C+3.4照基质-A的混合物组成。表3:1用白喉类毒素(DT)免疫Balb/C小鼠的方案。所述小鼠用各自候选疫苗间隔4周经皮下免疫两次<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>低毒制剂由在分开颗粒中的0.6pg基质-C+3.4fig基质-A的混合物组成。权利要求1.一种组合物，其包含至少一种纤连蛋白结合蛋白、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一个纤连蛋白结合结构域，以及至少一种iscom基质复合物和/或脂质体和/或至少一种脂质和至少一种皂苷，由此所述至少一种脂质和至少一种皂苷可处于复合物、溶液或者悬液之中。2.根据权利要求l的组合物，其中所述纤连蛋白结合蛋白、截短蛋白和/或肽包含一个或多个纤连蛋白结合结构域，其来自金黄色葡萄球菌(5yfl/;^v/0coccwsflM^ws)、酉良腺链球菌(iftfr/7tococc"s/7jogew^s")和停乳链球菌(5^CptoCOCCMSfl^S^fl/fl"/fl^)、无專L链球菌(iftf^p&COCCWSflg"/fl"/"e)和乳房链球菌(5^eptoo"wsw&n、)以及凝固酶阴性葡萄球菌。3.根据权利要求l-2中任一项的组合物，其中所述纤连蛋白结合结构域选自来自金黄色葡萄球菌的纤连蛋白结合蛋白A或B的D结构域、来自停乳链球菌的纤连蛋白结合蛋白A的A结构域、来自停乳链球菌的纤连蛋白结合蛋白B的B结构域、和来自酿脓链球菌纤连蛋白结合蛋白的P结构域。4.根据权利要求l-3中任一项的组合物，其中纤连蛋白结合蛋白、和/或截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽被整合入脂质体中或者与iscom基质或脂质体相混合或者偶联于脂质体或iscom基质上。5.根据权利要求l-4中任一项的组合物，其还包含至少一种另外的抗原。6.根据权利要求5的组合物，其中所述抗原是来自微生物的全细胞和/或抗原性成分的形式，所述微生物尤其是金黄色葡萄球菌、S良脓链球菌，停乳链球菌，无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌。7.根据权利要求5-6中任一项的组合物，其中所述抗原性成分选自不下调免疫系统的成分比如粘附素和成孔因子，以及下调免疫系统的成分比如超抗原、荚膜抗原、内毒素、外毒素和细胞外酶。8.根据权利要求7的组合物，其中所述粘附素选自聚集因子(clf)、外部纤维蛋白结合蛋白(efb)、针对纤维蛋白原的A和B粘附素、凝固酶(coa)、结合于纤维蛋白原的纤维蛋白原结合蛋白A、附着于纤维蛋白原的纤连蛋白结合蛋白(FnBp)A和B、结合于胶原蛋白的胶原蛋白结合蛋白(cna)、结合于弹性蛋白的弹性蛋白结合蛋白(ebpS)、结合于细胞外基质蛋白的MHC类似物蛋白(map或eap)、涉及细胞内粘附和生物膜形成的多糖细胞内粘附素(pia)、涉及可能逃脱宿主防御的蛋白质A(spa)、抗吞噬作用分子的荚膜多糖(1、5、8和13型)(cap)、或Techoidacid。9.根据权利要求7的组合物，其中所述成孔因子选自a-溶血素、p-溶血素、y-溶血素、5-溶血素、涉及宿主细胞裂解的磷脂酶c(plc)、涉及组织侵入的弹性蛋白酶(s印A)和涉及组织侵入的透明质酸酶(hysA)o10.根据权利要求7的组合物，其中所述外毒素和细胞外酶选自肠毒素A國E、H(sea-e,h)、涉及靠超抗原和特性逃避宿主防御的毒素休克综合征毒素-1(tst)、涉及逃避宿主防御的剥脱毒素AB(eta、efb、etb)、涉及逃避宿主防御的脂肪酶(geh)、涉及宿主吞噬细胞裂解、逃避宿主防御的Panton-Vallentine杀白细胞素(lukF、lukS)、涉及逃避宿主防御的葡萄球菌激酶(sak)。11.根据权利要求1-101中任一项的组合物，其中所述iscom基质复合物包含一种或多种来自QuilA的糖苷片段。12.根据权利要求11的组合物，其中至少两种来自QuilA的糖苷片段是结合于不同iscom基质颗粒中的复合物。13.根据权利要求11-12中任一项的组合物，其中所述iscom复合物包含QuilA的亚片段A和/或亚片段C。14.根据权利要求1-10中任一项的组合物，其中所述iscom复合物包含粗制QuilA。15.根据权利要求1-14中任一项的组合物，其还包含至少一种影响乳房的抗原比如乳房链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌、克雷伯氏菌属(/ir/AwW/flspp.)和大肠埃希氏菌(co/z)。16.根据权利要求1-15中任一项的组合物，其还包含制药可接受的栽体、稀释剂、赋形剂或添加剂。17.根据权利要求1-16中任一项的组合物在制备抗包含至少一个纤连蛋白结合结构域的微生物比如金黄色葡萄球菌.酿脓链球菌、停乳链球菌、无乳链球菌和乳房链球菌以及凝固酶阴性葡萄球菌的疫苗中的用途，尤其是其用于哺乳动物比如人、牛、绵羊或山羊，并且优选抗金黄色葡萄球菌。18.包括至少两个区室的部件试剂盒，其中一个区室包含至少一种纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一个纤连蛋白结合结构域，并且另一个区室包含使用说明和/或至少一种iscom基质复合物和/或脂质体。19.根据权利要求18的部件试剂盒，其还包含至少一种下调免疫系统的抗原和/或至少一种不下调免疫系统的抗原、和/或来自微生物的全细胞，由此所述至少一种不下调免疫系统的抗原、和所述至少一种下调免疫系统的抗原和/或所述全细胞可以置于用于在不同位点施用的不同区室中。20.根据权利要求18的部件试剂盒，其中一个区室包含至少一种来自地域性或局部性发生的金黄色葡萄球菌的抗原。21.根据权利要求18-21中任一项的部件试剂盒，其还包含抗生素。22.—种对个体接种疫苗的方法，其中向所述个体施用含有包含至少一个纤连蛋白结合结构域的至少一种纤连蛋白结合蛋白、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽、以及至少一种iscom基质复合物和/或脂质体的组合物。全文摘要本发明涉及一种组合物，其包含至少一种纤连蛋白结合蛋白、和/或至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或至少一种纤连蛋白结合肽，所有这些都包含至少一个纤连蛋白结合结构域；以及至少一种Iscom基质复合物和/或脂质体和/或至少一种脂质和至少一种皂苷，由此所述至少一种脂质和至少一种皂苷可处于复合物、溶液或者悬液之中。另外，本发明也涉及其在制备抗包含至少一个纤连蛋白结合结构域的微生物的疫苗中的用途。本发明也涉及其部件中包括至少两个区室的试剂盒，其中一个区室包含至少一种截短的纤连蛋白结合蛋白和/或纤连蛋白结合肽，其包含至少一个纤连蛋白结合结构域，并且另一个区室包含使用说明和/或Iscom基质复合物和/或iscom复合物和/或脂质体。此外，本发明涉及用于个体疫苗接种的方法。文档编号A61K39/39GK101107009SQ200680002650公开日2008年1月16日申请日期2006年1月20日优先权日2005年1月20日发明者卡塔琳娜·龙隆德,卡林·勒夫格伦-本特松,卡洛斯·巴斯丘南,吉尔·埃克斯特伦,布罗·莫雷因,比吉塔·弗罗姆格伦申请人:伊斯克诺瓦公司