专利名称：具有抗肿瘤活性的苯氧乙酸和苯氧甲基四唑衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有抗肿瘤活性的苯氧乙酸和苯氧甲基四唑衍生物，它们具有MDM2拮抗活性。特别是，这些化合物作为MDM2与p53相互作用的拮抗剂，可导致细胞内活性p53增加，因此可允许p53蛋白在癌细胞中促进编程性细胞死亡。
原癌蛋白MDM2(mouse double minute 2，人的等价蛋白有时指HDM2)在很多人肿瘤中异常表达(Oliner等，1992,Nature 358,80-83；Leach等，1993，癌症研究54,794-799；Ebert等1994，国际肿瘤杂志5,1279-1284；Bueso-Ramos等.1993，血液82,2617-2623；Chilosi等。1994，血液84,4295-4300；Marchetti等.1995,Diagn.Mol.Pathol.4,93-97；McCann等。1995，英国癌症杂志71,981-985；Cordon-Cardo等。1994，癌症研究54,794-799)。MDM2通过与p53的N-末端活化区域结合形成负自身调节环(Kussie等。1996，科学274,948-953)，来抑制p53的功能(Momand等。1992，细胞69，1237-1245；Oliner等。1993，自然362,857-860；Barak等.1992,EMBO J.11,2115-2121；Finlay 1993，细胞分子生物学13,301-306；Chen等。1996，细胞分子生物学16,2445-2452；Haupt等。1996,EMBOJ.15,1596-1606)和促进p53的蛋白酶降解(Kubbutat等。1997，自然387,299-302；Haupt等。1997，自然387,296-299；Midgley等。1997，癌基因15,1179-1189)。干扰MDM2与p53之间的这个自身调节环可用于增加哺乳动物细胞中活性p53的浓度。在很多肿瘤细胞的例证中由于活性p53耗尽导致有缺陷的细胞周期和编程性细胞死亡调节。但是，肿瘤细胞只有一部分带有突变缺损的p53。在肿瘤细胞的剩余部分带有野生型p53，因此，可通过干扰MDM2与p53之间的相互作用来增加活性p53的平衡浓度。已有使用肽模型的MDM2-p53相互作用拮抗剂，在体外(Bttger等。1997，分子生物学杂志269,744-756)和哺乳动物细胞中(Bttger等。1997，现代生物学7,860-869)均显示出p53活性恢复。另外，用合成的核酸抑制MDM2的表达也显示出可增加活性p53的水平，并因此可增加细胞系对细胞抑制性药物的敏感度(Chen等.1998,Proc.Natl.Acad.Sci USA 95,195-200)。功能性p53的缺少是与肿瘤耐受化疗或辐射治疗有关的最常见的分子缺陷。MDM2失调被认为是此现象的一个原因(Kondo等。1995，癌基因10,2001-2005；Blaydes等.1997，癌基因14,1859-1868)。可通过干扰MDM2 p53的相互作用增加p53在肿瘤细胞中的分子内浓度的药剂对于增加肿瘤细胞对化疗或辐射治疗的敏感度有治疗性应用。在对增加功能性p53特别敏感的治疗类型中(Hansen等.1995，癌基因11,2535-2545)，这些药剂本身足够诱导编程性细胞死亡。
除了通过增加活性p53的分子内浓度作用而产生作用外，MDM2拮抗剂还可对哺乳动物细胞的细胞周期调节发挥作用，此作用是独立于p53的。从E2F-依赖的启动子的转录是被MDM2活化的，它与E2F的相互作用在相同的结合位点且与p53相互作用时在同源表位(Piette等.1997，癌基因15,1001-1010；Brown等.1993，分子细胞生物学13,6849-6857)。因此，MDM2通过加强S-相传代促进一般的细胞增生(Leveillard和Wasylyk 1997，生物化学杂志272,30651-30661)，增加血管紧张素促细胞分裂剂的表达(Kondo等，1996，癌基因13,1773-1779)且抑制分化(Fiddler等.1996，分子细胞生物学16,5048-5057)。因此，MDM2抑制剂可治疗与p53无关的MDM2失调的肿瘤。
已经发现，带有酸性部分通过亚烷基链连接到酚氧原子的O-取代的酚衍生物是有效的MDM2活性拮抗剂，特别是MDM2-p53相互作用的拮抗剂。
在文献中有报道，在两个苯环中的一个带有羧甲氧基取代基的查耳酮衍生物具有抗溃疡活性(波兰化学杂志，vol.65(2-3),369-75,1991；DE 3537207,Biorex；药物化学杂志，vol.27(12),2943-53,1979；FR 2383157,Biorex；JP 54019948,Taisho)，杀菌活性(Pharmazie,vol.44(3),190-1,1989；Hacettepe Univ.EczacilikFak.Derg.,vol.11(1),1-11,1991)，低血脂活性(hypolipemicactivity)(FR 2639043；US 3,994,955,Searle；T’ai-wan Yao HsuehTsa Chih,vol.27(1-2),12-16,1975)，利尿活性(欧州药物化学杂志-Chim.Ther.,vol.Chem.)，防疫活性(CA904291,Dow Chem)，或降低血液中的血纤维蛋白原的水平(DE 4327365,BoehringerMannheim)。但至今没有报道过抗肿瘤活性。
在现有技术中报道的具有抗肿瘤活性的查耳酮衍生物在苯环上不带有羧甲氧基或四唑基甲氧基部分，且已知其作为抗微管蛋白剂(US4,904,697,Merrell Dow)。
本发明的目的是使用通式(Ⅰ)化合物，其立体异构体或其药学上可接受的酸或碱，制备具有MDM2拮抗活性的药物，优选治疗MDM2失调的肿瘤，例如肉瘤
其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基团可在邻、间、对位；-A选自-COOH,-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基团
其中R’是氢或(C1-C4)烷基；或基团A-(CH2)p-C(R1)(R2)-选自苯基，苄基或(吲哚基)甲基，它可被R4基团取代；-p是0,1或2；-R1和R2分别选自氢或(C1-C8)烷基，或它们与相连的碳原子一起形成(C3-C7)环烷基；-R4是0至2个取代基，分别选自氯，溴，碘，氟，直链或支链(C1-C8)烷基，羟基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基；或下式基团
在通式(Ⅰ)中是萘基，它可被R4取代；-n是1-4的整数；-m是0或1；-B选自直链或支链C1-C10烷基，-CO-C(R3)=CH-R,-CH=C(R3)-CO-Ar,-CO-CH(R3)-CH2-R或当m为0时，是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6，或当m为1时是-CH=C(R3)-CO-Ar；-R选自氢，-Ar或-CO-Ar；-R3是氢或(C1-C8)烷基；-R5和R6分别是(C1-C4)烷基或与它们相连的氮原子一起形成哌啶子基，哌嗪子基，(C1-C8)烷基哌嗪子基，吗啉代或硫代吗啉代基团；-Ar是苯基，它可以是未取代的或被1至3个分别选自氯，溴，碘，氟，直链或支链(C1-C8)烷基，羟基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基的取代基取代。
本发明的另一目的是如上所述的新的通式(Ⅰ)化合物，条件是，当m是0时，A选自-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基团
其中R’是氢或(C1-C4)烷基；和当m是0时，A是-COO-(C1-C4)烷基，B只能是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6。
优选的通式(Ⅰ)化合物是那些-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基团在对位的化合物。
更优选的通式(Ⅰ)化合物是那些R4是1-2个氯原子或那些Ar是被1-2个氯原子取代的苯基的化合物。
更优选的通式(Ⅰ)化合物是那些m是0,R是氢且A是四唑基的化合物。
最优选的通式(Ⅰ)化合物是
和
本发明化合物的制备其中m是0且B是直链或支链C1-C10烷基，-COCH3,-CO-C(R3)=CH-R或-CH=C(R3)-CO-Ar基团的通式(Ⅰ)化合物可从通式(Ⅱ)的中间体开始制备
其中R4定义如上，且B’是直链或支链C1-C10烷基，-COCH3,-CO-C(R3)=CH-R或-CH=C(R3)-CO-Ar，与通式(Ⅲ)的酸酯反应Hal-C(R1)(R2)-(CH2)p-COO-(C1-C4)烷基(Ⅲ)或与通式(Ⅲ’)的腈反应Hal-C(R1)(R2)-(CH2)p-CN(Ⅲ’)其中R1,R2定义如上，且Hal是氯，溴或碘原子，或与通式(Ⅲ”)基团反应芳基-Hal(Ⅲ”)其中Hal是氯，溴或碘原子，且芳基是苄基，(吲哚基)甲基和被反应后易除去的基团如三羰基铬(O)基团活化的苯基。
式(Ⅱ)中间体与式(Ⅲ)或(Ⅲ’)中间体的反应可在溶剂中进行，优选非质子偶极溶剂如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜，且在碱如碱金属或碱土金属碳酸盐存在下反应。反应温度优选室温至100℃的范围。
其中B’不是-COCH3的通式(Ⅱ)中间体与通式(Ⅲ)中间体的反应产物已经是通式(Ⅰ)化合物，它还可通过水解酯基转化为其中A=-COOH的另一通式(Ⅰ)化合物。此水解反应可在碱存在下，如碱金属或碱土金属碳酸盐或氢氧化物，在溶剂中如醇中进行。
可通过在溶剂如二甲基甲酰胺中与叠氮化钠反应，将其中B’不是-COCH3的通式(Ⅱ)中间体与通式(Ⅲ’)中间体的反应产物转化为其中A是四唑基的如上所述的通式(Ⅰ)化合物，且任意地，可通过合适的烷基化试剂，如硫酸二甲酯在碱存在下将四唑环上的1或2个氮原子烷基化。
可选择地，其中A是四唑基，m是0且B是-CO-C(R3)=CH-R其中R3是氢的上述通式(Ⅰ)化合物可通过三步反应获得包括a)其中B’是-COCH3的上述通式(Ⅱ)中间体与通式(Ⅲ’)中间体反应；b)将a)步骤反应所得化合物在溶剂如二甲基甲酰胺中与叠氮化钠反应，且任意地可通过合适的烷基化试剂，如硫酸二甲酯在碱存在下将四唑环上的1或2个氮原子烷基化；c)将b)步骤反应所得的化合物与芳香醛R-CHO在惰性溶剂中，在碱如碱金属或碱土金属氢氧化物存在下，在室温至回流的温度范围内反应。
可选择地，其中A是四唑基，m是0且B是-CO-C(R3)=CH2，即其中R是H的通式(Ⅰ)化合物可从通式(Ⅱ’)
其中A是定义如上的四唑基，且R1,R2,R3,R4和p定义如上，与多聚甲醛反应得到。通过通式(Ⅱ’)与多聚甲醛和胺HNR5R6的盐酸盐，其中R5和R6定义如上，在Mannich反应条件下反应，并连续用弱碱如碱金属或碱土金属碳酸氢盐处理可得到其中B’=-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6的通式(Ⅰ)化合物的盐酸盐。
其中B’是-COC(R3)=CH-R，且R=Ar或R=-CO-Ar的通式(Ⅱ)化合物可通过通式(Ⅳ)化合物
与Ar-CHO或Ar-CO-CHO的醛在惰性溶剂，在碱如碱金属或碱土金属氢氧化物存在下，在室温到回流的温度范围内反应获得。
类似地，其中B’是-CH=C(R3)-CO-Ar的通式(Ⅱ)化合物可通过通式Ar-CO-CH2-R3与通式(Ⅳ’)的醛反应获得
其中B’是C1-C10烷基，Ar-CHO,Ar-CO-CHO和Ar-CO-CH2-R3的通式(Ⅳ),(Ⅳ’),Ⅱ化合物是已知化合物，它们可用化学家已知的方法制备或甚至是市场上可买到的产品。
如上所述，其中A是四唑基的通式(Ⅱ’)化合物可通过通式(Ⅳ)化合物与通式(Ⅲ’)反应并接着与叠氮化钠反应制备。
其中m=0且B是-CO-CH(R3)-CH2-R基团的通式(Ⅰ)化合物可通过催化氢化其中B’是-CO-C(R3)=CHR的通式(Ⅱ)化合物中双键并接着如上所述与通式(Ⅲ)或(Ⅲ’)的中间体反应获得。与中间体(Ⅲ’)反应得到的通式(Ⅰ)化合物还可任意地如上所述与叠氮化钠反应转化为另一个其中A是四唑基的通式Ⅰ化合物。
其中m是1且B是-CH=C(R3)CO-Ar的通式(Ⅰ)化合物可通过通式(Ⅴ)化合物
其中p,n,R1,R2和R4定义如上，且A’与A定义相同只是不是-COOH，与通式(Ⅵ)的中间体反应获得Ar-CO-C(R3)=CH-COOH(Ⅵ)其中B是-CO-C(R3)=CH-R或-CO-CH(R3)-CH2-R的化合物可用类似的方法制备。这类反应通过活化式(Ⅵ)化合物的羧基进行，例如通过混合酸酐或酰基氯，或在合适的缩合剂如二环己基碳化二亚胺存在下。如此得到的通式(Ⅰ)化合物当A’=-COO-(C1-C4)烷基时，可通过在碱条件下水解酯基，或当A’=-CN时与叠氮化物反应，后续步骤如前所述，转化为其它的通式(Ⅰ)化合物。
可通过在相应的酸(其中A’是-COOH)的酸条件下酯化制备通式(Ⅴ)化合物，可按照Synthesis,(1997),778-782中描述的方法制备，此文献在此引作参考。合适的酯化条件可以是甲醇在足以使氨基盐化和催化酯化反应量的硫酸存在下。接着用弱碱处理可恢复游离氨基。
通式(Ⅵ)化合物可按照Am.Soc.,70,3359(1948)中描述的方法制备，此文献在此引作参考。本发明化合物的生物活性本发明化合物与MDM2蛋白，特别是人MDM2蛋白相互作用，并抑制MDM2蛋白与其它蛋白，特别是MDM2与p53之间的相互作用。MDM2具有很多功能，主要的一个是在细胞周期中控制p53的活性(Piette等的综述，1997，癌基因15,1001-1010)。MDM2在其氨基末端区域形成疏水口袋，这特别适应肽表位存在于p53氨基末端(Kussie等.1996，科学274,948-953)。p53的N-末端与MDM2的N-末端区之间的相互作用是MDM2发挥对p53活性控制的主要先决条件。与MDM2 N-末端区域的疏水口袋结合的化合物因此可作为MDM2调节的p53的抑制和降解的拮抗剂。依据这个机理活性p53的水平可被提高，特别反应在对p53调节的编程性细胞死亡和细胞周期停止的诱导敏感的肿瘤细胞中。至今为止，已知只有肽和蛋白具有此类型干预的可行性(Bttger等.1997，分子生物学杂志269,744-756；Bttger等.1997，今日生物学7,860-869)。本发明的化合物第一次提供了可中断MDM2-p53相互作用的低分子量化学物质。
另外，本发明化合物可抑制MDM2从其N-末端区域与其它具有相似作用位点的蛋白如E2F-1的相互作用。本发明化合物因此可对独立于p53状态的肿瘤细胞显示抗增生或致敏效果(实施例15)。
另外，本发明化合物与MDM2的相互作用特别专一。在哺乳动物细胞中，存在着许多具有疏水口袋可容纳化合物或疏水残基的蛋白，这类蛋白的一个例子是谷胱甘肽S-转移酶(GST)(Reinemer等.1992，分子生物学杂志227,214-226；Cameron等.1995,Structure 3,717-727；McTigue等.1995，分子生物学杂志246,21-27)。本发明已发现，特定的化合物可以与MDM2和GST都相互作用。这类化合物的一个例子是利尿酸，以前曾报道过它是GST抑制剂，与此蛋白的疏水口袋结合(Oakley等.1997，生化36,576-585；Ploemen等.1993,Xenobiotica 23,913-923)。在本发明中，惊奇地发现利尿酸与MDM2的相互作用。因此本发明提供了化合物分别对MDM2和GST结合活性不同的分析鉴定。本发明进一步提供了对MDM2具有高亲和性且对GST具有低或无亲和性的化合物的鉴别技术。对MDM2-p53之间的相互作用有高的抑制活性且对GST的抑制活性相对低或无的化合物是基于抑制MDM2的对治疗性抗肿瘤效果诱导的特别优选的化合物，因为许多肿瘤在化疗周期中耐受肿瘤细胞的数量会增加，在很多情况下使酶GST上调(Chen and Waxman1994，生化药理.47,1079-1087；Pickett andLu 1989，生化综述年报.58,743-764)。与MDM2和GST之间都有相互作用的化合物会由于竞争导致可对MDM2抑制的化合物缺失。此类型化合物如LSM 83177(实施例12的化合物，也称为化合物E)，在本发明中已发现它是独立于其GST状态的肿瘤细胞的潜在致敏剂(实施例15)。LSM 83177的化学结构是
另外，低或无GST抑制活性是治疗有效的MDM2拮抗剂所期望的性质，因为毒副作用如利尿，高血糖，高血钙可能与GST的抑制有关(O’Dwyer等.1991，癌症研究.51,6059-6065；Oakley等.1997，生化36,576-585)。
下面实施例12-15证明本发明化合物的生物活性是如何测定的。
本发明化合物可在0.01mg-0.4g每公斤体重每天的剂量范围内给药。获得最佳效果的优选剂量方案是使用约1mg-约50mg每公斤体重每天，使用单位剂量达到使体重约70Kg的患者在24小时内服用约70mg-约3.5g活性化合物。这种剂量方案可调整以获得最佳的治疗效果。例如，给药剂量应考虑患者的治疗状况。活性化合物可通过口服，静脉内，肌肉内或皮下给药。
本发明的药物组合物含有治疗有效量的至少一种本发明化合物及药学上相容的赋形剂。
口服的组合物一般包括惰性稀释剂或可食载体。它们可封入明胶胶囊或压成片。其它的口服给药形式有胶囊，药丸，酏剂，悬浮液或糖浆。
片剂，药丸，胶囊和类似的组合物可含有下列组分(除了活性成分之外)粘合剂如微晶纤维素，西黄蓍胶或明胶；赋形剂如淀粉或乳糖；崩解剂如海藻酸，淀粉羟乙酸钠(primogel)，玉米淀粉等；润滑剂如硬脂酸镁；液化剂如胶体二氧化硅；甜味剂如蔗糖或糖精或调味剂如薄荷香料，水杨酸甲酯或橘子味香料。当组合物选择为胶囊形式，它还可含有液体载体如脂肪油。在其它的组合物中可含有不同的材料以改变其物理形式，例如包衣剂(用于片剂和药丸)如糖或虫胶。用于制备组合物的材料应是在所用剂量为药学纯且无毒的。
为了制备肠道外给药的药物组合物，可将活性组分包括在溶液或悬浮液中，其中还可含有下列组分无菌稀释剂如注射用水，盐水溶液，油，聚乙二醇，甘油，丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苄基醇；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；络合剂如亚乙基二氨基四乙酸；缓冲剂如乙酸盐，柠檬酸盐或磷酸盐和调节溶液张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。肠道外给药的制剂可装入安瓿，单剂量注射器，玻璃或塑料小瓶中。
本发明的另一目的是提供含有至少一个本发明化合物及药学上合适的赋形剂的药物组合物。
化学实施例部分下面通过制备和实施例进一步举例说明本发明。
在查耳酮环上位置编号如下
制备14’-羟基-3-氯查耳酮向1.36g 4-羟基苯乙酮在14ml乙醇中的溶液中，于室温加入0.64g氢氧化锂一水合物，再加入6ml乙醇用于帮助搅拌。加入1.17ml3-氯苯甲醛，然后将反应混合物回流7小时。真空蒸除溶剂并将剩余物溶于15ml水。将溶液在0℃冷却并加入15ml 1N的盐酸。分离出黄色固体，搅拌1小时，然后过滤并真空干燥过夜。固体用2.5ml96％乙醇结晶，得到0.41g产物，m.p.163-165℃。1H-NMR in d6-DMSO:6.90ppm(d,2H)；7.4ppm(m,H)；7.6ppm(d,1H)；7.8ppm(m,1H)；8ppm(d,1H)；8.05ppm(m,1H)；8.1ppm(d,2H)；10.45ppm(s,1H).制备23’,4’-二氯-4-羟基查耳酮向4-羟基苯甲醛(1.22g)在20ml乙醇的溶液中于室温加入0.63g氢氧化锂一水合物和1.89g 3,4-二氯苯乙酮，然后回流6小时(4小时后分离出深红色固体)并在室温过夜。滤出固体，母液浓缩至干，然后将剩余物溶于乙酸乙酯和1N盐酸的混合物中。分出有机相，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩至干。剩余物(1.4g)再溶于30ml水，乙酸乙酯和1N盐酸直到达到酸性pH。搅拌30分钟后，分出有机相，用盐水洗涤两次，用硫酸钠干燥并浓缩至干。剩余物用乙酸乙酯(30ml)在回流下结晶，得到0.946g产物为黄色固体，m.p.198-199℃。1H-NMR in d6-DMSO:6.85ppm(d,2H)；7.7-7.9ppm(m,5H)；8.1ppm(dd,1H)；8.4ppm(d,1H)；10.15ppm(s,1H).制备3:3,4-二氯-4’-羟基查耳酮向4-羟基苯苯乙酮(5.45g)在60ml乙醇的溶液中加入3.36g氢氧化锂一水合物和7g 3,4-二氯苯甲醛，然后回流2小时。再加入3g 3,4-二氯苯甲醛并将反应混合物再回流21小时并在室温过夜。过滤回收分离的固体；并再溶于50ml水和50ml 1N盐酸中。将黄色固体分离物搅拌1小时，然后过滤收集并在40℃真空干燥几小时，得到7.3g产物，用乙酸乙酯(90ml)和异丙醇(5ml)的混合物结晶。得到1.3g产物。用硅胶色谱纯化母液并浓缩至干又回收2.4g产品，m.p.190-192℃。1H-NMR in d6-DMSO:6.9ppm(d,2H)；7.65ppm(d,1H)；7.7ppm(d,1H)；7.8ppm(m,1H)；8.05ppm(d,1H)；8.1ppm(d,2H)；8.3ppm(s,1H)；10.4ppm(s,1H).制备4:3,4-二氯-4’-羟基-二氢查耳酮向0.6g 3,4-二氯-4’-羟基查耳酮在10ml乙醇中的溶液和3ml二噁烷中加入0.14g 10％钯炭，然后氢化1小时15分钟。通过硅藻土塞子滤出催化剂并将反应混合物浓缩至干。将此剩余物用乙醚结晶得到0.124g产物，m.p.128-130℃。用硅胶色谱纯化(洗脱剂；石油醚/乙酸乙酯8∶2)母液并浓缩至干又回收0.221g产品。1H-NMR in d6-DMSO:2.9ppm(t,2H)；3.3ppm(t,2H)；6.8ppm(d,2H)；7.25ppm(d,1H)；7.5-7.6ppm(m,2H)；7.9ppm(d,2H)；10.3ppm(s,1H).制备52,3-二氯-4-丁酰苯酚将144g 2,3-二氯茴香醚溶于288ml二硫化碳中并加入92.3g丁酰氯。在搅拌和冰冷却下，滴加入115g三氯化铝，并保持温度低于25℃。将反应混合物在室温保持1小时，然后在45℃加热45分钟。加入280ml正庚烷和115g三氯化铝后，使反应混合物反应过夜，然后蒸除二硫化碳并再滴加入200ml正庚烷。固体分离物在搅拌下于80-90℃加热3小时并在室温过夜。过滤收集固体，然后用86ml浓盐酸和1L水处理。混合物用乙醚萃取3次且有机萃取物倒出并用水和750ml 5％氢氧化钠洗涤。萃取物用浓盐酸处理且油状分离物在冷却下结晶。得到114.7g产物。制备6(2,3-二氯-4-丁酰苯氧)乙腈将45g 2,3-二氯-4-丁酰苯酚与26.7g调色剂和16g氯代乙腈在190ml二甲基亚砜中混合，并将混合物在搅拌下于85℃加热2小时30分钟。将反应混合物用490g冰使之骤冷。用乙醚萃取4次得到油状分离物，有机相用400ml 5％氢氧化钠处理并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥并浓缩至干，得到45.2g油状物，在188℃和0.8mmHg蒸馏，得到40g产物。制备75-[((2.3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]四唑将40g(2,3-二氯-4-丁酰苯氧)乙腈与11.5g叠氮化钠和9.5g氯化铵在294ml二甲基甲酰胺中混合。将反应混合物在搅拌下在120-130℃加热30分钟，然后减压蒸发溶剂(在80℃)。剩余物在搅拌下用1.3L水处理。将油状分离物结晶并过滤收集。得到44g粗产物，用400ml甲醇和200ml水的混合物结晶，得到34.8g产物，m.p.135-137℃。元素分析(％理论值/实际值)C 45.73/45.43；H 3.84/3.73；N17.78/17.32；Cl 22.50/22.56.制备85-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑和5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氢)甲基]-2-甲基四唑将8.53g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]四唑溶于120ml水和480ml丙酮中。加入31.8g碳酸钠，然后滴加入52.8g二甲基硫酸酯并使反应混合物反应20小时。将混合物倒入水中，在90℃减压蒸除有机溶剂。从水相冷却结晶油状分离物。将固体过滤并干燥得到7.93g 1∶1标题四唑的混合物。将固体用1∶1的苯/环己烷混合物重结晶，得到2.55g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑。将滤液浓缩至干且剩余物用环己烷结晶，得到3.5g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-2-甲基四唑。制备94-(氰基甲氧)苯乙酮向4-羟基苯乙酮(0.272g)在DMF(8ml，用分子筛干燥)的溶液中加入2-氯乙腈(0.164ml)接着加入碳酸钾(0.636g)，将所得混合物在60℃加热1小时。
冷却至室温后用水(40ml)稀释，用HCl将溶液调至pH4并用乙酸乙酯萃取。有机层用盐水洗涤一次，用Na2SO4干燥并蒸发至干，得到4-(氰基甲氧)苯乙酮为黑色固体(0.354g)。此材料可直接在下一步使用。1H-NMR(CDCl3):2.58ppm(s,3H)；4.85ppm(s,2H),7.05ppm(m,2H)；8.0ppm(m,2H).制备104-(5-四唑基甲氧)苯乙酮向4-(氰基甲氧)苯乙酮(0.349g)在DMF(5ml；用分子筛干燥)中的溶液加入叠氮化钠(0.165g)和氯化铵(0.107g)，所得混合物在70℃加热2.5小时。
将混合物冷却至0℃并用1N HCl(50ml)处理。在0℃搅拌0.5小时后过滤回收黄色沉淀，并在40℃真空干燥过夜，得到4-(5-四唑基甲氧)苯乙酮(0.32g)为棕色固体。此材料可直接用于下一步。1H-NMR(DMSO-D6):2.45ppm(s,overlapping with DMSO signal)；5.6ppm(s,2H)；7.15ppm(d,2H)；8.0ppm(d,2H)；16.9ppm(br.s,1H).实施例14’-(乙氧羰基甲氧)-3-氯代查耳酮在室温氮气氛围下，向4’-羟基-3-氯查耳酮(1.3g)在24ml无水二甲基甲酰胺中溶液加入1.73g碳酸钾和0.84ml溴代乙酸乙酯。将反应混合物在60℃加热1小时30分钟，然后用100ml水稀释并用乙酸乙酯(3×20ml)萃取。将有机萃取物倒出并用盐水洗涤，有机相用硫酸钠干燥并浓缩至干，得到剩余物(1.83g)用硅胶色谱纯化(洗脱剂∶石油醚/乙酸乙酯7.5∶2.5)，得到0.66g产物，m.p.68-70℃。1H-NMR in CDCl3:1.3ppm(t,3H)；4.3ppm(q,2H)；4.75ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.34ppm(m,2H)；7.5ppm(m,1H)；7.55ppm(d,1H)；7.6ppm(m,1H)；7.7ppm(d,1H)；8.0ppm(d,2H).实施例24’-(羧甲氧)-3-查耳酮在室温向0.345g 4’-(乙氧羰基甲氧)-3-氯代查耳酮在4ml乙醇中的溶液加入4ml水和0.212g碳酸钠，并在室温保持过夜。再加入1.5ml乙醇和1.5ml水并将反应混合物回流1小时，然后冷却至室温同时分离出黄色固体。过滤回收固体，再溶于水/乙酸乙酯中并加入1N盐酸直到达到酸性反应。分离有机相，用盐水洗涤，硫酸钠干燥并浓缩至干，得到0.29g黄色固体，用乙酸乙酯(20ml)结晶得到0.12g产物，m.p.180-181℃。1H-NMR in d6-DMSO:4.9ppm(s,2H)；7.05ppm(d,2H)；7.5ppm(m,2H)；7.7ppm(d,1H)；7.85ppm(m,1H)；8.05ppm(d,m)；8.1ppm(s,1H)；8.2ppm(d,2H)；13.1ppm(s,1H).实施例33’,4’-二氯-4-(乙氧羰基甲氧)查耳酮在室温和氮气氛围下，向3’,4’-二氯-4-羟基查耳酮(0.586g)在9ml无水二甲基甲酰胺中的溶液加入0.69g碳酸钾和0.334g溴代乙酸乙酯。将反应混合物在60℃加热3小时，然后冷却至室温并倒入40ml水和20ml乙酸乙酯的混合物中。将混合物保持搅拌使所有固体溶解，分出有机相，用乙酸乙酯洗涤，硫酸钠干燥并浓缩至干，得到0.737g产物为黄色固体。1H-NMR in d6-DMSO:1.2ppm(t,3H)；4.2ppm(q,2H)；4.9ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.7-8.0ppm(m,5H)；8.15ppm(dd,1H)；8.4ppm(d,1H).实施例43’,4’-二氯-4-(羧甲氧)查耳酮向0.38g 3’,4’-二氯-4-(乙氧羰基甲氧)查耳酮在4ml乙醇中的悬浮液加入4ml水和0.212g碳酸钠并将其回流3小时30分钟。将反应混合物冷却至室温并过滤分离固体，在水和乙酸乙酯之间分配，加入1N盐酸直到酸性pH。分出有机相，用盐水洗涤，硫酸钠干燥并浓缩至干。剩余物用乙酸乙酯(10ml)结晶得到0.158g产物，m.p.203-206℃.1H-NMR in d6-DMSO:4.8ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.7-8.0ppm(m,5H)；8.1ppm(dd,1H)；8.4ppm(d,1H)；13.1ppm(s,1H).实施例53,4-二氯-4’-(乙氧羰基甲氧)二氢查耳酮向3,4-二氯-4’-羟基查耳酮(0.221g)在3.5ml无水二甲基甲酰胺的溶液中加入0.125ml溴代乙酸乙酯和0.26g碳酸钾，然后在60℃加热1小时45分钟。将反应混合物冷却至室温并用20ml水和20ml乙酸乙酯稀释。将混合物用1N盐酸酸化至pH3-4，分离有机相，用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并浓缩至干。得到0.268g产物为黄色油状物。1H-NMR in CDCl3:1.3ppm(t,3H)；3.0ppm(t,2H)；3.2ppm(t,2H)；4.25ppm(q,2H)；4.6ppm(s,2H)；6.9ppm(d,2H)；7.05ppm(dd,1H)；7.3ppm(m,2H)；7.9ppm(d,2H).实施例63,4-二氯-4’-(羧基甲氧)二氢查耳酮向0.268g 3,4-二氯-4’-(乙氧羰基甲氧)二氢查耳酮在3ml乙醇的溶液中，加入3ml水，然后再加入0.15g碳酸钠并在70℃加热2小时。将反应混合物浓缩至干，加入4ml水和2ml 1N盐酸，直到pH2-3。搅拌30分钟后，过滤回收固体，用水在过滤器上洗涤并在50℃真空干燥过夜。得到0.196g产品为白色粉末，m.p.148-150℃。1H-NMR in d6-DMSO:2.9ppm(t,2H)；3.3ppm(t,2H)；4.7ppm(s,2H)；7.0ppm(d,2H)；7.25ppm(dd,1H)；7.6ppm(m,2H)；7.9ppm(d,2H)；13.1ppm(s,1H).实施例75-[((2.3-二氯-4-(2’-亚甲基丁酰)苯氧)甲基]四唑将39.2g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]四唑，4.33g多聚甲醛和11.2g二甲基胺盐酸盐在1ml乙酸中的溶液在80-90℃加热2小时。冷却至室温后，将反应混合物在水和乙醚之间分配。水溶液用碳酸氢钠处理并将固体分离过滤收集。将固体(22g)用220ml水和220ml2N氢氧化钠处理，混合物加热直到完全成为溶液后再加热1小时。将水相酸化并用乙醚萃取。将有机萃取物倒出，用硫酸镁干燥并浓缩至干。剩余物(7.66g)用70ml苯结晶，得到5.3g产物。元素分析(％理论值/实际值)C 47.72/47.01；H 3.70/3.52；N17.13/16.78；Cl 21.67/21.43。实施例85-[((2,3-二氯-4-(2’-亚甲基丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑将9.5g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-1-甲基四唑，1.01g多聚甲醛和2.53g二甲基胺盐酸盐在5滴乙酸中的溶液在80-90℃加热2小时。将混合物浓缩至干并倒入100ml水，加入200ml碳酸氢钠溶液并将混合物连续搅拌4小时直到固体分离。过滤固体得到6.3g粗产物，用130ml 1∶1的苯/环己烷混合物重结晶，得到5.58g产物，m.p.124-125℃。元素分析(％理论值/实际值)C 49.28/49.69；H 4.14/4.33；N16.42/16.41；Cl 20.79/20.53。实施例95-[((2,3-二氯-4-(2’-亚甲基丁酰)苯氧)甲基]-2-甲基四唑将8g 5-[((2,3-二氯-4-丁酰)苯氧)甲基]-2-甲基四唑，0.89g多聚甲醛和2.29g二甲基胺盐酸盐在4滴乙酸中的溶液在80-90℃加热2小时。过滤收集固体。滤液用碳酸氢钠溶液处理并用水浴加热。过滤收集形成的固体，得到7.76g剩余物，用400ml环己烷结晶，得到4.16g产物。元素分析(％理论值/实际值)C 49.28/49.11；H 4.14/4.55；N16.42/16.13；Cl 20.79/20.54。实施例102-(4-(2-(3-(4-氯苯甲酰)丙烯酰氨基)乙基)苯氧)-2-甲基丙酸乙酯(化合物D)向10.3g β-(4-氯苯甲酰)丙烯酸溶于100ml四氢呋喃的溶液中，加入7.02ml三乙胺并冷却至-15℃。滴加入5.25ml氯代甲酸乙酯并使反应混合物连续搅拌15分钟。向反应混合物中滴加入12.6g 2-(4-(2-氨基乙基)苯氧)-2-甲基丙酸乙酯在20ml四氢呋喃中的溶液，在-15℃保持30分钟，在0℃保持2小时30分钟并在室温保存过夜。将混合物浓缩至干再溶于乙醚。有机相用2N盐酸，然后是2N氢氧化钠，最后是水洗涤，然后用硫酸钠干燥并浓缩至干。剩余物用少量乙醚结晶后得到10g产物，m.p.76-77℃。元素分析(％理论值/实际值)C 64.94/64.77；H 5.90/5.59；N3.15/3.14；Cl 7.98/8.12。实施例112-(4-(2-(3-(4-氯苯甲酰)丙烯酰氨基)乙基)苯氧)-2-甲基丙酸将20g 2-(4-(2-(3-(4-氯苯甲酰)丙烯酰氨基)乙基)苯氧)-2-甲基丙酸乙酯溶于70ml甲醇中并加入100ml 1N氢氧化钾溶液。连续搅拌3小时并在45℃加热。冷却至室温后，将混合物浓缩至干，再溶于乙醚中并用1N盐酸处理。分离有机相，用硫酸钠干燥并浓缩至干，得到8g产物为棕色无定形固体。实施例123,4-二氯-4’-(羧基甲氧)查耳酮(化合物E或LSM83177)
在室温氮气氛围下，向3,4-二氯-4’-羟基查耳酮(0.586g)(制备3)在9ml无水二甲基甲酰胺中的溶液加入0.69g碳酸钾和0.334g溴代乙酸乙酯。将反应混合物在60℃加热3小时，然后冷却至室温并倒入40ml水和20ml乙酸乙酯的混合物中。将混合物连续搅拌直到所有固体溶解，然后分离有机相，用乙酸乙酯洗涤，硫酸钠干燥并浓缩至干，得到3,4-二氯-4’-(乙氧羰基甲氧)查耳酮。按照实施例4的类似方法，将3,4-二氯-4’--(乙氧羰基甲氧)查耳酮皂化得到3,4-二氯-4’-(羧基甲氧)查耳酮。实施例12A3,4-二氯-4’-(5-四唑基甲氧)查耳酮(化合物F)在氮气氛围下，向搅拌着的4-(4-四唑基甲氧)苯乙酮(0.15g)在乙醇(2ml)中的悬浮液中加入氢氧化锂水合物(0.059g)，再加入3,4-二氯苯甲醛(0.123g)。将所得混合物加热回流2小时。冷却至室温，过滤收集沉淀并再悬浮于水(2ml)中。用1N HCl处理将悬浮液调至酸性pH并搅拌2小时。过滤分离固体并用MeOH重结晶，得到3,4-二氯-4’-(四唑基甲氧)查耳酮为黄色粉末(117mg)。m.p.＞230℃1H-NMR(DMSO-D6):5.45ppm(s,2H)；7.25ppm(d,2H)；7.65ppm(d,1H)；7.78ppm(m,1H)；7.88ppm(m,1H),8.10ppm(d,1H),8.20ppm(d,2H)；8.35ppm(m,1H).生物试验部分实施例13MDM2的制备将从PCR获得的编码人MDM2氨基酸1-118的DNA片断在适合于在E.coli中表达的T5启动子和pUBS 520阻抑蛋白(Brinkmann等.，1989，基因，85,109-114)的控制下插入一修饰的质粒载体(pQE40；QIAGEN Inc.,Chatsworth CA,USA)。BL21细胞(E.coli)在LB介质37℃中生长，并加入1mM IPTG用于诱导表达，允许其生长＞15小时用于积累MDM2蛋白。收集细胞，用French Press破坏并用标准方案制备不溶的MDM2蛋白。将MDM2包涵体增溶并重折叠于100mM Tris,pH7；1mM EDTA；10mM DTT(按照Rudolph等.1997，蛋白功能A practical approach,2nd ed.,IRL Press,57-99)。一般所制备MDM2制剂＞80％纯度的适于化合物的相互作用分析。用标准色谱过程(疏水相互作用色谱)进行进一步纯化。得到更长的MDM2片断1-213aa并用上述类似方法纯化。实施例14MDM2和p53之间相互作用的BIACORE分析为了量化所选化合物在p53上结合MDM2蛋白的性质，需使用BIACORE 2000的生物传感器测定方法。BIACORE 2000是由BIACORE AB提供的生物传感器系统。此生物传感器的技术是基于表面胞质基因组共振(SRP)的光现象，检测接近于传感器晶片表面的溶液的折射率的变化。折射率与此层中的质量浓度直接相关且当分析物与表面固定化配体结合时增加。SPR应答在共振单元(RU)中表达并按照时间连续记录得到传感图。当一个相互作用完成后，可使用能除去结合分析物且不影像结合配体活性的溶液再生表面。将相应于野生型人p53的氨基酸19-32且从GenosysBiotechnologies(Cambridge)获得的N-末端生物素化的肽(5μM在PBST缓冲液中)以5μl/分钟的流速在SA-传感器晶片(传感器晶片用链霉亲和素预先固定化，BIACORE A)上捕捉6分钟。将40μl MDM2 1-213(100nM在PBST)与40μl样品(40μM在含有2％DMSO的PBST中)混合。在10℃保温15分钟后，将30μl混合物以10μl/分钟流速注射到传感器晶片上。表面用PBST缓冲液清洗4分钟后，可计算样品的抑制效果。用100mM HCl和100mM H3PO4清洗再生传感器表面。
图1显示所选混合物在MDM2与p53衍生肽作为相关单元之间相互作用的抑制效果。实施例15GST活性的分光光度分析将人细胞系如人克隆癌细胞系HT29在添加了抗菌素的MDEM,5％CO2中和37℃的条件单层生长并加入胎牛血清，一周传代2次。在胞质中的GST活性按照Habig等(Habig,W.H.,Pabst,M.J.&Jakoby,W.B.，生化杂志249,7130-7139,1974)的方法测定，使用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和谷胱甘肽。GST催化的CDNB与谷胱甘肽的结合导致CDNB-谷胱甘肽产物在340nm具有很强的摩尔吸收。探测吸收变化5分钟。
收集1×106个细胞并用冰冷却的磷酸盐缓冲的盐水在1000rpm在4℃洗涤1次10分钟。将细胞粒再悬浮与200μl冰冷却的磷酸盐缓冲的盐水中，在冰上超声2分钟。将超声物(sonicate)在Eppendorf离心机11750g,4℃离心15分钟，上清液用于分析GST活性。利尿酸(EA)固有的抑制效果和选择的MDM2拮抗剂对HT29胞质GST活性的检测通过在加入谷胱甘肽之前直接向细胞提取物加入药物进行。表1显示了EA和LSM 83177在HT29细胞提取物中对GST活性的抑制效果。实施例16MDM2拮抗化合物的辐射增敏活性的生物分析含有野生型p53和低水平GST的人肿瘤细胞系，如MCF7(乳腺癌)或含有p53突变体和高GST含量的，如MCF7 ADR(抗阿霉素乳腺癌)在RPMI介质中培养，添加胎牛血清至半铺满状态。
为了检测所选化合物对这些细胞的辐射增敏活性，在室温，以低毒剂量2Gy(戈J/Kg)且带有137铯源测定。带有2Gy的单层细胞在指数生长阶段照射后，细胞与不同浓度的所选化合物一起孵化2-6小时。将细胞用胰蛋白酶消化并接种于在6孔板的适当的稀释液中。12-13天后使存活细胞接受胰蛋白酶作用并用锥虫蓝对活/死细胞染色测定细胞数目。按照Khjl等.,1996,Int.J.Rad.Oncol.Biol.Phys.34,375-380建立方案。表2显示了所选化合物对具有低或高GST含量的MCF-7细胞系的不同的辐射增敏活性。
在MCF-7细胞中，两个化合物，利尿酸和LSM 83177都可观察到辐射增敏作用通过药物增强辐射，当药物在细胞上孵化2小时时因数为1.5，当孵化6小时时，因数为2。
权利要求
1.使用通式(Ⅰ)化合物，其立体异构体或其药学上可接受的酸或碱，制备具有MDM2拮抗活性的药物
其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基团可在邻、间、对位；-A选自-COOH,-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基团
其中R’是氢或(C1-C4)烷基；或基团A-(CH2)p-C(R1)(R2)-选自苯基，苄基或(吲哚基)甲基，它可被R4基团取代；-p是0,1或2；-R1和R2分别选自氢或(C1-C8)烷基，或它们与相连的碳原子一起形成一(C3-C7)环烷基；-R4是0至2个取代基，分别选自氯，溴，碘，氟，直链或支链(C1-C8)烷基，羟基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基；或下式基团
在通式(Ⅰ)中是萘基，它可被R4取代；-n是1-4的整数；-m是0或1；-B选自直链或支链C1-C10烷基，-CO-C(R3)=CH-R,-CH=C(R3)-CO-Ar,-CO-CH(R3)-CH2-R或当m为0时，是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6，或当m为1时是-CH=C(R3)-CO-Ar；-R选自氢，-Ar或-CO-Ar；-R3是氢或(C1-C8)烷基；-R5和R6分别是(C1-C4)烷基或与它们相连的氮原子一起形成哌啶子基，哌嗪子基，(C1-C8)烷基哌嗪子基，吗啉代或硫代吗啉代基团；-Ar是苯基，它可以是未取代的或被1至3个分别选自氯，溴，碘，氟，直链或支链(C1-C8)烷基，羟基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基的取代基取代。
2.权利要求1的用途，用于治疗肿瘤。
3.权利要求2的用途，所治疗的肿瘤是肉瘤。
4.通式(Ⅰ)化合物，其立体异构体或其药学上可接受的酸或碱
其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基团可在邻、间、对位；-A选自-COOH,-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基团
其中R’是氢或(C1-C4)烷基；或基团A-(CH2)p-C(R1)(R2)-选自苯基，苄基或(吲哚基)甲基，它可被R4基团取代；-p是0,1或2；-R1和R2分别选自氢或(C1-C8)烷基，或它们与相连的碳原子一起形成一(C3-C7)环烷基；-R4是0至2个取代基，分别选自氯，溴，碘，氟，直链或支链(C1-C8)烷基，羟基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基；或下式基团
在通式(Ⅰ)中是萘基，它可被R4取代；-n是1-4的整数；-m是0或1；-B选自直链或支链C1-C10烷基，-CO-C(R3)=CH-R,-CH=C(R3)-CO-Ar,-CO-CH(R3)-CH2-R或当m为0时，是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6，或当m为1时是-CH=C(R3)-CO-Ar；-R选自氢，-Ar或-CO-Ar；-R3是氢或(C1-C8)烷基；-R5和R6分别是(C1-C4)烷基或与它们相连的氮原子一起形成哌啶子基，哌嗪子基，(C1-C8)烷基哌嗪子基，吗啉代或硫代吗啉代基团；-Ar是苯基，它可以是未取代的或被1至3个分别选自氯，溴，碘，氟，直链或支链(C1-C8)烷基，羟基，(C1-C4)烷氧基，(C1-C4)酰基的取代基取代，条件是，当m是0时，A选自-COO-(C1-C4)烷基，-CN或下式基团
其中R’是氢或(C1-C4)烷基；和当m是0时，A是-COO-(C1-C4)烷基，B只能是-CO-CH(R3)-CH2-NR5R6。
5.按照权利要求4的化合物，其中m是0,R是氢且A是四唑基。
6.按照权利要求4的化合物，其中Ar是被1-2个氯原子取代的苯基。
7.按照权利要求4-6的任一化合物，其中R4是1-2个氯原子。
8.按照权利要求4-7的任一化合物，其中-O-C(R1)(R2)-(CH2)p-A基团在对位。
9.下列任一通式化合物
和
10.药物组合物，含有至少一种权利要求4-9的任一化合物及药学上合适的赋形剂。
全文摘要
本发明涉及使用通式(Ⅰ)的苯氧乙酸和苯氧甲基四唑衍生物,其立体异构体或其药学上可接受的酸或碱,制备具有MDM2拮抗活性的药物,式中各基团定义详见说明书。
文档编号A61K31/192GK1232028SQ99104509
公开日1999年10月20日 申请日期1999年3月30日 优先权日1998年3月30日
发明者R·迪多米尼可, S·汉森, B·卡路萨, E·门特, R·舒马彻 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司